ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ВЕКТОР (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2002 года по МПК C12N15/63 C12N15/37 

Данная заявка является продолжением находящейся на рассмотрении заявки США сер. номер 08/310468, поданной 22 сентября 1994.

Область техники
Данное изобретение относится к ДНК молекулам, кодирующим очищенный папилломавирус типа 6а человека, и ее производным.

ЧПВ6а (НРV6а) нуклеотидная последовательность N2.

Предшествующий уровень техники
Инфекции папилломавируса (PV) встречаются у ряда животных, включая людей, овец, собак, кошек, кроликов, обезьян, змей и коров. Папилломавирусы инфицируют эпителиальные клетки, обычно вызывая доброкачественные эпителиальные или фиброэпителиальные опухоли в месте инфекции. ПВ являются разновидностями специфических инфекционных агентов (возбудителей инфекций); папилломавирус человека не инфицирует животное, не относящееся к человеку.

Папилломавирусы могут быть классифицированы на различные группы, исходя из хозяина, которого они инфицируют. Человеческие папилломавирусы (HPV), кроме того, классифицируются на более чем 70 типов с учетом гомологии ДНК последовательности. По-видимому, PV типы являются тип-специфическими иммуногенами в том смысле, что приобретенный иммунитет к инфекции одним типом папилломавируса не придает иммунитет против другого типа папилломавируса.

У людей различные типы HPV вызывают различные заболевания. HPV типы 1, 2, 3, 4, 7, 10 и 26-29 вызывают доброкачественные бородавки как у нормальных индивидуумов, так и у индивидуумов с ослабленным иммунитетом (иммунологически "скомпрометированных"). HPV типы 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 и 46-50 вызывают плоские поражения у индивидуумов с ослабленным иммунитетом. HPV типы 6, 11, 34, 39, 41-44 и 51-55 вызывают доброкачественные кондиломы слизистой оболочки половых органов или дыхательных путей. HPV типы 16 и 18 вызывают эпителиальную дисплазию слизистой оболочки половых органов и ассоциируются с большинством in situ и инвазийными карциномами шейки, влагалища, вульвы и анальной части прямой кишки.

Папилломавирусы представляют собой небольшие (50-60 нм), безоболочные, икосаэдрические ДНК вирусы, которые кодируют вплоть до восьми "ранних" и два "поздних" гена. Открытые рамки считывания ORFs вирусных геномов обозначают Е1-Е7 и L1 и L2, где "Е" обозначает ранний и "L" обозначает поздний. L1 и L2 кодируют вирусные капсидные белки. Ранние (Е) гены ассоциируют с функциями, такими как вирусная репликация и клеточная трансформация.

L1 белок представляет основной капсидный белок и имеет молекулярную массу 55-60 кДа. L2 белок представляет минорный капсидный белок, который имеет предсказанную молекулярную массу 55-60 кДа и наблюдаемую молекулярную массу 75-100 кДа, определенную электрофорезом в полиакриламидном геле. Данные иммунологического обследования подтверждают, что большая часть L2 белка является внутренней по отношению к L белку. L1 ORF высоко консервативна среди различных папилломавирусов. L2 белки менее консервативны среди различных папилломавирусов.

L1 и L2 гены были идентифицированы как хорошие мишени для иммунопрофилактики. Кроме того, как было показано, некоторые из ранних генов являются потенциальными мишенями для разработки вакцины. Исследования на системах папилломавируса одичавшего американского кролика (CRPV) и бычьего папилломавируса (ВРV) показали, что иммунизации этими белками, экспрессированными в бактериях, или путем использования вакцинных векторов защищают животных от вирусной инфекции. Экспрессия L1 генов папилломавируса в бакуловирусных экспрессирующих системах или использование вакцинных векторов приводит к ансамблю вирусоподобных частиц (VLP), которые используют для того, чтобы вызвать ответы вирус-нейтрализующих антител с высоким титром, которые коррелируют с защитой от вирусного контрольного заражения.

HPV6 и HPV11, которые лишь редко связывают с злокачественностями, являются этиологическими (причинными) факторами ~ 90% остроконечных кондилом, доброкачественных патологических изменений дыхательной слизистой оболочки и слизистой оболочки половых органов. HPV6 определяется в этих поражениях в три раза чаще, чем HPV11.

Полная нуклеотидная последовательность HPV6b, первоначальный HPV6 изолят, была определена (Schwarz, E. , et al 1983. EMBO J. 2: 2341-8). Другие НРV6 субтипы были идентифицированы, исходя из рестрикционных картин ферментативного переваривания (Gissmann. L. , et al. 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 560-3; Mounts, et al. 1982. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5425-9).

Несколькими группами показано, что НРV6а представляет предоминантный субтип, обнаруженный при биопсии кондиломы остроконечной у пациентов в США и Европе. Последнее сообщение подтверждает, что HPV6a является НРV6 прототипом (Kitasato, H. , et al. 1994. J. Gen. Virol. 75: 1157-1162). Установлено, что в США только приблизительно один процент из всех мужчин и женщин в возрастной группе от 15 до 49 лет обращаются к врачу с кондиломой остроконечной. К сожалению, не существует эффективного лечения для HPV-родственного заболевания. Поэтому, вакцина была бы крайне желательна. Для разработки профилактической или терапевтической вакцины, однако, определение последовательности поздних и ранних генов наиболее общих НРV субтипов крайне важна.

Ограниченная информация о последовательности, относительно НРV6а, касается длинной контрольной области (LCR) и Е6 и Е7. Текущая заявка раскрывает клонирование HP 6a из биоптата кандиломы остроконечной, определение полной последовательности вирусной ДНК и соответствующих аминокислотных последовательностей основных открытых рамок считывания (ORFs) НРV6а.

Данное изобретение относится к ДНК молекулам, кодирующим очищенный папилломавирус типа 6a человека (HPV тип 6a; НРV6а), и использованию ДНК молекул.

Сущность изобретения
Данное изобретение относится к ДНК молекулам, кодирующим очищенный папилломавирус типа 6a человека (HPV тип 6a; НРV6а), и их производным.

Детальное описание изобретения
Данное изобретение относится к ДНК молекулам, кодирующим очищенный человеческий папилломавирус типа 6a (HPV тип 6a; HPV6a), и их производным. Такие производные включают, но ими не ограничиваются, пептиды и белки, кодированные ДНК, антитела к ДНК или антитела к белкам, кодированным ДНК, вакцины, включающие ДНК, или вакцины, включающие белки, кодированные ДНК, иммунологические композиции, включающие ДНК или белки, кодированные ДНК, наборы, содержащие ДНК или РНК, полученные из ДНК или белков, кодированных ДНК.

HPV6 является основным причинным фактором остроконечной кондиломы (доброкачественные патологические изменения дыхательной слизистой оболочки и слизистой оболочки половых органов). Полная нуклеотидная последовательность НРV6b, первоначальный HPV6 изолят, была определена. Другие НРV6 субтипы были идентифицированы, исходя из рестрикционных картин ферментативного переваривания.

Несколько групп показали, что НРV6а представляет предоминантный субтип, обнаруженный в биоптатах кондиломы остроконечной у пациентов в США и Европе. Установлено, что в США только приблизительно один процент из всех мужчин и женщин в возрастной группе от 15 до 49 лет обращаются к врачам с кондиломой остроконечной. К сожалению, не существует эффективного лечения для HPV-родственного заболевания. Поэтому, вакцина была бы крайне желательна. Для разработки профилактической или терапевтической вакцины, однако, определение последовательности поздних и ранних генов наиболее общих HPV субтипов крайне важно. К сожалению, не существует эффективного лечения для HPV-родственного заболевания. Поэтому, вакцина была бы крайне желательна. Для разработки профилактической или терапевтической вакцины, однако, определение последовательности поздних и ранних генов наиболее общих HPV субтипов крайне важно.

Ограниченная информация о последовательности, относительно HP 6а, касается длинной контрольной области (LCR) и Е6 и Е7 (ORFs). Текущая заявка раскрывает клонирование НРV6а из биоптата кондиломы остроконечной, определение полной последовательности вирусной ДНК и соответствующих аминокислотных последовательностей основных открытых рамок считывания (ORFs) HPV6a. Данное изобретение относится к ДНК молекулам, кодирующим очищенный папилломавирус типа 6а человека (НРV тип 6а; HPV6а), и производным ДНК молекул.

Фармацевтически полезные композиции, включающие ДНК или белки, кодированные ДНК, могут быть приготовлены согласно известным способам, таким как смешение с фармацевтически приемлемым носителем. Примеры таких носителей и способов приготовления можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences. Для получения фармацевтически приемлемой композиции, пригодной для эффективного применения, такие композиции должны содержать эффективное количество белка или VLР. Такие композиции могут содержать белки или VLР, полученные из более чем одного типа HPV.

Терапевтические или диагностические композиции данного изобретения вводят индивидууму в количествах, достаточных для лечения или диагностирования PV инфекций. Эффективное количество можно варьировать исходя из ряда факторов, таких как состояние индивидуума, вес, пол и возраст. К другим факторам относится способ введения лекарственного препарата. Обычно композиции вводят в дозах в пределах от около 1 мкг до 1 мг.

Фармацевтические композиции могут вводиться индивидууму целым рядом маршрутов, такими как подкожный, местный, оральный, через слизистую оболочку, внутривенный и внутримышечный.

Вакцины данного изобретения включают ДНК, РНК или белки, кодированные ДНК, которые содержат антигенные детерминанты, необходимые для того, чтобы вызвать образование нейтрализующих антител у хозяина. Такие вакцины также достаточно безопасны для того, чтобы их можно было ввести, не опасаясь клинического заражения; не имеют токсических побочных действий; могут вводиться эффективным путем; стабильны и совместимы с носителями вакцины.

Вакцины можно вводить различными путями, такими как орально, парентерально, подкожно, через слизистую оболочку, внутривенно или внутримышечно. Вводимая доза может варьироваться в соответствии с состоянием, полом, весом и возрастом индивидуума; путем введения; и типом ПВ (PV) вакцины. Вакцина может применяться в различных лекарственных формах, таких как капсулы, суспензии, эликсиры или жидкие растворы. Вакцина может быть приготовлена с иммунологически приемлемым носителем.

Вакцины вводят в терапевтически эффективных количествах, т. е. в количествах, достаточных для генерирования иммунологически защитного ответа. Терапевтически эффективное количество может варьироваться, исходя из типа ПВ (PV). Вакцину можно вводить однократными дозами или многократно. Для приготовления иммуногенных композиций могут быть использованы ДНК и ДНК производные данного изобретения. Такие композиции при введении соответствующему хозяину способны вызвать иммунный ответ у хозяина.

ДНК и их производные можно использовать для генерирования антител. Используемый здесь термин "антитело" включает как поликлональные, так и моноклональные антитела, а также их фрагменты, такие как Fv, Fab и F(ab)2 фрагменты, которые способны связывать антиген или гаптен.

ДНК и ДНК производные данного изобретения могут использоваться для инфекции серотипа HPV и HPV скрининга. ДНК, рекомбинантные белки, VLP и антитела пригодны сами по себе для приготовления наборов, пригодных для определения и серотипирования HPV. Такой набор должен включать подходящий компарт-ментализованный носитель, который содержится в строгой изоляции, по крайней мере, в одном контейнере. Носитель, кроме того, должен включать реагенты, такие как НРV6а ДНК, рекомбинантный HPV белок или VLР или анти-НРV антитела, пригодные для определения целого ряда HPV типов. Носитель может также содержать средство для определения, такое как меченый антиген или субстраты фермента или т. п.

ДНК и полученные с ее помощью белки также используют в качестве маркеров молекулярных масс и молекулярных размеров.

Поскольку генетический код вырожден, более чем один кодон может быть использован для кодирования конкретной аминокислоты, и поэтому аминокислотная последовательность может кодироваться любым набором сходных ДНК олигонуклеотидов. Только один представитель набора будет идентичным НРV6а последовательности, но будет способен к гибридизации с НРV6а ДНК даже в присутствии ДНК олигонуклеотидов с ошибочным спариванием в соответствующих условиях. В альтернативных условиях, ошибочно спаренные ДНК олигонуклеотиды могут все же гибридизировать с НРV6а ДНК, допуская идентификацию и изоляцию ДНК, кодирующую HPV6a.

Очищенная HPV6a ДНК данного изобретения или ее фрагменты могут быть использованы для изоляции и очистки гомологов и фрагментов HPV6a от других источников. Чтобы выполнить это, сначала HPV6a ДНК можно смешать с образцом, содержащим ДНК, кодирующей гомологи HPV6a, в соответствующих условиях гибридизации. Гибридизированный ДНК комплекс можно изолировать и ДНК, кодирующую гомологичную ДНК, можно очистить из него.

Известно, что существует значительная избыточность в различных кодонах, которые кодируют специфические аминокислоты. Поэтому данное изобретение также относится к тем ДНК последовательностям, которые содержат альтернативные кодоны, которые кодируют возможную трансляцию идентичной аминокислоты. Для целей этого описания, последовательность, несущая один или более замещенных кодонов, будет определяться как вырожденная вариация. В объем данного изобретения включены также мутации либо в ДНК последовательности, либо в транслированном белке, которые существенно не меняют конечные физические свойства экспрессированного белка. Например, замещение лейцина на валин, лизина на аргинин или глутамина на аспарагин не может вызывать изменение в функциональности полипептида.

Известно, что ДНК последовательности, кодирующие пептид, могут быть изменены так, чтобы кодировать пептид, имеющий свойства, которые отличаются от свойств встречающегося в природе пептида. Способы изменения ДНК последовательности включают, но ими не ограничиваются, сайт-направленный мутагенез.

Используемый здесь термин "функциональное производное" HPV6a представляет соединение, которое обладает биологической активностью (либо функциональной, либо структурной), которая, в основном, сходна с биологической активностью HPV6a. Термин "функциональные производные", как полагают, включает "фрагменты", "варианты", "дегенеративные варианты", "аналоги" и "гомологи" или "химические производные" HPV6a. Термин "фрагмент", как полагают, относится к любой полипептидной субпопуляции HPV6a. Термин "вариант", как полагают, относится к молекуле, в основном, сходной по структуре и функции либо ко всей HPV6a молекуле, либо к ее фрагменту. Молекула является "по существу подобной" HPV6a, если обе молекулы имеют, в основном, подобные структуры или если обе молекулы обладают сходной биологической активностью. Поэтому, если две молекулы обладают, в основном, сходной активностью, то, как полагают, они являются вариантами, даже если структура одной из этих молекул не обнаружена в другой, или даже если две аминокислотные последовательности не идентичны. Термин "функциональное производное" не включает HPV6a.

Термин "аналог" относится к молекуле, в основном, сходной по функции либо ко всей HPV6a молекуле, либо к ее фрагменту.

Целый ряд способов может быть использован для молекулярного клонирования HPV6a ДНК. Эти способы включают, но ими не ограничиваются, прямую функциональную экспрессию HPV6a генов с последующим конструированием НРV6а-содержащей кДНК или геномной ДНК библиотеки в соответствующей системе вектора экспрессии. Другой способ заключается в скрининге НРV6а-содержащей кДНК или геномной ДНК библиотеки, встроенной в бактериофаг или шатл-вектор плазмиды с меченым олигонуклеотидным зондом, сконструированным из аминокислотной последовательности НРV6а. Дополнительный способ состоит из скрининга НРV6а-содержащей кДНК или геномной ДНК библиотеки, встроенной в бактериофаг или шатл-вектор плазмиды с неполной ДНК, кодирующей НРV6а. Эту неполную ДНК получают путем амплификации полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР, PCR) НРV6а ДНК фрагментов через дизайн вырожденных олигонуклеотидных праймеров из аминокислотной последовательности очищенного НРV6а. Другой способ состоит в изоляции РНК из НРV6а-продуцирующих клеток и трансляции РНК в белок посредством in vitro или in vivo системы трансляции. Трансляция РНК в пептид или белок приведет к получению, по крайней мере, части НРV6а белка, который может быть идентифицирован, например, по активности HPV6a белка, или по иммунологической реакционной способности с анти-НРV6а антителом. В этом способе пулы РНК, изолированные из НРV6а-продуцирующих клеток, могут быть анализированы на присутствие РНК, которая кодирует, по крайней мере, часть НРV6а. Кроме того, можно осуществить фракционирование ДНК пула для того, чтобы очистить НРV6а РНК от не-НРV6а РНК. Пептид или белок, полученный этим способом, можно проанализировать на обеспечение аминокислотных последовательностей, которые, в свою очередь, используют для получения праймеров для получения НРV6а кДНК, или РНК, используемую для трансляции, можно проанализировать на получение нуклеотидных последовательностей, кодирующих НРV6а, и получение зондов для скрининга НРV6а кДНК библиотеки. Эти способы известны в данной области техники и их можно найти, например, Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , Maniatis, T. in Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Очевидно, что другие типы библиотек, а также библиотеки, сконструированные из других клеток или типов клеток, могут быть использованы для изоляции НРV6а-кодирующей ДНК. Другие типы библиотек включают, но не ограничиваются ими, кДНК библиотеки, полученные от других клеток или линий клеток, содержащих HPV тип 6а, и геномные ДНК библиотеки. Получение кДНК библиотек может быть осуществлено целым рядом техник. Техники конструирования кДНК библиотек можно найти, например, в вышеупомянутой ссылке Sambrook, J. , et аl. . Очевидно, что ДНК, кодирующая НРV6а, может быть также изолирована из подходящей геномной ДНК библиотеки. Конструирование геномных ДНК библиотек может быть выполнено с помощью целого ряда техник. Техники конструирования геномных ДНК библиотек можно найти в Sambrook, J. et al. выше.

Клонированная НРV6а ДНК или ее фрагменты, полученные с помощью описанных здесь способов, могут быть рекомбинантно экспрессированы путем молекулярного клонирования в вектор экспрессии, содержащий промотор и другие соответствующие регуляторные элементы транскрипции, и перенесены в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева с получением рекомбинантного НРV6а. Техники для такого манипулирования детально описаны Sambrook, J. , et al. выше и известны в данной области.

Векторы экспрессии определены здесь как ДНК последовательности, которые требуются для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в соответствующем хозяине. Такие векторы могут быть использованы для того, чтобы экспрессировать эукариотические гены в целом ряде хозяев, таких как бактерии, сине-зеленые водоросли, клетки растений, клетки насекомых, клетки грибов и клетки животных. Специфически сконструированные векторы допускают челночный перенос ДНК между хозяевами, такими как бактерии - дрожжевые грибки, или бактерии - клетки животных, или бактерии - грибковые клетки, или бактерии - клетки беспозвоночных. Соответствующим образом сконструированный вектор экспрессии должен содержать: источник репликации для автономной репликации в клетках-хозяевах, способные к селекции маркеры, ограниченное число сайтов, используемых для рестрикции ферментами, потенциал для высокого числа копий, и активные промоторы. Промотор определяют как ДНК последовательность, которая направляет РНК полимеразу для связывания с ДНК и инициирования РНК синтеза. Сильный промотор представляет промотор, который заставляет мРНК инициироваться с высокой частотой. Векторы экспрессии включают, но не ограничиваются, клонирующие векторы, модифицированные клонирующие векторы, специально сконструированные плазмиды или вирусы.

Целый ряд векторов экспрессии млекопитающих может быть использован для экспрессии НРV6а ДНК или ее фрагментов в клетках млекопитающего. Коммерчески доступные векторы экспрессии млекопитающих, которые могут быть пригодными для экспрессии рекомбинантного НРV6а, включают, но ими не ограничиваются, pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagen), pXTl (Stratagen), pSG5 (Stratagen), EVO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (343-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) и λZD35 (ATCC 37565).

Целый ряд бактериальных векторов экспрессии может быть использован для экспрессии НРV6а ДНК или ее фрагментов в бактериальных клетках. Коммерчески доступные бактериальные векторы экспрессии, которые могут быть пригодными, включают, но ими не ограничиваются, pETlla (Novagen), лямбда gtll (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).

Целый ряд векторов экспрессии грибковых клеток может быть использован для экспрессии НРV6а ДНК или ее фрагментов в грибковых клетках. Коммерчески доступные векторы экспрессии грибковых клеток, которые могут быть пригодными, включают, но ими не ограничиваются, pYES 2 (Invitrogen) и Pichia вектор экспрессии (Invitrogen).

Целый ряд векторов экспрессии клеток насекомых может быть использован для экспрессии НРV6а ДНК или ее фрагментов в клетках насекомых. Коммерчески доступные векторы экспрессии клеток насекомых, которые могут быть пригодными, включают, но не ограничиваются, pBlue Вас Ш (Invitrogen).

Вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую HPV6a или его фрагменты, может быть использован для экспрессии HPV6a белков или фрагментов НPV6а белков в клетке, тканях, органах или животных (включая людей). Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими, включая, но не ограничиваясь, бактерии, такие как E. coli, грибковые клетки, такие как дрожжевые грибки, клетки млекопитающих, включая, но не ограничиваясь, клеточные линии человека, быка, свиньи, обезьяны и грызунов, и клетки насекомых, включая, но не ограничиваясь, клеточные линии, полученные от дрозофилы (Drosophila) и тутового шелкопряда. Клеточные линии, полученные от видов млекопитающего, которые могут быть пригодны и которые коммерчески доступны, включают, но не ограничиваются, L клетки L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), L клетки L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-Kl (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) и MRC-5 (ATCC CCL 171).

Вектор экспрессии может быть введен в клетки-хозяева при помощи одной из ряда техник, включая, но не ограничиваясь, трансформацию, трансфекцию, липофекцию, слияние протопластов, и электропорацию. Клетки, содержащие вектор экспрессии, клонально размножают и индивидуально анализируют для того, чтобы определить, образуют ли они HPV6a белок. Идентификацию клонов клеток-хозяев, экспрессирующих HPV6a, можно осуществить несколькими способами, включая, но не ограничиваясь, иммунологическую реактивность с анти-НРV6а антителами, и присутствие активности клетка-хозяин-связанный HPV6a, такой как связывание НРV6а-специфический лиганд или сигнальная трансдукция, определяемая как ответ, опосредованный взаимодействием НРV6а-специфических лигандов при HPV6a.

Экспрессию HPV ДНК фрагментов можно также осуществить, используя in vitro полученную синтетическую мРНК или нативную мРНК. Синтетическая мРНК или мРНК, изолированная из HPV6a продуцирующих клеток, может быть эффективно транслирована в различные бесклеточные системы, включая, но не ограничиваясь, экстракты пшеничных зародышей и экстракты ретикулоцитов, а также может быть эффективно транслирована в системы на основе клеток, включая, но не ограничиваясь, микроинъекцию в ооциты лягушек, причем микроинъекция в ооциты лягушек предпочтительна.

После экспрессии HPV6a белка(ов) в клетке-хозяйке, НРV6а белок может быть выделен, чтобы получить HPV6a в очищенной форме. Несколько методик очистки НРV6а доступны и пригодны для использования. Как описано здесь, рекомбинантный НРV6а белок может быть очищен от клеточных лизатов и экстрактов путем различных комбинаций, или индивидуального применения фракционирования солями, ионообменной хроматографии, эксклюзивной хроматографии по размерам, адсорбционной хроматографии на гидроксилапатите и гидрофобной хроматографии.

Кроме того, рекомбинантный НРV6а может быть отделен от других клеток белков с помощью использования иммуноаффинной колонки, изготовленной с моноклональными или поликлональными антителами, специфичными для насцентного НРV6а полной длины, или полипептидных фрагментов НРV6а. Моноклональные и поликлональные антитела можно получить рядом известных в данной области способов. Моноклональное или моноспецифическое антитело, используемое здесь, определяют как вид простого антитела или тип антитела со сложной структурой с характеристиками связывания с НРV6а. Однородное связывание, используемое здесь, относится к способности вида антитела связываться с специфическим антигеном или эпитопом. Очевидно, что способы получения моноспецифических антител могут быть использованы для получения антител, специфичных для НРV6а полипептидных фрагментов, или полноразмерного полипептида насцентного НРV6а. В частности, очевидно, что могут быть генерированы моноспецифические антитела, которые специфичны для полностью функционального HPV6a или его фрагментов.

Кроме того, данное изобретение относится к способам скрининга соединений, которые модулируют экспрессию ДНК или РНК, кодирующих НРV6а, а также функцию(и) НРV6а белка(ов) in vivo. Соединения, которые модулируют эти активности, могут быть ДНК, РНК, пептидами, белками, или небелковыми органическими молекулами. Соединения могут моделировать, увеличивая или уменьшая экспрессию ДНК или РНК, кодирующей HPV6а, или функцию НРV6а белка. Соединения, которые модулируют экспрессию ДНК или РНК, кодирующих НРV6а или функцию HPV6a белка, можно определить с помощью ряда анализов. Анализ может быть простым "да/нет" анализом для того, чтобы определить, имеется ли изменение в экспрессии или функции. Анализ может быть проведен качественно путем сравнения экспрессии или функции испытываемого образца с уровнем экспрессии или функции стандартного образца.

Можно получить наборы, содержащие НРV6а ДНК, фрагменты НРV6а ДНК, антитела к НРV6а ДНК или НРV6а белку, НРV6а РНК или НРV6а белок. Такие наборы используют для определения ДНК, которая гибридизирует с НРV6а ДНК, или для определения присутствия НРV6а белка(ов) или пептидных фрагментов в образце. Такую характеристику используют для ряда целей, включая, но не ограничиваясь, судебную экспертизу и эпидемиологические исследования.

Нуклеотидные последовательности, которые комплементарны ДНК последовательности, кодирующей НРV6а, можно синтезировать для антисмысловой терапии. Эти антисмысловые молекулы могут быть ДНК, стабильными производными ДНК, такими как фосфоротиоаты или метилфосфонаты, РНК, стабильными производными РНК, такими как 2-О-алкилРНК, или другими НРV6а антисмысловыми олигонуклеотидными миметиками. НРV6а антисмысловые молекулы могут быть введены в клетки с помощью микроинъекции, липосомной инкапсуляции или путем экспрессии из векторов, содержащих антисмысловую последовательность. НРV6а антисмысловую терапию можно, в частности, использовать для лечения болезней в том случае, когда полезно понизить НРV6а активность.

Термин "химическое производное" описывает молекулу, которая содержит дополнительные химические части, которые обычно не являются частью основной молекулы. Такие части могут улучшить растворимость, период полураспада, абсорбцию и т. д. основной молекулы. Альтернативно, части могут ослабить нежелательные побочные действия основной молекулы или уменьшить токсичность основной молекулы. Примеры таких частей описаны в ряде изданий, таких как Remington's Pharmaceutical Science.

Соединения, идентифицированные согласно описанным здесь способам, могут быть использованы как таковые в соответствующих дозах, определенных рутинным испытанием для того, чтобы получить оптимальное ингибирование НРV6а или его активности при сведении к минимуму какой-либо потенциальной токсичности. Кроме того, может быть желательно совместное введение или последовательное введение других агентов.

Преимущественно, соединения данного изобретения могут применяться в виде разовой суточной дозы, или общая суточная доза может быть введена несколькими небольшими дозами, повторяемыми через определенные интервалы времени. Кроме того, соединения данного изобретения можно вводить рядом маршрутов, включая, но не ограничиваясь, интраназальный, трансдермальный, с помощью суппозиториев, оральный, и т. п.

Для комбинированного лечения более чем одним активным агентом, когда активные агенты находятся в раздельных лекарственных формах, активные агенты могут применяться конкурентно, или каждый может вводиться в отдельно определенное для него время.

Схему приема лекарственного средства, использующую соединения данного изобретения, подбирают в соответствии с рядом факторов, включая тип, вид, возраст, вес, пол и состояние здоровья пациента; тяжесть состояния, подлежащего лечению; маршрут введения; функцию почек и печени пациента и конкретное применяемое соединение. Врач средней квалификации может легко определить и прописать эффективное количество лекарственного средства, требуемого для предотвращения, противодействия или подавления развития состояния. Оптимальная точность в достижении концентраций лекарственного средства внутри интервала, который дает эффективность без проявления токсичности, требует режима с учетом кинетики доступности лекарственного средства в места-мишени. Это включает рассмотрение распределения, равновесия и удаление лекарственного средства.

В способах данного изобретения, подробно описанные здесь соединения составляют активный ингредиент, и их обычно применяют в смеси с подходящими фармацевтическими разбавителями, наполнителями или носителями (вместе называемые здесь как вещества-"носители"), выбранными в соответствии с предполагаемой формой введения, т. е. , таблетки для перорального применения, капсулы, эликсиры, сироп, суппозитории, гели и т. п. , и в соответствии с обычной фармацевтической практикой.

Например, для орального применения в форме таблетки или капсулы, активный лекарственный компонент можно комбинировать с пероральным, нетоксичным, фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода и т. п. Кроме того, когда требуется или при необходимости, в эту смесь также могут быть включены подходящие связующие, смазки, дезинтегрирующие агенты и окрашивающие агенты. К подходящим связующим относятся, без ограничения, крахмал, желатин, природные сахара, такие как глюкоза или бета-лактоза, зерновые подсластители, природные и синтетические смолы, такие как акация, трагакант или альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза, полиэтиленгликоль, воски и т. п. К смазкам, используемым в этих лекарственных формах, относятся, без ограничения, олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и т. п. К дезинтеграторам относятся, без ограничения, крахмал, метилцеллюлоза, агар, бентонит, ксантановая смола и т. п.

Для жидких форм, активный лекарственный компонент можно комбинировать с подходящими, придающими запах, суспендирующими или диспергирующими агентами, такими как синтетические или природные смолы, например, трагакант, акация, метилцеллюлоза и т. п. К другим диспергирующим агентам, которые можно использовать, относятся глицерин и т. п. Для парентерального применения, желательны суспензии и растворы. Когда требуется внутривенное применение, используют изотонические препараты, которые обычно содержат подходящие консерванты.

Препараты местного применения, содержащие активный лекарственный компонент, можно смешивать с рядом веществ-носителей, хорошо известных в данной области, такими как, например, спирты, аллантоин, глицерин, масла витаминов А и Е, минеральное масло, РРG2 миристил пропионат, и т. п. , с получением, например, спиртовых растворов, очищающих средств для местного применения, очищающих гелей, гелей для кожи, лосьонов для кожи и шампуней в формуляциях в виде крема или геля.

Кроме того, соединения данного изобретения можно применять в форме липосомных систем доставки, таких как небольшие однородные ламелярные везикулы, большие однородные ламелярные везикулы и мультиламелярные везикулы. Липосомы можно получать из целого ряда фосфолипидов, таких как холестерин, стериламин или фосфатидилхолины.

Соединения данного изобретения могут быть также доставлены путем использования моноклональных антител в качестве индивидуальных носителей, с которыми связывают молекулы соединения. Соединения данного изобретения можно также соединить с растворимыми полимерами в качестве носителей, способных доставить лекарственное средство к мишени. К таким полимерам могут относиться поливинилпирролидон, сополимер пирана, полигидроксипропилметакрилат-амидфенол, полигидроксиэтиласпартамидфенол или полиэтиленоксидполилизин, замещенный пальмитоильными остатками. Кроме того, соединения данного изобретения можно связать с классом биодеградируемых полимеров, используемых для достижения контролируемого выделения лекарственного средства, например, полиакриловая кислота, полиэпсилон капролактон, полигидрокси бутировая кислота, полиортоэфиры, полиацетали, полидигидропираны, полицианоакрилаты и сшитые или амфипатик (amphipathic) блоксополимеры гидрогелей.

Нижеследующие примеры иллюстрируют данное изобретение, не ограничивая его.

Пример 1
Экстракция нуклеиновой кислоты из биоптата
У женщины, 25 лет, послеродового периода, извлекают патологическое изменение в виде большой остроконечной кондиломы в наружных половых органах. Фрагмент поражения замораживают в жидком азоте, затем обрабатывают в Braun микродисмембраторе П (В. Braun Instruments, Melsungen, Germany). Полученное вещество солюбилизируют в 0,6% (об. /вес) додецилсульфате натрия (SDS), обрабатывают протеиназой К (50 мкг/мл) и экстрагируют смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт. ДНК осаждают этанолом и количественно определяют с помощью УФ-спектрофотометрии. Присутствие высокомолекулярной ДНК определяют электрофорезом на агарозном геле с последующим прокрашиванием этидиум бромидом.

Пример 2
Типирование НРV ДНК
НРV ДНК тип определяют, используя анализ гибридного захвата (hydrid capture assay), маркированный как Vira Type Plus (Digene Diagnostic, Beltsville, MD). Используемые HPV пробы делят на два пула, состав которых основан на связи каждого типа с злокачественностями половых путей. Проба-группа А содержала типы HP 6, 11, 42, 43 и 44, "низкого риска", в то время как проба В содержала типы 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 и 56 "высокого риска". Всю ДНК переваривают Р stI, BamHI и HindIII и Саузерн-блоттинк проводят в строгих условиях (Т_m-15^oС), чтобы определить HPV субтип.

Пример 3
Клонирование НРV6а генома
Всю ДНК, экстрагированную из образца HPV6а-положительного биоптата, переваривают HindIII эндонуклеазой. После фракционирования по размерам через 0,8% препаративный агарозный гель с низкой температурой плавления, область, соответствующую ДНК ~ 8 тысяч пар оснований (ТПО), вырезают из геля и агарозу переваривают Gelase^TM ферментом (Epicentre Technologies, Inc. , Madison, WI). Образец лигируют с puC18 (Pharmacia, Inc, Piscataway, NJ), и переваривают HindIII и дефосфорилируют. После трансформации компетентных Е. coli DH5 клеток (Gibco, BRL, Gaithersburg, MD), библиотеку плазмид скринируют на HPV6а-положительные клоны при помощи колоний-гибридизаций, используя антисмысловой ³²Р-меченый олигонуклеотид, который комплементарен 3'-концу HPV6b L1 гена (5'-GAGAGA ТСТ ТАС СТТ ТТА GTT TTG GCG CGC ТТА С-3'; SEQ ID NO: 1). pUC 18 плазмиду, содержащую 8,1 ТПО НРV6а геном, изолируют и характеризуют с помощью фермента рестрикции и Саузерн блот анализов. Эту плазмиду обозначают puC18-HPV6a. Плазмиду ДНК получают, используя набор-Qiagen^TM Plasmid Maxi kit (Qiagen Inc. , Chasworth, CA).

Пример 4
Анализ последовательности рUС18-НРV6а
Для определения полной НРV6а последовательности, синтезируют секвенирующие праймеры на основе опубликованной НРV6b последовательности. Обе цепи полного 8,1 ТПО HPV6а генома секвенируют методом ограничения дидеокси цепи, используя PRISM^TM набор и Applied Biosystems (ABI) автоматизированный секвенатор (# 373А) согласно инструкции производителя (ABI, Inc. , Foster City, CA). В случаях, когда смысловая и антисмысловая последовательность не соответствуют (match), синтезируют дополнительные НРV6а специфические праймеры, чтобы повторно секвенировать в обоих направлениях сверх рассматриваемой области для получения согласованности. В данном случае представлена полная НРV6а последовательность в сравнении с опубликованной НРV6а последовательностью. Основания показанной ниже HPV6a последовательности соответствуют HPV6b последовательности. ДНК последовательности НРV6а и HPV6b демонстрируют свыше 97% идентичность с всего 229 по изменениями, идентифицированными из 8010 по. Наиболее значительные различия по сравнению с HPV6b последовательностью обнаружены в LCR 7205-106. Помимо нескольких изменений простого нуклеотида в НРV6а LCR, обнаружены 94-по вставка при нд 7350 и другая 19-по вставка при 7804. При нд 7615, шесть пар оснований удалены из НРV6а генома.

Пример 5
Вариация НРV6а последовательности (ORFs) по сравнению с HPV6b
Открытые рамки считывания определяют в НРV6а последовательности и основные ORFs транслируют в аминокислотные последовательности и сравнивают с соответствующими НРV6b последовательностями. Основной капсидный белок L1 был единственной ORF, идентичной НРV6b последовательности. Все другие ORFs показывают аминокислотные изменения, которые суммированы в Таблице 1. Минорный капсидный белок L2 показывает пять аминокислотных изменений; Е6 и Е7 ОРГ, каждая, показывают одно аминокислотное изменение. В Е1 белке шесть аминокислот и в Е2 белке 11 аминокислот отличаются. В Е4 белке определено четыре аминокислотных изменения. Е5а ORF имеет изменения в четырех положениях, ORF T5b - в семи положениях.

Пример 6
Суб-клонирование HPV6a кДНК в векторах экспрессии
кДНК, клонирующую HPV6a, суб-клонируют в нескольких векторах для экспрессии HPV6a белка в трансфицированных клетках-хозяевах и для in vitro транскрипции/трансляции. Эти векторы включают pBluescript IISK+ (когда экспрессию проводят при помощи T7 или T3 промоторов), pcDNAI/Amp (когда экспрессию проводят при помощи цитомегаловирусного (CMV) промотора), pSZ 9016-1 (когда экспрессию проводят при помощи промотора с HIV длинным концевым повтором, (LTR)) и вектор переноса бакуловируса pVL193 (когда экспрессию проводят при помощи полиэдринового (PH) промотора) для получения рекомбинантного бакуловируса, содержащего ДНК последовательность, кодирующую HPV6a.

a) pBluescript IISK+: HPV6a. Клон полноразмерной HPV6a кДНК исправляют из лямбда бактериофага путем ограниченного Eco RI переваривания и лигируют в Eco RI-отрезок, CIP-обработанный pBluescript IISK+. Выделяют отдельные субклоны, в которых смысловая ориентация HPV6a следует либо за T7, либо за T3 промоторами.

b) pcDNA I/Amp : HPV6a. Для облегчения направленного клонирования, HPV6a вырезают из очищенного препарата плазмиды pBluescript II SK+: HPV6a, в котором HPV6a ДНК последовательность расположена по ходу (транскрипции) T7 промотора, используя Eco RV и Xba I. Полученный Eco RV, Xba I HPV6a фрагмент очищают и лигируют с фрагментами, полученными перевариванием Eco RV, Xba I, CIP-обработанного pkDNA I/Amp, так, что ДНК, кодирующая HPV6a, расположена по ходу (транскрипции) CMV промотора.

c) pSZ9016-1: HPV6a. HPV6a вырезают из pBluescript II SK+: HPV6a при помощи ограниченного Eco RI переваривания и последующей очистки 1,3 то фрагмента от агарозного геля. Полученный Eco RI HPV6a фрагмент лигируют с фрагментами, полученными перевариванием Eco RI, CIP-обработанного pSZ9016-1. Выделяют субклоны, в которых смысловая ориентация HP 6a расположена по ходу (транскрипции) HIV LTR промотора.

d) pVL1393: HPV6a и pVL1393: HPV6a HA
Направленное клонирование ДНК, кодирующей HPV6a, в бакуловирусный вектор переноса pVL1393, медиируют путем вырезания HPV6a из pcDNA I/Amp: HPV6a с помощью Bam HI и Xba I, затем лигирования полученного 1,3 то фрагмента с фрагментами, полученными перевариванием Bam HI и Xba I, CIP-обработанного pVL1393, получая pVL1393: HPV6a. Аналогично, HPV6a представляет эпитоп, меченый с помощью инженерии T7 метки на 5', амино конце HPV6a открытой рамки считывания и FluHA эпитопа на 3' карбокси конце. HPV6a ДНК, модифицированную таким способом, лигируют в Bam HI/Xba I сайты pVL1393, получая pVL1393: T7 HPV6a HA.

Пример 7
Экспрессия HPV6a полимептида путем in vitro транскрипции/трансляции и путем трансфекции в клетках-хозяевах
Векторы, содержащие HPV ДНК последовательности, используют для проведения трансляции HPV6a полипептида в лизатах ретикулоцитов кролика, клетках-хозяевах млекопитающего, и в клетках насекомого, инфицированного бакуловирусом. Экспериментальные методики, в основном, такие же, как описаны в общих чертах в инструкциях производителей.

a) In vitro транскрипция/трансляция pluescript II SK+: HPV6a плазмидная ДНК (с HPV6a в T7 ориентации) линеаризируют Bam HI перевариванием по ходу HPV6a вставки. Линеаризированную плазмиду очищают и используют в качестве матрицы для управляемой (run-off) транскрипции, используя T7 РНК полимеразу в присутствии m7G(5')ppp(5')G. Полученные кэппированные HPV6a транскрипты очищают LiC1 преципитацией и используют для проведения трансляции HPV6a в предварительно обработанном нуклеазой лизате ретикулоцитов кролика в присутствии L-/³⁵S/метионина.

b) Экспрессия в клетках млекопитающего. HPV6a белок экспрессируют в клетках-хозяевах млекопитающего после трансфекции либо pcDNA I/Amp: HPV6a (под контролем CMV промотора), либо pSZ9016-1: HPV6a (под контролем HIV LTR промотора). В последнем случае (pSZ9016-1: HPV6a), клетки подвергают совместной трансфекции с TAT, экспрессируя плазмиду pSZ90161: TAT. Для обеих HPV6a экспрессирующих плазмид, COS-7 клетки подвергают трансфекции, используя либо DEAE-декстран, либо липофекцию с липофектамином (BRL).

c) Экспрессия в клетках насекомого. HPV6a-содержащий бакуловирусный вектор переноса pVL1393: T7 HPV6a HA используют для получения рекомбинантного бакуловируса (Autographa californica) путем in vivo гомологической рекомбинации. Эпитоп, меченый HPV6, затем экспрессируют в Sf9 клетках (Spodoptera frugiperda) насекомого, выращенных в суспендированной культуре после заражения HPV6a-содержащим рекомбинантным бакуловирусом.

Пример 8
Соединения, которые оказывают воздействие на HPV6a активность, могут быть определены рядом способов. Способ идентификации соединений, которые воздействуют на HPV6a, включает:
a) смешение испытываемого соединения с раствором, содержащим HPV6a, с образованием смеси;
b) измерение HPV6a активности в смеси и
c) сравнение HPV6a в смеси со стандартом.

Соединения, которые воздействуют на HPV6a активность, могут быть формулированы в фармацевтические композиции. Такие фармацевтические композиции могут быть использованы для лечения болезней или состояний, которые характеризуются HP 6a инфекцией.

Пример 9
ДНК, которая по структуре родственна ДНК, кодирующей HPV6a, определяют пробой. Подходящую пробу можно получить из ДНК, имеющей всю или часть нуклеотидной последовательности 2, РНК, кодированной ДНК, имеющей всю или часть нуклеотидной последовательности 2, или вырожденных нуклеотидов, полученных из части последовательности 2.

Изобретение относится к генной инженерии. Предложены экспрессирующие векторы, включающие гетерологичный промотор Т7, Т3, СМV, HIV LTR или РН и нуклеиновую кислоту (НК). НК кодирует белок 6а вируса папилломавируса человека (HPV). Это может быть L2, Е1, Е2, Е4, Е5а, Е5b, Е6 и Е7. Вектор трансформирует дрожжевую клетку-хозяин. Изобретение позволяет разработать профилактическую или терапевтическую вакцину против остроконечной кондиломы. 4 с. и 4 з. п. ф-лы, 1 табл.

1. Экспрессирующий вектор pBluescript II SK+, включающий гетерологичный промотор Т7 или Т3 и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок 6а вируса папилломавируса человека (НРV), такой, как L2, Е1, Е2, Е4, Е5а, Е5b, Е6 и Е7. 2. Вектор по п. 1, трансформирующий клетку-хозяин, такую, как дрожжевую клетку-хозяин. 3. Экспрессирующий вектор pcDNA I/Amp, включающий гетерологичный промотор CMV и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок 6а вируса папилломавируса человека (НРV), такой, как L2, Е1, Е2, Е4, Е5а, Е5b, Е6 и Е7. 4. Вектор по п. 3, трансформирующий клетку-хозяина, такую, как дрожжевую клетку-хозяин. 5. Экспрессирующий вектор pSZ9016-1, включающий гетерологичный промотор HIV LTR и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок 6а вируса папилломавируса человека (HPV), такой, как L2, Е1, Е2, Е4, Е5а, Е5b, Е6 и Е7. 6. Вектор по п. 5, трансформирующий клетку-хозяин, такую, как дрожжевую клетку-хозяин. 7. Экспрессирующий вектор pVL1393, включающий гетерологичный промотор РН и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок 6а вируса папилломавируса человека (НРV), такой, как L2, Е1, Е2, Е4, Е5а, Е5b, Е6 и Е7. 8. Вектор по п. 7, трансформирующий клетку-хозяин, такую, как дрожжевую клетку-хозяин.