СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, НА ОСНОВЕ СОЕДИНЕНИЙ СЕРЕБРА И ЗОЛОТА С ТИАЗИНОМ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2001 года по МПК A61K31/5415 A61P31/12 

Водорастворимое противовирусное лекарственное средство на основе соединения серебра и соединения золота с N,N'-тетраметилтиазином нитратом (метиленовый синий в нитратной форме) при мольном соотношении соответственно 1:1:2 и отвечающее составу: C₃₂H₃₆N₉O₉S₂Cl Ag Au и способ его получения.

Использование. Изобретение относится к водорастворимым противовирусным лекарственным средствам, к области фармацевтической химии и медицины. Изобретение относится также к способу получения этих средств. Изобретение может быть использовано для лечения смешанных вирусно-бактериальных инфекций, включая ВИЧ-инфекцию.

Цель - создание высокоэффективных противовирусных лекарственных препаратов, в особенности для лечения микст-инфекций, включая ВИЧ-инфекцию.

Сущность изобретения. Предложено новое противовирусное средство на основе соединения нитрата серебра и соединения золота с N,N'-тетраметилтиазином нитратом (метиленовый синий в нитратной форме) при мольном соотношении соответственно 1:1:2 и отвечающее составу: C₃₂H₃₆N₉O₉S₂Cl Ag Au (табл. 1a).

Предложен также способ получения нового водорастворимого противовирусного лекарственного средства, заключающийся в том, что синтез осуществляют при температуре 80-95^oC и мольном соотношении N,N'-тетраметилтиазина нитрата, нитрата серебра, соединения золота и этилового спирта 2:1:1:1, при этом в воде сначала растворяют метиленовый синий (N,N'-тетраметилтиазина хлорид), который переводят в нитратную форму добавлением нитрата серебра при мольном соотношении 1: 1, с последующей фильтрацией осадка хлорида серебра, и к отфильтрованному горячему раствору нитрата N,N'-тетраметилтиазина вновь добавляют водный раствор нитрата серебра, затем водный раствор соединения золота в форме треххлористого золота или тригидрата золотохлористоводородной кислоты и этиловый спирт при мольном соотношении 2:1:1:1 и направляют полученный раствор целевого продукта на сушку.

Положительный эффект способа получения нового лекарственного средства, заявляемого нами, по сравнению с прототипами (см. ниже Патент Австрии и Патент Германии) в том, что исключается стадия кристаллизации продукта и не требуется тщательная фильтрация от примеси хлористого серебра, остающейся в небольшом количестве за счет образования коллоидной формы, так как рекомендуемый нами способ применения лекарственного средства не предусматривает внутривенного введения, а рассчитан на применение путем лечебных ректальных клизм (готовая лекарственная форма - порошок во флаконах) или в виде энтеросолюбильных желатиновых капсул.

Изобретение относится к водорастворимым лекарственным средствам с широким спектром противовирусного и антибактериального действия, цитостатической активностью в анаэробных условиях в присутствии НАД-Н (восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида).

Изобретение относится также к способу получения таких лекарственных средств.

Заявленное комплексное решение может найти использование для производства готовых лекарственных форм препаратов широкого медицинского спектра действия, превосходящих in vivo по действию азидотимидин - АЗТ (отечественный препарат тимазид), большинство современных антибиотиков, цитостатиков типа цисплатин и других.

Оба заявляемых объекта - лекарственное средство и способ его получения, объединены общим творческим замыслом, направленным на улучшение технологии получения и воспроизводимости физико- химических свойств как лекарственной субстанции, так и готовых лекарственных форм.

Известны коммерческий препарат под названием Аргохром фирмы Мерк (производившийся в Германии примерно с 1916 по 1945 годы и поступавший по импорту в бывший СССР в довоенный период), состав которого подпадает под действовавший с 1914 г. Патент Австрии N 69476 и называвшийся до 1920 г. по-немецки Silber methylene blau, а также запатентованный в 1922 г. в Германии препарат на основе комплекса HAuCl₄ или AuCl₃ с метиленовым синим, описанным в Патенте Германии N 347376.

Известны также из этих патентов способы получения этих лекарственных средств. Эти патенты нами выбраны как ближайшие аналоги-прототипы нашего нового лекарственного средства и способа его получения.

Известные составы этих лекарственных средств и способы их получения характеризуются тем, что процентное содержание серебра в Аргохроме составляет примерно 20 вес.%, а содержание золота в аналогичном препарате по патенту Германии составляет примерно 30 вес.%, а в заявляемом нами новом лекарственном средстве суммарное весовое содержание этих металлов составляет 27-28 вес.%.

Технология получения нового лекарственного средства отличается простотой химического синтеза, аппаратурной схемы производства, включающей стадию эффективной сушки реакционной массы до порошка, контроль за процессом химического синтеза методом редоксметрии по ионам Cl^-, NO₃ ^-, Ag⁺.

Известный способ получения комплекса AgNO₃ с метиленовым синим реализуется следующими технологическими операциями.

1. Растворение в теплой воде метиленовой сини (хлорид) до концентрации 9-10 вес. % и добавление водного раствора AgNO₃ с концентрацией 20-25 вес.% при мольном соотношении реагентов метиленовый синий: AgNO₃ = 1:1.

2. Фильтрация полученного теплого раствора и отделение осадка AgCl.

3. Нагревание полученного фильтрата до кипения и смешивание его с раствором 9-10 вес.% AgNO₃ при мольном соотношении нитрата метиленового синего, полученного после фильтрации, и AgNO₃ = 1:1.

4. Выпаривание раствора до 1/20 первоначального объема.

5. Фильтрация выпавших кристаллов целевого продукта.

6. Растворение целевого продукта в горячей воде.

7. Фильтрация раствора от дополнительно выпавшего AgCl.

8. Упаривание раствора полностью на ротационном испарителе.

9. Сушка выпавших кристаллов.

Известный способ получения комплекса метиленового синего с ионным препаратом золота реализуется следующими технологическими операциями.

1. Спиртовый раствор HAuCl₄•3H₂O с концентрацией 35-40 вес.% смешивается со спиртовым раствором 9-10 вес.% метиленового синего при мольном соотношении реагентов 1:1.

2. Реакционная масса нагревается почти до кипения.

3. Упаривание раствора до 1/20 первоначального объема.

4. Охлаждение раствора и кристаллизация.

5. Сушка кристаллов.

Заявляемый способ получения нового лекарственного средства описывается следующим примером конкретной реализации
Пример.

В защищенный от света стеклянный реакционный аппарат, снабженный полимерной мешалкой, капельной воронкой и барботером для продувки инертным газом, загружают 373,9 г метиленового синего в виде 9-10 вес.% водного раствора, нагретого до температуры 80-95^oC и при этой температуре добавляют 169,9 г AgNO₃ в виде 25 вес. % водного раствора комнатной температуры. Фильтруют реакционную массу от выпавшего в осадок AgCl. К нагретому почти до кипения раствору добавляют 9-10 вес.% раствор AgNO₃ в количестве 84,95 г в расчете на безводный нитрат серебра. Полученный раствор смешивают при нагревании почти до кипения с водно-спиртовым раствором комнатной температуры HAuCl₄•3H₂O с концентрацией 35 вес.% в количестве 196,9 г в расчете на основное вещество в форме тригидрата. Затем полученную реакционную массу выдерживают при температуре 80-90^oC в течение 30 минут. Полученный водный раствор целевого продукта упаривают досуха на ротационном испарителе.

Примечание. Водно-спиртовый раствор HAuCl₄•3H₂O содержит 23,03 г этилового спирта в пересчете на безводный.

При описанном выше способе потери драгоценных металлов составляют не более 0,01 вес.% от загруженных препаратов в пересчете на металлы.

Исследование анти-ВИЧ активности препаратов NN 1,2
Оценка цитотоксичности соединений.

Цитотоксичность исследуемых соединений оценивали на культуре перевиваемых Т лимфоцитов человека (линия МТ-4). Из исходных растворов исследуемых соединений готовили последовательные 10-кратные разведения на основе питательной среды RPMI-1640 (от 0,1% до 0,00001%) и в соответствующих разведениях вносили по 200 мкл в лунки 96-луночных планшетов (по три на каждое разведение) при рассеве клеток. Посевная концентрация клеток составляла 0,5•10⁶ клеток/мл. Конечная концентрация препаратов в клеточной суспензии составляла от 0,01% до 0,000001%. Клетки культивировали в 96-луночных планшетах для культур клеток фирмы "Costar" (США) на ростовой питательной среде (среда RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина) при 37^oC и 5% CO₂ в течение 4 суток.

По окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания трипановым синим. Строили дозозависимую кривую и определяли концентрацию соединений, вызывающую гибель 50% клеток - CD₅₀ (см. табл. 1)
Оценка анти-ВИЧ активности соединений.

Для оценки анти-ВИЧ активности соединений клетки ИТ-4 (концентрация 2•10⁶ клеток/мл) инфицировали штаммом ВИЧ-1_EVK с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку. После адсорбции вируса в течение 1 часа при 37^oC инфицированные и контрольные клетки (без вируса) разводили ростовой культуральной средой до посевной концентрации 5•10⁵ клеток/мл и вносили в лунки 96-луночных культуральных планшетов. Затем в соответствующие лунки вносили растворы исследуемых соединений (по три лунки на каждое разведение) и далее культивировали, как описано выше. В качестве эталонного препарата использовали азидотимидин (АЗТ) - известный анти-ВИЧ агент - в концентрации 0,1 мкг/мл. Конечная концентрация исследуемых препаратов в клеточной суспензии составляла от 0,01% до 0,000001%.

Ингибирующий эффект соединений оценивали на 4-е сутки культивирования по ЦПД вируса исходя из степени защиты инфицированных клеток от гибели в результате вирусной инфекции. Для этого определяли долю жизнеспособных клеток подсчетом в камере Горяева после окрашивания трипановым синим. На основании полученных результатов рассчитывали количественные характеристики ингибирования репродукции ВИЧ: ID₅₀ - концентрацию соединения, на 50% подавляющую продукцию вируса или вызывающую 50% защиту клеток; IS - индекс селективности - отношение токсичной дозы соединения CD₅₀ к его эффективной дозе ID₅₀.

Результаты проведенных исследований.

В результате проведенных экспериментов установлены для исследуемых препаратов NN 1, 2 цитотоксические дозы, которые составили для препарата N 1 CD₅₀=0,0001%, для препарата N 2 CD₅₀=0,0005%.

При исследовании анти-ВИЧ активности этих препаратов оказалось, что препарат N 1 в концентрации 0,00001% существенно снижает ЦПД вируса, т.е. защищает на 76% инфицированные клетки от гибели вследствие инфекции (см. табл. 2). Доля жизнеспособных клеток в других пробах с препаратами всюду практически не превышала, а в некоторых пробах была ниже таковой в контроле инфицированных клеток МТ-4(ВИЧ) - 42%. Эталонный препарат АЗТ в концентрации 0,1 мкг/мл в этом эксперименте обеспечивал на 100% защиту инфицированных клеток (доля жизнеспособных клеток в этой пробе 92,15%).

Для более полной характеристики анти-ВИЧ активности представленных препаратов была проведена количественная оценка вирусного антигена р24 иммуноферментным методом (см. табл. 3).

Согласно представленным в табл. 3 экспериментальным данным по оценке степени ингибирования накопления вирусспецифического белка р24 исследуемыми препаратами NN 1, 2 в культуре клеток МТ-4 оба препарата проявляют выраженную анти-ВИЧ активность в диапазоне концентраций от 0,01 до 0,0001%. Эталонный препарат АЗТ ингибирует репродукцию ВИЧ на 92% в концентрации 0,1 мкг/мл.

На основании проведенных исследований были определены все необходимые количественные характеристики ингибирования репродукции ВИЧ в культуре клеток МТ-4: ID₅₀, CD₅₀, IS, которые представлены в табл. 4.

Следует отметить, что оба препарата имеют невысокие индексы селективности - 5 и 7, но в случае препарата N 1 проявляется в отличие от препарата N 2 существенное защитное действие (IS=10).

При необходимости можно уточнить полученные количественные характеристики, взяв в эксперимент не 10-ти, а, например, 2-кратные разведения исходных препаратов.

Изобретение относится к медицине. Водорастворимое противовирусное лекарственное средство на основе соединений серебра и золота с N, N¹-тетраметилтиазином нитратом при мольном соотношении соответственно 1:1:2 и отвечающее составу: С₃₂Н₃₆N₉O₉S₂Cl Ag Au. К нагретому до 80-95^oС водному раствору N,N¹-тетраметилтиазина хлорида добавляют нитрат серебра при мольном отношении 1: 1. Осадок отфильтровывают. К раствору при 80-95^oС добавляют водный раствор нитрата серебра, затем водный раствор соединения золота в форме треххлористого золота или тригидрата золотохлористоводородной кислоты, этиловый спирт при мольном отношении 2:1:1:1 соответственно. Полученный раствор направляют на сушку. Изобретение позволяет реализовать назначение средства и упростить процесс его получения. 2 с.п. ф-лы, 5 табл.

1. Водорастворимое средство, обладающее противовирусной активностью на основе соединения серебра и соединения золота с N,N¹-тетраметилтиазином нитратом при мольном соотношении соответственно 1:1:2 и отвечающее составу: С₃₂Н₃₆N₉O₉S₂ClAgAu. 2. Способ получения водорастворимого средства, обладающего противовирусной активностью по п.1, заключающийся в том, что к нагретому до 80-95^oС водному раствору N,N¹-тетраметилтиазина хлорида добавляют нитрат серебра при мольном отношении 1:1 с последующей фильтрацией осадка хлорида серебра и к отфильтрованному раствору нитрата N,N¹-тетраметилтиазина при 80-95^oС вновь добавляют водный раствор нитрата серебра, затем водный раствор соединения золота в форме треххлористого золота или тригидрата золотохлористоводородной кислоты, этиловый спирт при мольном отношении 2:1:1:1 соответственно и полученный раствор направляют на сушку.