РЕГУЛЯТОР ОБМЕНА АЦЕТАЛЬДЕГИДА В ОРГАНИЗМЕ ПРИ ОКИСЛЕНИИ ЭТИЛОВОГО СПИРТА, СРЕДСТВО И НАПИТОК ЕГО СОДЕРЖАЩИЕ Российский патент 2003 года по МПК A61K35/78 A61K31/70 A61P25/32 C12G3/04 

Изобретение относится к средствам на основе природных компонентов, обладающим антитоксическим действием при алкогольном отравлении, и может быть использовано как в медицинской так и в пищевой промышленности.

В настоящее время олигомерные проантоцианидины - ОПЦ, представляющие собой суммарный экстракт, состоящий из проантоцианидинов, проантоцианидиновых фракций, очищенных от гидролизуемых танинов, алкалоидов, липидов, углеводов, простых сахаров, белков, аминокислот и органических кислот, индивидуальные проантоцианидины и их смеси нашли широкое применение. Проантоцианидины, известные как проантоцианины, процианодолы, антоцианогены или процианидины принадлежат к семейству флавоноидов и представляют собой олигомеры флаван-3-олов и/или флаван-3,4-олов. В порядке возрастания степени полимеризации проантоцианидины представляют собой мономеры (катехин, эпикатехин), а также их галлоильные эфиры по положению 3), олигомеры (проантоцианидины со степенью полимеризации от двух до пяти) и полимеры со степенью полимеризации более шести. Проантоцианидины включают, но не ограничиваются процианидинами, продельфинидинами, пропеларгонидинами и профисетинидинами. Проантоцианидины могут состоять в среднем от двух до 30 флаваноидных мономеров, так называемых полигидроксифлаван-3-олов, которые включают, но не органичиваются катехином, эпикатехином, галлокатехином, эпигаллокатехином и им подобными, предплчтительнее от двух до шести, связанных интерфлаваноидными связями В-типа между С4 и С6 или между С4 и С8. Полимеры включают димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры, олигомеры и длинные полимеры из флавоноидных момерных единиц до тех пор, пока эти полимеры проявляют указанную активность.

Известно большое количество растений, содержащих проантоцианидины, и любое из этих растений может быть использовано для их получения. Проантоцианидин-содержащие растения входят в класс Coniferiae, включая растения из разряда Coniferales из семейства Pinacea (включая сосны); члены семейства Filices (включая пальмы); однодольные растения, образующие класс Arecales, включая членов семейств Pandanales, Arales, Najadales, Restonales, Poales (включая зерновые, такие как сорго, ячмень и др.), Juncalaes, Cyperales (включая кипарис), Typhales, Zingiverales, Liliales (включая лилии); двудольные растения из отрядов Laurales (включая лавровый лист, корицу), Fagales (включая дуб), Casual-males, Dilleniales, Malviales (включая хлопок), Salicales, Ericales (включая клюкву, голубику, рододендрон), Ebenales, Resales (включая розы, боярышник, шиповник, черемуху, ежевику и другие аналогичные ягоды, яблоки, персики, сливы), Fabales (включая бобовые), Myrtales, Proteales, Rhamnales (включая виноград), Sapindales, Caprifoliaceae (включая калину, жимолость и другие аналогичные ягоды). В настоящее время в качестве растительного источника для получения ОПЦ используют как правило Caprifoliaceae, включающие виды Viburnum, Rosaceae и Vitaceae, которые включают виды Vitis и хвойные семейства Pinaceae, как содержащие наибольшее количество олигомерных проантоцианидинов.

Обычно получение ОПЦ основано на процессе их экстракции из растительного сырья, хотя возможно получение ОПЦ и путем синтеза входящих в их состав органических соединений. Экстракция проантоцианидинов из растительного материала проводится различными известными методами. Например, исходный растительный материал измельчается и экстрагируется растворителем, одним или несколькими. Гидрофильные или липофильные растворители могут быть использованы отдельно, последовательно или в комбинации. Предпочтительными из таких растворителей являются вода, спирты (этанол, метанол, изопропанол), кетоны (ацетон, метилэтилкетон) и эфиры (метилацетат и этилацетат). Температура экстракции в общем от 0 до 100^oС, предпочтительнее от 10 до 55^oС (п. Канады 2302743; Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 38, 321 (1990) и 40, 889-898 (1992); Acta Derm. Venereol. (Stockh), 78, 428-432 (1998).

В основном олигомерные проантоцианидины (ОПЦ) применяют как природные антиоксиданты, обладающие широким спектром биологической активности. Они являются не только мощными антиоксидантами и ловушками свободных радикалов (п. США 4797421), но еще и обладают антибактериальной (п. США 6210681), антивирусной, противоопухолевой, антивоспалительной, антиаллергенной и сосудорасслабляющей активностью. Проантоцианидины ингибируют процессы перекисного окисления липидов, агрегацию тромбоцитов, снижают хрупкость и проницаемость капилляров (п. США 6294190), а также влияют на активность ряда ферментных систем, включая каскад арахидоновой кислоты (п. США 6291517). Показано, что такими свойствами обладают как индивидуальные проантоцианидины, так и их смеси, а также экстракты их содержащие, при этом использование проантоцианидинов осуществляют в различной форме в виде фармацевтической композиции, пищевых добавок и пищевых продуктов, а также напитков.

Авторами после длительных исследований впервые обнаружено новое свойство ОПЦ, а именно их способность воздействовать на ферменты этанолокисляющей системы организма, регулируя обмен ацетальдегида при окислении этилового спирта, смягчая его поражающее действие на организм.

Хорошо известно, что в последние годы наблюдается значительное увеличение потребления алкоголя. По некоторым оценкам социальная стоимость употребления алкоголя для общества оценивается в различных государствах на уровне 2 - 3% от валового национального продукта (Европейский план действий по борьбе с потреблением алкоголя. ЕРБ ВОЗ, 1992;5).

Известны препараты антитоксического действия при воздействии алкоголя на организм, в которых основным действующим инградиентом является янтарная кислота, представляющая собой природный метаболит, обеспечивающий накопление энергии в митохондриях, что способствует восстановлению энергетического потенциала и уменьшает алкогольное опьянение (п.п. РФ 2039556, 2160589, 2012350).

Известно применение в качестве антитоксического средства при алкогольном отравлении препарата "Алко-Зельтцер", содержащего лимонную, ацетилсалициловую кислоты и другие компоненты (инструкция-вкладыш к лекарственному препарату Alka-Seltzer, фирма Miles, Великобритания). Однако присутствие в препарате аспирина приводит к диспептическим явлениям, изменениям в слизистой желудка, нарушениям функции нервной системы и процессов гемокоагуляции.

Известно применение этиловых эфиров аскорбиновой кислоты для снижения тяжести абстинентного синдрома, коррекции состояния алкогольного опьянения (п. РФ 2112510).

Одним из основополагающих факторов токсикологической характеристики при потреблении этанола является образование ацетальдегида, который в силу своей высокой реакционной способности не может находиться в организме в свободном виде и участвует в химических реакциях со многими биологически активными соединениями, вызывая широкий спектр негативных последствий в организме. Высокая концентрация ацетальдегида оказывает отрицательное воздействие как на печень, основной орган детоксикации в организме, так и на мозг в виде продуктов конденсации с катехоламинами и индоламинами, что способствует ускоренному формированию физиологической зависимости от алкоголя по наркотическому типу.

Наиболее близкими к заявляемому изобретению являются препараты, ингибирующие активность фермента альдегиддегидрогеназы, метаболизирующей токсичный продукт окисления этилового спирта ацетальдегид в менее токсичную уксусную кислоту. К таким препаратам можно отнести дисульфирам (антабус^®), коприн, темпосил^®, нитрефазол и др. Однако они оказывают весьма существенное негативное влияние на организм. (Eriksson C.J. The role of acetaldehyde in the action of alcohol (update 2000), Alcohol Clin Exp Res, 2001, 25, p.15S-32S), так как образующийся ацетальдегид накапливается в организме в значительных количествах, что приводит к сильному отравлению, сопровождаемому всеми симптомами химической интоксикации - тошнота, рвота, головная боль, упадок сил, то есть к состоянию тяжелого похмелья, усиленного в несколько раз.

Ацетальдегид провоцирует выброс катехоламинов и индоламинов, вызывает лавинообразную активацию перекисного окисления липидов биологических мембран, нарушает множество рецепторных процессов. Избыток ацетальдегида образует аддукты с гемоглобином, белками плазмы мозга и других органов, приводит к торможению переноса восстановительных эквивалентов по дыхательной цепи митохондрий, провоцируя множественные гипоксические и ишемические явления, нарастающие и приобретающие устойчивый характер по мере увеличения концентрации ацетальдегида.

Отсюда вытекает насущная необходимость получения средств, способных активно включаться в метаболизм этилового спирта и регулировать обмен ацетальдегида, смягчая его поражающее действие на организм.

Технической задачей заявляемого изобретения является регуляция обмена ацетальдегида в организме млекопитающих при окислении этилового спирта путем воздействия на ферменты этанолокисляющей системы организма.

Поставленная задача решается применением в качестве регулятора обмена ацетальдегида в организме млекопитающих при окислении этилового спирта олигомерных проантоцианидинов (ОПЦ).

Поставленная задача решается также средством, регулирующим обмен ацетальдегида в организме млекопитающих при окислении этилового спирта, содержащим в качестве действующего начала олигомерные проантоцианидины.

Поставленная задача решается также напитком, содержащим этиловый спирт и олигомерные проантоцианидины в эффективном количестве.

Техническим результатом заявленного изобретения является снижение концентрации ацетальдегида в организме при массированном окислении этанола при использовании ОПЦ.

В настоящем изобретении для получения ОПЦ может быть использован любой известный способ экстракции подходящего растительного сырья, известный среднему специалисту, а также искусственно синтезированная смесь ОПЦ, содержащая полимеры полигидроксифлаван-3-олов, имеющие от двух до 30 флавоноидных единиц, предпочтительнее от двух до шести, связанных интерфлаваноидными связями В-типа между С4 и С6 или между С4 и С8. Полимеры включают димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры, олигомеры и длинные полимеры из флавоноидных момерных единиц, до тех пор, пока эти полимеры проявляют указанную активность.

В частности, для получения проантоцианидинового экстракта, не содержащего токсичных растворителей, мы применили экстракцию 40% (об/об) водным этанолом. Для этого растительное сырье, содержащее ОПЦ (нами использовался отжим калины Viburnum), высушивают при температуре, не превышающей 50^oС, и измельчают для ускорения и улучшения процесса экстракции. Измельченное сырье экстрагируют 40% этанолом, обычно, при соотношении сырья к экстрагенту 1:1. Полученный экстракт упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 30^oС для удаления этанола. Выпавший осадок удаляют центрифугированием, надосадочную жидкость фильтруют через мембранный фильтр (0,45 мкМ). Полученный раствор суммарной фракции фенольных соединений экстрагируют неполярным растворителем (гексаном, петролейным эфиром или подобным растворителем) для удаления неполярных примесей. Неполярную фазу отбрасывают, а водную фазу лиофилизируют перед дальнейшей очисткой или оставляют, так как есть.

На следующем этапе очистки полученную водную фракцию наносят на хроматографическую колонку с Сефадексом LH-20 или LH-60, уравновешенную дистиллированной водой. Данная процедура позволяет отделить полифенольные соединения, которые адсорбируются на колонке от органических кислот и углеводов, не задерживающихся на сорбенте. Фракцию фенольных кислот отделяли, элюируя колонку 20% раствором этилового спирта. Фракцию олигомерных проантоцианидинов элюировали 70% ацетоном, который удаляли на роторном испарителе при температуре <30^oС. Содержание проантоцианидинов в полученном экстракте определяют колориметрической реакцией с ванилином (Sun, В. S., J. М. Ricardo-da-Silva, et al. "Critical factors of vanillin assay for catechins and proanthocyanidins. " Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46(10): 4267-4274). Полученную фракцию проантоцианидинов лиофилизируют и хранят при температуре 4^oС в темном месте для уменьшения эффекта воздействия кислорода. Суммарное содержание полифенолов (Singleton, V. L., R. Orthofer, et al. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin - Ciocalteu reagent. Oxidants and Antioxidants, Pt A. L. Packer. San Diego, Academic Press Inc. 1999, 299: 152-178) в полученном препарате составило от 30 до 90%. В качестве стандарта использовали (+)-катехин. Полученный раствор олигомерных проантоцианидинов лиофилизировали и использовали в дальнейших опытах.

Ранее установлено, что выделенные из растительного сырья или синтезированные ОПЦ вводят в организм, как правило, сами по себе, но возможно их использование и в смеси с носителем, или включая в носитель, или разбавляя носителем. При этом в качестве носителя могут быть использованы лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, крахмал, альгинаты, желатин, целлюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, вода, спирт и другие подходящие для этой цели носители.

Для человека доза ОПЦ, достаточная для регуляции обмена ацетальдегида при употреблении алкоголя в количестве, эквивалентном 100 мл абсолютного спирта, составляет 50 - 400 мг и более в любом количестве, оказывающем необходимый эффект, так как проведенные ранее многочисленные исследования не обнаруживают вредного влияния на организм ОПЦ. Конкретно вводимое достаточное количество ОПЦ определяют с учетом различных факторов, включая состояние организма, возраст, пол, массу тела конкретного индивидуума и т.д.

Кроме того, ОПЦ могут быть непосредственно введены в напиток, содержащий алкоголь, для регуляции обмена ацетальдегида в организме при окислении этилового спирта в пределах от 0.1 до 50 мас.% таким образом, чтобы содержание ОПЦ в напитке соответствовало обозначенной выше пропорции.

Изучение влияния комплекса олигомерных проантоцианидинов на активность ферментов этанолокисляющей системы и динамику содержания этанола и ацетальдегида осуществляли на примере комплекса, полученного из отжима калины Viburnum, в условиях как однократного приема этанола добровольцами-мужчинами, так и при длительной алкоголизации животных. Для доказательства приведенного результата использовали напиток на основе 40% этанола, содержащего олиномерные проантоцианиды, полученные из отжима калины Viburnum.

1. Изучение влияния ОПЦ из отжима калины на ферменты этанолокисляющей системы при однократном употреблении алкоголя добровольцами- мужчинами.

В исследовании участвовали добровольцы-мужчины в возрасте 25-30 лет не употреблявшие алкоголь в течение последних трех недель. Добровольцы дали свое осознанное согласие на участие в эксперименте. Исследование проводилось на базе наркологического стационара г. Владивостока (наркологическая клиника профессора В. В. Шорина) при участии квалифицированного медицинского персонала. В эксперименте принимали участие 20 человек, разделенных на две группы по 10 испытуемых в каждой. Участники 1-й группы (контроль) получали однократно 40% этанол в дозе 3 мл/кг. Испытуемые 2-й группы (опыт) - 40%-й этанол в той же дозе с добавкой ОПЦ из отжима калины в количестве 300 мг/л. Для определения биохимических показателей использовали образцы капиллярной крови (0.6 мл), полученной пункцией из кончика пальца. Образцы у испытуемых были взяты до приема алкоголя (фон) и через 1, 2, 3 и 4 часа после его приема.

После приема алкоголя испытуемыми наблюдалось быстрое увеличение его концентрации в крови, которая к концу первого часа достигла максимума и составила 16,3 mM как в 1-й, так и во 2-й группах. Следовательно, проантоцианидины не оказывали влияния на скорость всасывания этилового спирта в желудочно-кишечном тракте. Начиная со второго часа эксперимента, в крови испытуемых контрольной группы наблюдали плавное снижение концентрации этилового спирта, которая к концу четвертого часа достигла 5,4 mM. Во 2-й группе содержание этанола в течение второго часа эксперимента в крови испытуемых не изменялось и находилась на уровне 16,3 mM. Снижение концентрации этанола зафиксировано только через 3 часа после его приема. То есть, в период между 1-м и 2-м часами образовалось "плато" на уровне 16,3 mM, которое отсутствовало в контрольной группе. Также следует обратить внимание на тот факт, что в опытной группе к концу 4-го часа концентрация этанола составила 7,8 mM, что на 50% превышало уровень этанола в контрольной группе. Динамика изменения дегидрогеназной активности АДГ в обеих группах была одинаковой во все сроки эксперимента, что свидетельствует об отсутствии ингибирующего влияния проантоцианидинов на данный фермент в условиях in vivo и равной скорости наработки ацетальдегида.

Содержание ацетальдегида в крови испытуемых 2-й группы во все сроки эксперимента было достоверно ниже, чем в контрольной (таблица 1). Повышение его содержания происходило более плавно и в интервале между 1-м и 3-м часами не было такого резкого увеличения концентрации ацетальдегида, которое отмечалось в 1-й группе (рост до 4,5 mM/л). К концу четвертого часа эксперимента уровень ацетальдегида в крови испытуемых 2-й группы приблизился к исходному, тогда, как в контрольной группе оставался на 65% (Р<0,001) выше фонового показателя.

Аналогичная картина наблюдалась и в динамике изменения активности АлДГ. У испытуемых опытной группы, начиная со второго часа эксперимента, активность АлДГ была достоверно ниже таковой в контроле. Известно, что увеличение активности АлДГ происходит за счет адаптивной индукции так называемой АлДГ2, митохондриального фермента с низкой К_м к ацетальдегиду, которая является основным ферментом, осуществляющим окисление ацетальдегида (Goedde, H. W. and D. P. Agarwal. "Pharmacogenetics of aldehyde dehydrogenase (ALDH)." Pharmacol Ther 1990, 45(3): 345-371). Индукция АлДГ1 - фермента с высокой К_м к ацетальдегиду, лежащей в области милимолярных концентраций, происходит только при достижении очень высоких концентраций ацетальдегида, что практически не встречается у людей не имеющих дефицита АлДГ2 (европеоидов)(там же).

Принимая во внимание индуцируемый характер АлДГ, адаптивный биосинтез которой обусловлен увеличением концентрации субстрата, можно заключить, что сниженная активность АлДГ в крови испытуемых опытной группы обусловлена более низким содержанием субстрата, нежели ингибированием фермента проантоцианидинами. Иначе ингибирующующее воздействие на АлДГ (Kitson, Т. М., К. Е. Kitson, et al. "Interaction of sheep liver cytosolic aldehyde dehydrogenase with quercetin, resveratrol and diethylstilbestrol." Chemico-Biological Interactions 2001, 130(1-3): 57-69) должно было бы сопровождаться увеличением концентрации субстрата, тогда как мы наблюдаем противоположную картину.

Так как активность АДГ в крови испытуемых обеих групп достоверно не отличается, то скорость наработки ацетальдегида также должна быть равной. Однако более низкий уровень содержания ацетальдегида и активности АлДГ, при повышенном содержании этанола в крови испытуемых опытной группы, указывает на протекающий процесс наработки этанола из ацетальдегида. Данный процесс может протекать как за счет активизации редуктазной активности АДГ (Gershman, H. "Acetaldehyde-ethanol exchange in vivo during ethanol oxidation. " Arch Biochem Biophys 1975, 168(1): 327-330), так и за счет реакции дисмутации ацетальдегида с участием того же фермента (Henehan, G. Т., G. L. Kenyon, et al. "The oxidation of aldehydes by horse liver alcohol dehydrogenase. " Adv Exp Med Biol 1993, 328: 481-491; Henehan, G. Т. and N. J. Oppenheimer "Horse liver alcohol dehydrogenase-catalyzed oxidation of aldehydes: dismutation precedes net production of reduced nicotinamide adenine dinucleotide. " Biochemistry 1993, 32(3): p 735-738.). Этот биохимический механизм может лежать в основе образования "плато" концентрации этанола между 1-м и 2-м часами эксперимента.

2. Изучение влияния КОПЦ из отжима калины на ферменты этанолокисляющей системы в условиях длительного потребления этилового спирта.

В работе использовали крыс самцов линии Вистар (питомник Столбовая, Московская обл. ) массой 180-200 г. Все крысы находились в индивидуальных клетках и получали стандартный рацион питания. Предварительно было проведено 10-дневное тестирование животных на предпочтение 15% этанола или воды при одновременном доступе к обеим жидкостям (Буров, В., В. Н. Жуков, et al. Методические рекомендации по экспериментальному (фармакологическому) изучению препаратов, предлагаемых для клинической апробации в качестве средств для лечения и профилактики алкоголизма. М., 1980, Фармакол. ком. МЗ СССР).

Животных с равным потреблением 15% этанола разделили на 3 группы по 10 крыс в каждой; 1-я группа контрольная (интактные) - получала водопроводную воду (СанПиН - 2.1.4. 559-96.); 2-я группа - в качестве единственного источника жидкости из градуированных поилок получала 15% раствор этанола; 3-я группа - 15% этанол с добавкой олигомерных проантоцианидинов (50 мг/л) из отжима калины. Длительность эксперимента составляла 30 дней, после чего животных умерщвляли декапитацией, быстро извлекали печень и замораживали в жидком азоте. В печени определяли дегидрогеназную и редуктазную активность алкогольдегидрогеназы, а также активность альдегиддегидрогеназы с низкой и высокой К_м (константой Михаэлиса) к ацетальдегиду. Результаты эксперимента приведены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2 потребление крысами 15% этилового спирта (2-я группа) в течение 30 дней приводит к увеличению активности АлДГ печени с низкой К_м к ацетальдегиду. По нашему мнению данный феномен обусловлен активной наработкой ацетальдегида при окислении этанола и, соответственно, индукцией АлДГ. Одновременно снижается и редуктазная активность АДГ, которая является важной физиологической функцией данного фермента (Gershman, H. "Acetaldehydeethanol exchange in vivo during ethanol oxidation." Arch Biochem Biophys 168(1): 327-330). В группе животных, получавших композицию из этанола с олигомерными проантоцианидинами, уровень активности АлДГ с низкой К_м к ацетальдегиду достоверно не отличается от контрольного. При этом редуктазная активность АДГ возрастает до уровня интактных животных. Полученные результаты показывают, что олигомерные проантоцианидины активизируют процесс восстановления ацетальдегида, сохраняя редуктазную активность АДГ, обычно подавляемую этиловым спиртом. Это свойство проантоцианидинов позволяет снизить концентрацию высокотоксичного ацетальдегида в организме, что было замечено выше в эксперименте на добровольцах. В пользу данного вывода указывает и отсутствие достоверно выраженного роста активности АлДГ с низкой К_м ввиду поддержания концентрации ацетальдегида на уровне, не вызываемом дополнительную индукцию фермента.

Таким образом:
- олигомерные проантоцианидины активно вовлекается в процесс окисления этанола в организме, воздействуя на ферменты этанолокисляющей системы;
- под действием олигомерных проантоцианидинов наблюдается сохранение редуктазной активности АДГ печени при длительной алкоголизации млекопитающих, в результате чего ацетальдегид восстанавливается до этанола;
- олигомерные проантоцианидины косвенно препятствуют резкому нарастанию ацетальдегида в организме, активируя его восстановление в менее токсичный этанол, что обусловливает образование "плато" этанола между 1-м и 2-м часами эксперимента на добровольцах.

Полученные данные указывают на участие проантоцианидинов в регуляции метаболизма ацетальдегида, образующегося при окислении этилового спирта в организме, что определяет их антитоксическое действие, выражаемое в предотвращении резкого накопления ацетальдегида в организме, что позволяет их использовать в медицинской и пищевой промышленности с достижением заявляемого результата.

Изобретение может быть использовано в пищевой и фармацевтической промышленности. Описано применение олигомерных проантоцианидинов в качестве регулятора обмена ацетальдегида в организме млекопитающих при окислении этилового спирта. Также описаны средство, содержащее указанный регулятор обмена ацетальдегида, и напиток, содержащий этиловый спирт и эффективное количество олигомерных проантоцианидов. Технический результат изобретения заключается в снижении концентрации ацетальдегида в организме при массированном окислении этилового спирта путем воздействия на активность алкогольдегидрогеназы и смягчении поражающего действия ацетальдегида на организм. 3 с.п. ф-лы, 2 табл.

1. Применение олигомерных проантоцианидинов в качестве регулятора обмена ацетальдегида в организме млекопитающих при окислении этилового спирта. 2. Средство, регулирующее обмен ацетальдегида, образующегося в организме млекопитающих при окислении этилового спирта, содержащее в качестве действующего начала эффективное количество олигомерных проантоцианидинов. 3. Напиток, регулирующий обмен ацетальдегида в организме, содержащий этиловый спирт и эффективное количество олигомерных проантоцианидинов.