СПОСОБ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЗАДЕРЖКИ НАЧАЛА БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА Российский патент 2001 года по МПК A61K31/575 

Данное изобретение относится к области изучения болезни Альцгеймера и к способам ее профилактики и задержки ее начала.

Предпосылки изобретения
Болезнь Альцгеймера ("БА") представляет собой неуклонно прогрессирующее расстройство, приводящее к деменции. Ее главным отличительным патологическим признаком является развитие изменений цитоскелета в некоторых восприимчивых нейронах. Данные изменения не происходят неизбежно в процессе старения, но если заболевание началось, то спонтанное выздоровление или ремиссии не наблюдаются.

Первоначальные изменения коры головного мозга, описанные далее ниже, развиваются в слабо миелинизированной трансэнторинальной области медиальной височной доли. Затем деструктивный процесс развивается по прогнозируемому типу по мере его распространения на другие области коры головного мозга. Локализация образующих сплетение нейронов и тяжесть изменений позволяют дифференцировать шесть стадий в прогрессировании заболевания от I-II стадий, которые клинически не проявляются, до V-VI стадий, которые обозначают полное развитие БА. У относительно небольшого числа пациентов проявляются особенно ранние изменения, указывающие на то, что пожилой возраст не является необходимым условием развития поражений. Соответственно БА является, таким образом, связанным с возрастом, но не зависимым от возраста заболеванием.

Относительно причины и механизма развития БА в настоящее время существует ряд теорий, многие из которых связаны с генетическими дефектами. У очень небольшого процента пациентов с БА имеется дефект по 21 хромосоме, относящейся к гену, ответственному за выработку белка-предшественника амилоида ("АРР"). АРР представляет собой крупный белок, участвующий в росте и репарации клеток, который при расщеплении на мелкий неперевариваемый белок бета-амилоид ("B-A") может накапливаться в бляшках внутри головного мозга.

Дальнейшие интересные исследования были сосредоточены на связи между поздно начинающейся семейной БА и полимерным геном в хромосоме 19, кодирующей аполипопротеид-E ("апо-E"), белок с молекулярной массой 34 000 Да, участвующий в транспорте холестерина и других липидов внутрь клеток и из них по всему организму. Апо-E играет принципиальную роль в транспорте и метаболизме липидов, и она обсуждена далее ниже. Нейробиологическая роль апо-E была выявлена в результате ряда наблюдений в течение многих лет. Во-первых, мРНК апо-E в большом количестве присутствует в головном мозге, где она синтезируется и секретируется в первую очередь астроцитами (Elshourbagy et al., 1985). Во-вторых, апо-E, содержащий липопротеид, обнаруживается в спинномозговой жидкости и, как оказывается, играет важную роль в транспорте липидов в центральной нервной системе (Pitas et al., 1987). В-третьих, апо-E в сочетании с источником холестерина способствует выраженному удлинению аксонов нервных клеток в клетках ганглия дорсального корешка в культуре (Handelmann et al., 1992). В-четвертых, содержание апо-E резко возрастает после повреждения периферического нерва (Muller et al., 1985). Соответственно, как оказывается, апо-E участвует и в утилизации липидов, генерируемых после распада аксона, и в перераспределении этих липидов в прорастающие аксоны при регенерации и позднее в Шванновские клетки при ремиелинизации новых аксонов (Boyles et al., 1989).

Подразумеваемая роль апо-E, существующего в трех различных изоформах, кодируемых тремя отдельными аллелями (E-2, E-3, E-4), которые наследуются по кодоминантному типу в одном генетическом локусе, в патогенезе БА, исходит, в частности, из связи апо-E с двумя характерными для БА патоневрологическими поражениями в виде внеклеточных аксонных бляшек (представляющих отложения B-A) и внутриклеточных нейрофибриллярных сплетений (представляющих нити связанного с микротрубочками белка, названного "tau"). Обзор представлен в работе Weisgraber et al., 1994).

В частности, была обнаружена генетическая связь между изоформой апо-E4 и БА. E4-гомозиготные лица проявляют более высокий риск развития БА, чем E4-гетерозиготные лица, которые в свою очередь проявляют более высокий риск, чем лица с отсутствием аллели E4. Хотя точный механизм, посредством которого функционирует корреляция, остается неясным, исследователи представили несколько возможных ответов. Он может включать биологический эффект белка, кодируемого этой аллелью, аналогично тому, как снижение авидности связывания апо-E2 с рецептором LDL приводит к увеличению содержания холестерина в плазме у E2-гомозигот. Strittmatter et al. (1993) показали, что апо-E4 более эффективно связывается с пептидом B-A, приводя к усиленному образованию сенильных бляшек, в сравнении с двумя другими изоформами, и исходя из этого предположили, что к повышенной предрасположенности к БА ведет не присутствие апо-E4, а отсутствие других изоформ апо-E (Strittmatter et al., 1994a).

Аналогичным образом, что касается изоформоспецифичного взаимодействия апо-E с белком "tau", фосфорилированные формы которого являются основными составляющими нейрофибриллярных сплетений, было показано, что апо-E3, но не E4, с высокой авидностью связывается с "tau" (Strittmatter et al., 1994a). Этот дифференцированный эффект привел к возникновению гипотезы, что апо-E3 обычно позволяет белку "tau" стабилизировать микротрубочки и что снижение содержания или отсутствие его у пациентов с одной или двумя аллелями апо-E4 приводит к диссоциации "tau" и микротрубочек и его усиленному фосфорилированию и полимеризации в патологические спаренные спиральные филаменты (Strittmatter et al., 1994b).

Несмотря на многочисленные исследования в области развития БА, способов ее лечения мало, а способы профилактики и/или задержки начала этого инвалидизирующего заболевания фактически отсутствуют.

Задачей настоящего изобретения является устранение или уменьшение указанных выше недостатков.

Сущность изобретения
Настоящее изобретение представляет способ профилактики и/или задержки начала болезни Альцгеймера ("БА") у животных, который включает введение животному фитостериновой композиции.

Кроме того, настоящее изобретение представляет композиции, которые эффективны в профилактике или задержке начала БА, которые включают бета-ситостерин, кампестерин и стигмастанол.

Краткое описание чертежей
Настоящее изобретение иллюстрируется следующими не ограничивающими чертежами, в которых:
фиг. 1 представляет собой график, на котором показаны результаты исследования в водном лабиринте Morris, выраженные в виде времени (%), проведенного в каждом квадранте, когда платформа была в квадранте 1;
фиг. 2 представляет собой график, на котором показаны результаты исследования в водном лабиринте Morris, выраженные в виде времени (%), проведенного в каждом квадранте, когда платформа была удалена из квадранта 1;
фиг. 3 представляет собой график, на котором показаны результаты исследования в водном лабиринте Morris, выраженные в виде времени (%), проведенного в каждом квадранте, когда платформа была в квадранте 3; и
фиг. 4 представляет собой график, на котором показаны результаты исследования в водном лабиринте Morris, выраженные в виде времени (%), проведенного в каждом квадранте, когда платформа была удалена из квадранта 3.

Предпочтительные осуществления изобретения
Фитостерины представляют собой стериноподобные соединения, синтезируемые в растениях и не имеющие непосредственной питательной ценности для людей. В растениях они необходимы для функционирования клеток так же, как холестерин необходим для людей. Средний западный рацион содержит до 360 мг фитостеринов в сутки. Недавно эти диетические растительные стерины привлекли к себе большое внимание ввиду их возможных противораковых свойств и их способности снижать содержание холестерина при скармливании ряду видов млекопитающих, включая людей. До настоящего времени никогда не предлагалось или не исследовалось использование стеринов растений в предотвращении и задержке начала (лечения) БА.

По химической структуре фитостерины сильно напоминают холестерин. Основными фитостеринами являются бета-ситостерин, кампестерин и стигмастерин. Другие фитостерины включают стигмастанол (бета-ситстанол), десмостерин, халинастерин, пориферастерин, клионастерин и брассикастерин. Композиция настоящего изобретения включает все природные и синтетические формы фитостеринов, все гидрированные аналоги, т.е. станолы, и все их производные, включая изомеры.

Хотя фитостерины доступны в растительных маслах и овощах, они не обязательно содержатся в существенных достаточных концентрациях или в форме, необходимой для обеспечения преимуществ настоящего изобретения. В объем притязаний настоящего изобретения включен способ профилактики и/или задержки начала БА с помощью введения животным, в частности, людям, фитостериновой композиции. Как требуется и описано здесь ниже, эта композиция может быть включена непосредственно в пищевые добавки, масла, витамины и терапевтические композиции.

Предполагается, что фитостериновые композиции настоящего изобретения могут смешиваться с обычными пищевыми продуктами для широкомасштабного распределения среди населения, независимо от генетической предрасположенности к развитию БА. Альтернативно, эти композиции могут избирательно вводиться по более интенсивной программе, нацеленной на тех лиц, у которых имеется риск развития определенных форм БА, т.е. семейной БА. В предпочтительной форме композиции смешиваются с растительным маслом, выбранным из группы, включающей масло сафлора красильного, кунжутное масло, кукурузное масло, масло рисовых отрубей, оливковое масло и рапсовое масло. Наиболее предпочтительна добавка на основе оливкового масла, поскольку это масло широко используется и содержит мало фитостеринов и полиненасыщенных жирных кислот. Альтернативно, композиции могут включаться в продукты на основе насыщенного жира (свиное сало) или добавляемых в тесто жиров, таких как сливочное масло или маргарин.

В другом осуществлении композиции могут включаться в композиции с другими обычными или травяными продуктами для профилактики или лечения БА. Эти продукты включают ингибиторы холинестеразы, такие как Aricept^TM, рисперидон (препарат для лечения шизофрении, у которого в настоящее время обнаружен эффект при устранении агрессии, связанной с БА), и возможные укрепляющие память травяные препараты, такие как гинкго, но не ограничиваются ими.

Основой настоящего изобретения является применение фитостеринов в основном для профилактики и/или задержки начала БА. Хотя ниже приведен перечень предпочтительных композиций для достижения данного результата, их ни в коей мере не следует трактовать как ограничивающие широкий объем притязаний настоящего изобретения, поскольку такие же положительные результаты могут быть достигнуты при использовании многих фитостеринов по отдельности или в различных комбинациях.

Предпочтительные фитостериновые композиции по настоящей заявке включают бета-ситостерин, кампестерин, стигмастанол (ситостанол) и, необязательно, кампестанол и их аналоги/производные. В одном осуществлении композиция по настоящему изобретению включает, по меньшей мере, 10% кампестерина и не более чем 75% бета-ситостерина. В другой предпочтительной форме композиция включает от 10 до 25% кампестерина, от 10 до 40% стигмастанола и от 45 до 75% бета-ситостерина. Необязательно может присутствовать от 1 до 10%, более предпочтительно 3% кампестанола.

В другой предпочтительной форме композиции по настоящему изобретению включают следующее соотношение фитостеринов: бета-ситостерин (1); кампестерин (0,2-0,4) и стигмастанол (0,2-0,5). Более предпочтительно, кампестерин и стигмастанол вместе составляют, по меньшей мере, 50% общей концентрации бета-ситостерина. Композиции по настоящему изобретению включают соотношения трех ключевых растительных стеринов, приведенные в табл. 1.

Было установлено, что другие предпочтительные композиции имеют распределения (в %) растительных стеринов, приведенные в табл. 2.

Однако следует понимать, что в любой из данных предпочтительных композиций могут присутствовать и другие растительные стерины. Аналогичным образом, при необходимости, часть композиции могут составлять адъюванты или носители. В зависимости от способа доставки композиций по настоящему изобретению дозировка может несколько изменяться. Наиболее предпочтительно, чтобы ежесуточно вводилось приблизительно от 1,0 до 3,0 г.

В способе по настоящему изобретению проводят профилактику БА и/или задерживают ее начало с помощью введения индивидууму фитостериновых композиций, подробно описанных выше. Точный механизм, посредством которого с помощью введения фитостерина с пищей усиливаются способность к обучению и память, снижается зависимое от возраста сокращение количества синапсов и замедляются нейродегенеративные процессы, неясен, хотя у заявителей есть несколько теорий, которые более подробно описаны ниже. Эти теории не имеют намерения ограничить объем притязаний настоящего изобретения, а напротив, служат для иллюстрации сложности роли фитостеринов в липидном гомеостазе животных.

Как обсуждалось выше в предпосылках изобретения, было показано, что фенотип апо-E4 у людей представляет важный фактор риска при БА. Имеются также некоторые доказательства, показывающие связь между БА и сердечно-сосудистыми заболеваниями (Kalaria, 1997). Обзор функции апо-E представлен ниже наряду с информацией, связывающей апо-E с настоящим изобретением, с точки зрения понимания предложенных механизмов действия фитостеринов.

Апо-E
Апо-E представляет собой всего лишь одну из переносчиков липидов, именуемых аполипопротеидами. Эти белки имеют три основных функции. Во-первых, они помогают солюбилизировать высоко гидрофобные холестерин и триглицериды путем взаимодействия с фосфолипидами (ядром комплекса является липид, наружная оболочка представляет собой аполипопротеид) для обеспечения возможности транспорта этих липидов. Во-вторых, аполипопротеиды регулируют реакцию липидов с ферментами, такими как липопротеидлипаза и лецитинхолестеринацилтрансфераза. В-третьих, аполипопротеиды связываются с рецепторами косточной поверхности и, таким образом, определяют сайты захвата и скорость распада других ингредиентов липопротеидов, в частности холестерина.

Апо-E уникален среди липопротеидов в том, что он обладает специфическим сродством с нервной тканью. Во время развития или после повреждения периферической нервной системы апо-E координирует мобилизацию и перераспределение холестерина при восстановлении, росте и поддержании миелиновой оболочки и мембран нейронов (Boyles et al., 1989, supra). Гораздо меньше известно о функции апо-E в центральной нервной системе, что определяет возможность того, что апо-E является маркером БА (обсуждено выше в предпосылках изобретения), еще более интригующим.

Мыши апо-E
В нескольких исследованиях у людей и животных был показан снижающий содержание холестерина эффект растительных стеринов, включая антиатерогенные эффекты фитостериновых композиций у мышей с дефицитом апо-E (Заявка на патент PCT PCT/CA95/00555, опубликованный 4 апреля 1996 г. и включенная сюда в качестве ссылки, и Moghadasian et al., 1996). Позднее было показано, что мыши с дефицитом апо-E являются подходящей экспериментальной моделью для изучения патофизиологии БА. Поскольку у мышей с дефицитом апо-E фитостерины предотвращают атипичное распределение холестерина (кожа, сухожилия, аорта и основные артерии), фитостерины могут играть важную роль в определении тканевого распределения холестерина, даже в клетках головного мозга, независимого от фенотипов апо-E (исследование, проводимое заявителем).

Остатки хиломикронов
Хиломикроны представляют собой самые крупные частицы липопротеида, состоящие главным образом из триглицерида с меньшими количествами фосфолипида, свободного холестерина и эфиров. Они синтезируются в кишечнике или энтероцитах в ответ на жир и холестерин, поступающие с пищей, попадают в лимфу брыжейки и грудного протока, где они соединяются с апо-E. Фермент липопротеидлипаза ("LL") катализирует гидролиз триглицерида хиломикронов, в которых генерированные свободные жирные кислоты поглощаются в первую очередь адипоцитами, а остающиеся более мелкие части липопротеида (которые обогащены холестерином) именуются остатками хиломикронов ("CR"). CR быстро выводятся из плазмы с помощью избирательного зависимого от апо-E печени механизма (рецептор, относящийся к липопротеиду низкой плотности, рецептор "LRP"), где холестерин или используется в биосинтезе мембраны или липопротеида, или выделяется в виде свободного холестерина или метаболизируется в желчные кислоты. Присутствие апо-E считается ключевым для частиц, которые должны интернализироваться. Клетки печени и головного мозга особенно богаты этим рецептором LRP.

Липопротеиды очень низкой плотности
Липопротеид очень низкой плотности ("VLDL") аналогичен по структуре хиломикронам, но меньше и содержит меньше триглицерида, но относительно больше холестерина, фисфолипида и белка (смесь апо-E, апо-C и апо-B100). VLDL синтезируется главным образом в печени, и его главной функцией является перенос триглицеридов. Частицы VLDL варьируют по размеру, но последующий липолиз под воздействием или LL, или печеночной липазы ("HL") дает еще меньшие частицы: остатки VLDL (известные также как липопротеид промежуточной плотности) и липопротеиды низкой плотности ("LDL").

Липопротеидлипазы
Существует, по меньшей мере, две различных триглицеридлипазы. Внепеченочная или липротеидлипаза ("LL") обнаруживается главным образом в жировой ткани и скелетной мускулатуре. Печеночная липаза ("HL") расположена на эндотелии печеночных клеток. И LL, и HL участвуют в катаболизме CR и VLDL.

Рецепторы апо-E
Имеется четыре известных рецептора, участвующих в транспорте апо-E/липопротеида (хиломикрона, VLDL или LDL) в клетки из плазмы: рецептор липопротеида низкой плотности ("рецептор LDL"), рецептор LRP (определенный выше), вновь описанный рецептор липопротеида очень низкой плотности ("рецептор VLDL") и рецептор эпителиального гликопротеида 330 ("рецептор GP330"). Все четыре рецептора обнаруживаются в головном мозге. Открытие того, что рецептор для активированной формы альфа2-макроглобулина ("альфа2/M") идентичен рецептору LRP, является доказательством того, что рецептор LRP является многофакторным рецепторным белком, называемым рецептором альфа 2M/LRP. Этот рецептор экспрессирован почти в каждой клетке организма, особенно в печени и головном мозге, целевых ферментах, белках, CR и холестерине LDL и, как представляется, играет сложную роль в протеолизе, иммунитете, клеточной пролиферации и гибели клеток.

С точки зрения транспорта апо-E в нейронные клетки было обнаружено не только то, что нейроны очень богаты поверхностными рецепторами LRP и что иммунореактивность рецепторов LRP была выше в бляшках при БА (Rebeck et al., 1993), но и что комплексы апо-E/LRP также локализуются в бляшках в мозге человека (Ikeda et al., неопубликованные данные). LRP не только связывает остатки, содержащие апо-E, но также взаимодействует с важными ферментами метаболизма хиломикрона, такими как LL. Это последнее из упомянутых связывание независимо от апо-E (Beisiegel et al., 1991). Заслуживает внимания способность фитостеринов предотвращать развитие образования атеросклеротической бляшки у мышей с дефицитом апо-E.

Внутри печени CR катаболизируются LL или механизмом, зависимым от апо-E, а именно LRP или рецептором альфа2/LRP.

Предлагаемые механизмы влияния фитостеринов на течение БА
Существует три взаимосвязанных главных механизма, посредством которых фитостерины оказывают благоприятный эффект на профилактику и начало БА:
1) фитостерины увеличивают независимый от апо-E клиренс CR в печени посредством печеночного LRP посредством сложного (и еще не полностью постигнутого) механизма, включающего аллостерическую активацию LL и образования комплекса LL с CR; и/или
2) фитостерины уменьшают циркуляцию и/или зависимый от апо-E опосредованный рецепторами захват комплексов апо-E/липопротеид клетками в целом, но клетками головного мозга, в частности; и/или
3) фитостерины уменьшают "слущивание" эндотелиальных клеток и предохраняют функцию эндотелия гематоэнцефалического барьера.

Фитостерины связываются с циркулирующими хиломикронами и липопротеидами и оказывают модифицирующий эффект на эти частицы в плазме и на физико-химические свойства ферментов, таких как LL и HL. Другими словами, заявители предполагают, что фитостерины функционируют как апопротеиды, меняя таким образом структуру, состав и функцию циркулирующих хиломикронов и липопротеидов и, кроме того, косвенно влияют на многие другие ключевые клеточные функции посредством рецептора LRP.

Упрощая, можно сказать, что с точки зрения первого механизма, фитостерины связываются с липопротеидами, т.е. хиломикронами, и предотвращают связывание этих частиц с рецепторами альфа2M/LRP и последующее проникновение данных частиц через клеточный барьер в головной мозг. Соответственно количество апо-E в нейронных клетках было бы снижено, что особенно важно для тех лиц, которые являются апо-E4-гомозиготами.

Кроме того, фитостерины увеличивают активность LL посредством аллостерической модификации так, что обогащенные фитостерином хиломикроны быстро метаболизируются данным ферментом. CR затем быстро удаляются из циркуляционного русла независимыми от апо-E гепатоцитарными рецепторами CR, которые идентичны рецепторам LRP. Как обсуждалось выше, LL представляет собой главный фермент, участвующий в метаболизме триглицерида (хиломикрона и VLRL), имеющий карбоксильный (C) или азотный (N) концы. Его регуляция, структурная и функциональная связь и C-концевой домен липопротеидлипазы (при индукции катаболизма CR посредством рецептора LRP) достаточно хорошо изучены исследователями, и это сосредоточило заявителей на возможности катаболизма липопротеидов, независимого от апо-E.

Считается, что фитостериновые композиции по настоящему изобретению изменяют физико-химические свойства липопротеидов с помощью аллостерической модификации. Следовательно, активность LL под влиянием фитостеринов может более эффективно использовать массу фермента для катаболизма триглицеридов N-концевым каталитическим участком, тогда как C-концевой домен может служить в качестве лиганда для CR. Комплексы C-домен LL-CR с низким поступлением жирных кислот в печень затем интернализируются рецептором, идентичным утилизирующим рецепторам (альфа2M/LRP), и затем катаболизируются печеночной липазой с выраженным дальнейшим распадом эфиром жирных кислот CR.

Другими словами, возможно, что фитостерины усиливают связывание C-концевого лиганда LL с CR, увеличивая посредством этого катаболизм CR. Поскольку эти процессы независимы от апо-E, они не должны привести к стимуляции рецепторов LDL.

С точки зрения третьего, но комплементарного механизма, что фитостерины уменьшают "слущивание" клеток (эндотелиальный эффект), заявители обнаружили, что у нормальных крыс и крыс с гиперхолестеринемией введение с пищей фитостериновой композиции уменьшало "слущивание" эндотелиальных клеток соответственно на 50 и 70%. Это принципиальная находка, учитывая роль эндотелия в гематоэнцефалическом барьере и в прохождении нежелательных повреждающих частиц в мозг, которые могут привести к развитию БА. Кроме того, интегрины, разнообразный класс рецепторов гликопротеидов, участвуют во взаимодействии клетки с внеклеточным матриксом ("ECM"). Нарушение экспрессии интегринов в мозге может быть связано с увеличением субэндотелиального проникновения апо-E. ECM направляет рост, дифференцировку и функцию выстилающего эпителия (Getlenburg et al., 1990).

Более того, заявители считают, что растительные стерины модифицируют мембраны, включая гематоэнцефалический барьер. Соответственно может быть нарушена транспортировка потенциально токсичных веществ, таких как предшественник бета-амилоида, через эту мембрану, что приводит к задержке начала БА.

Кроме того, в головном мозге мышей с дефицитом апо-E развивается окислительный стресс (Mathews et al. , 1996). Это может быть связано с БА. В продолжающемся в настоящее время исследовании заявители показали, что растительные стерины могут обладать антиоксидантной активностью. Соответственно эти стерины могут защитить мозг от окислительного стресса, приводя к задержке начала или даже предотвращению БА.

Ниже приведено резюме возможных механизмов действия фитостеринов.

1) Ферментативный эффект
аллостерическая модификация LL и изменения молекулярной конфигурации липопротеидных комплексов
2) Хиломикроны и CR
стимуляция LL ---> CR, обогащенный LL
ингибирование HL
CR ---> независимый от апо-E захват рецепторами VLDL или LRP с использованием C-конца мономера LL в качестве лиганда связывания и/или интернализации рецепторов. Ингибирование мономером HL захвата CR посредством рецептора LDL
вхождение в гладкую эндоплазматическую сеть гепатоцитов
стимуляция 7-альфа-гидроксилазы ---> увеличение синтеза желчных кислот
увеличение выхода холестерина с желчью, уменьшение содержания холестерина в печени, независимое от метаболизма LDL увеличение активности HMG-CoA, т.е. CR может ингибировать рецептор VLDL или LDL
уменьшенное "слущивание" эндотелиальных клеток
образование более гидрофильных мембран.

Для иллюстрации различных аспектов настоящего изобретения предоставлены следующие не ограничивающие примеры. В частности, исследование показывает, что ускорение развития атеросклероза у мышей с дефицитом апо-E задерживается с помощью введения фитостериновой композиции и имеется улучшение при развитии атеросклеротического поражения. "FCP-3PI" обозначает предпочтительную композицию в пределах диапазона притязаний настоящего изобретения.

Пример 1
Улучшение с помощью FCP-3PI способности к обучению и памяти мышей с дефицитом апо-E
Введение:
Мыши с дефицитом апо-E (апо E-KO) известны в качестве модели атеросклероза, ксантоматоза и болезни Альцгеймера (16-18). Мыши с дефицитом апо-E использовались в качестве полезной системы для изучения значения аполипротеида E в функции головного мозга. Некоторые из данных исследований были сосредоточены на способности к обучению и работе и эталонную память у мышей с дефицитом апо-E (19-20). У этих мышей были снижены плотность синапсов в гиппокампе и регенеративная способность после поражения гиппокампа (21, 22). Авторы изобретения эффективно замедляли/предотвращали первые два из указанных выше расстройств с помощью пищевой добавки в виде фитостериновой смеси FCP-3PI (11, 23). Целью настоящего исследования является оценка эффектов добавления в пищу FCP-3PI в количестве 2% (мас./мас.) в течение 33 нед. на способность к обучению и память мышей с дефицитом апо-E.

Гипотеза
Добавление в пищу FCP-3PI улучшает способность к обучению и память у мышей с дефицитом апо-E.

Материалы и методы
24 самца мышей в возрасте 2 нед. с дефицитом апо-E и 24 аналогичных подобранных мышей дикого типа со вскармливающими их матерями были закуплены в Jackson Laboratory. В возрасте 4 нед. мышей отнимали от груди и делили на 4 группы, подобранные по массе тела и уровню общего холестерина в плазме. Группы в течение 33 нед. кормили следующим рационом.

Группа 1 (n = 10): Мыши с дефицитом апо-E, вскармливаемые обычным кормом для мышей, содержащим 4,5% (мас./мас.) жира (обычный корм, ОК) с добавкой 2% (мас./мас.) FCP-3PI.

Группа 2 (n = 10): Мыши дикого типа, вскармливаемые ОК с добавкой 2% (мас./мас.) FCP/3PI
Группа 3 (n = 10): Мыши с дефицитом апо-E, вскармливаемые ОК
Группа 4 (n = 10): Мыши дикого типа, вскармливаемые ОК
Животных содержали отдельно (каждой мыши давали пустую бутылку с большим отверстием для игры), проводили ежедневное наблюдение для оценки их физической активности и поведения и еженедельно регистрировали массу их тела. В 0, 4, 17 и 29 нед. исследования из хвостовой вены брали кровь и проводили ферментативное определение уровня холестерина в плазме. Через 33 нед. после начала экспериментальной диеты поведение мышей исследовали с помощью методики водного лабиринта Morris, как описано ранее. Процедура записывалась с помощью видеокамеры, и результаты анализировались с помощью компьютеризированных систем. В конце исследования мышей забивали, и их мозг фиксировали в 10% формалине и использовали для гистохимической оценки. Залитые в парафин срезы мозга мышей окрашивали a) гематоксилином и эозином (Г и Э) как стандартным методом окрашивания для гистологического исследования, b) Конго красным для оценки образования амилоидной бляшки, c) по Bielchowsky для оценки аксонов и d) Люксолом быстрым синим для исследования миелина. Более того, в сотрудничестве с университетом г.Майами мозг мышей окрашивали (иммуногистохимически) на потенциальные маркеры нейродегенеративных заболеваний, включая глиальный фибриллярный кислый белок (GFA), белок-предшественник амилоида (APP), нейрофиламент (NF) и убиквитин. Одна мышь из группы 1 и одна мышь из группы 3 были подвергнуты эвтаназии на ранних сроках эксперимента вследствие потери массы тела и сниженного потребления пищи. Для соответствия с другими экспериментальными группами были удалены одна мышь из группы 2 и одна мышь из группы 4. Во время эксперимента одна мышь из группы 1 была забита на 17 нед. вследствие кожных поражений и одна мышь из группы 3 внезапно погибла на 14 нед., вероятно вследствие сердечного заболевания. В течение процесса исследования в водном лабиринте Morris у одной контрольной мыши апо E-KO (# 15 из группы 3) дважды в течение первого дня подготовки наблюдались судорожные припадки.

Результаты
A: Масса тела
Массу тела мышей регистрировали еженедельно. Результаты обобщены в табл. 3. Как видно, в ходе эксперимента все животные прибавили в весе. Это показывает, что среди всех 4 групп мышей рост и развитие были одинаковыми. Добавление FCP-3PI в мышиный корм не влияло на массу тела.

B: Уровень холестерина в плазме
Уровень общего холестерина в плазме определяли в начале и в ходе эксперимента. Результаты обобщены в табл. 4. Добавление FCP-3PI в мышиный корм было связано со значительным снижением концентрации общего холестерина в плазме у мышей апо-E-KO, что согласуется с нашими предшествующими данными. С другой стороны, добавление FCP-3PI в мышиный корм оказывало небольшое влияние на концентрацию общего холестерина в плазме у мышей дикого типа.

C: Анализ исследования в водном лабиринте Morris
Все 4 группы мышей были подвергнуты поведенческому тесту с использованием установленной методики в водном лабиринте Morris. Компьютеризированный анализ данных не выявил значимых различий с точки зрения способности к обучению и памяти среди групп мышей. На фиг. 1-4 обобщены результаты, полученные в каждой группе мышей. На фиг. 1 показан процент времени, которое каждая группа мышей проводила в каждом квадранте бассейна для определения положения платформы. На фиг. 2 показан процент времени, которое каждая группа мышей проводила в каждом квадранте бассейна для поиска платформы после прохождения тренировки. Это показывает пространственную память мышей. В этом отношении мыши дикого типа, вскармливаемые кормом FCP-3PI, проявляют тенденцию иметь лучшую память, чем другие группы животных. Как видно из фиг. 2, мыши дикого типа, получавшие корм FCP-3PI, в поиске платформы проводили больше времени в квадранте 1 (месте, где находилась платформа в периоды тренировки). Это также очевидно на фиг. 3, показывающей несколько лучшее обучение по определению положения платформы (квадрант 3) мышами дикого типа, получившими корм FCP-3PI. На фиг. 4 показано отсутствие различия среди групп мышей, когда их исследовали на предпочтение квадранта 3 (обратный исследуемый путь), что показывает плохую ретенцию среди всех четырех групп мышей.

D: Гистохимия
Проводили гистологическое исследование мозга мышей всех групп. Окрашивание гематоксилином и эозином выявило незначительные дегенеративные изменения в мозге животных всех четырех групп. Окрашивание Конго красным не выявило данных за образование амилоидных бляшек ни в одном мозге животных из всех 4 групп. Аналогичным образом, окрашивание по Bielchowsky и люксолом быстрым синим не выявило никаких значимых различий среди всех 4 групп мышей в отношении характерных признаков миелина и аксона мозга. Предстоит проведение иммуногистохимических оценок независимым невропатологом в St. Paul's Hospital. Результаты будут представлены, как только будет закончена оценка.

Комментарии
Это исследование показало, что добавление FCP-3PI (2% мас./мас.) значительно снижает уровень общего холестерина в плазме у мышей апо E-KO. Эта доза FCP-3PI не оказывает видимого побочного эффекта и хорошо переносится всеми группами животных. Добавление FCP-3PI в рацион мышей дикого типа было связано с улучшением их способности к обучению и их памяти в сравнении с другими группами.

Изобретение относится к области медицины. Сущность изобретения сводится к тому, что композиция для профилактики или задержки начала болезни Альцгеймера включает бета-ситостерол, кампестерол и стигмастанол, дополнительно может включать кампестанол, а способ характеризуется тем, что человеку вводят терапевтически эффективное количество данной фитостерольной композиции. Изобретение обеспечивает улучшение памяти и не оказывает видимого побочного эффекта. 2 с. и 4 з.п.ф-лы, 4 табл., 4 ил.

1. Фитостерольная композиция для профилактики или задержки начала болезни Альцгеймера, включающая терапевтически эффективное количество бета-ситостерола, кампестерола стигмастанола. 2. Композиция по п.1, где кампестерол и стигмастанол составляют вместе, по крайней мере, 50% от концентрации бета-ситостерола. 3. Композиция по п.1, включающая 10 - 25% кампестерола, 10 - 40% стигмастанола и 45 - 75% бета-ситостерола. 4. Композиция по п.1, дополнительно включающая кампестанол. 5. Способ профилактики или задержки начала болезни Альцгеймера у животного, включающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества фитостерольной композиции, охарактеризованной в любом из пп.1 - 4. 6. Способ по п.5, где указанным животным является человек.