Фаговый вектор замещения @ К15 для конструирования библиотек структурных генов к ДНК Советский патент 1991 года по МПК C12N15/63 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии.

Целью изобретения является уменьшение затрат труда и ускорение генно- инженерных процедур для получения репрезентативных библиотек структурных генов (кДНК) и их дальнейшего использования.

ASK15 - фаговый вектор для конструирования библиотек структурных генов (кДНК) по участкам узнавания рестриктаз Ват 1 и EcoR 1. Вектор можно также использовать для специального клонирования генов. Размер ASK15 около 51,2 т.п.н. Емкость вектора от 0,2 до 15,4 т.п.н. ASK15 состоит из ДНК фага ASK9, в который введен инактивиро- ванный ген устойчивости к канамицину, вы- щелленный рестриктазой sal 1 из плазмиды pHC4K(Virira I., Messing I, Gene, 1982, v. 19. p. 259-268) размер 1,5 т.п.н., со встроенным в него участком ДНК фага 1 размером

2.0т.п.н, выщепляемый рестриктазой Hind III (23130 н - 25157 н .).

Хозяевами могут служить штаммы Е. coli, используемые при работе с Agt 11, AEMBL 3, AZAP, рИС 18, mp 18 и др., в том числе: LE 392 F1, hsdR 514 (гк, тк), sup E 44, sup F 58, lac Y 10 Z (lac 1 Z.Y) 6, gal K2 gal T22, met В1, trp R55; R 359 hsd RK, hsd МЛ sup F, Ф80, P2. Этот вектор обладает максимальной, известной для векторов этого класса емкостью и позволяет получать библиотеки кДНК как по стандартному методу, так и с использованием частичной достройки липких концов без применения метилаз. ASK15 дает возможность перевода вставки в плазмидную и одноцепочечную формы, при этом используется способ, принципиально отличный от AZAP. Применение этого метода позволяет перевести вставку в плазмидную форму быстрее (3-4ч), и кроме того, перевод происходит значительно эффективнее и стабильнее. Для библиотек в

Ё

О- СП

о а ю о

ASK15 гарантированы невозможность неконтролируемого перевода вставки кДНК в фаге Я в одноцепочечную форму. Вектор дает возможность проводить селекцию в поль- зу истинно рекомбинантных фагов перед 5 исходными и фальшивыми рекомбинанта-4 мй. В библиотеках, полученных вА5К15, легко оценить процент рекомбинантных фагов по фенотипу. Селективное давление при конструировании в нем библиотек кДНК на- 10 правлено в отличие от других векторов не в сторону маленьких вставок, а, наоборот, в сторону крупных (2-8 Т.п.н.). кДНК в этом векторе может быть экспрессирована, причем трансляция может проходить в строго 15 контролируемых условиях при наличии в штамме Е. coll мутации sup С или sup G, sup V, sup В.

Способ конструирования вектора ASK15 заключается во введении в фаг ASK9 фраг- 20 мента ДНК размером 3,5 т.п.н., состоящего из инактивированного гена устойчивости к канамицину из pUC 4K со встроенным в него участком ДНК фага Я (участок 23130-25157 н.).

Стадия 1. Получение плазмиды р4К4-1 25 ДНК плазмиды pUC 4K гидролизуют ре- стриктааой Hind HI и останавливают реакцию прогреванием 15 мин при 65°С, Затем ДНК фага Я расщепляют также Hind III и фрагмент размером 2,0 т.п.н. очищают 30 гель-электрофорезом в 0,7%-ной легкоплавкой агарозе (slgma). Очищенный фрагмент смешивают в зквимолярных концентрациях pUC 4K, разрезанной Hind III, и лигируют. Цитированной ДНК трансформируют клет- 35 ки Е. colt штамм j.M.109, которые высевают на L-arap с антибиотиком - ампициллином. С выросших колоний снимают отпечаток на нитроцеллюлозный фильтр и проводят гибридизацию с меченой32Р ДНК фага Я. Из 40 шести гибридизующихся колоний клетки наращивают в 10 мл L-среды с ампициллином и выделяют ДНК щелочным лизисом. 0,5 мкг ДНК расщепляют рестриктазами EcoR 1, Bam 1, sal 1, Hind III и анализируют 45 электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Одна из плазмид обладает прогнозируемой рестриктазной картой, одну из них, названную p4KL-1, используют на следующей стадии.50

Стадия 2. Конструирование фагаЯдЗКб. ДНК плазмиды p4KL-1 гидролизуют ре- стриктазами EcoR 1 и sal 1 и реакцию останавливают прогреванием 15 мин, при 65°С. ДНК фага ЯдЕ57 расщепляют рестрйктазой 55 sal 1 и фермент инактивируют прогреванием 15 мин при 65°С. Оба препарата смешивают в эквимолярных соотношениях и лигируют. Лигированную ДНК упаковывают в белки

фага in vitro и полученные фаговые частицы рассевают на газон клеток E.coli штамм LE392. С чашки Петри снимают отпечаток на нитроцеллюлозный фильтр и проводят гибридизацию с меченым32Р фрагментом ДНК pUC4K, содержащим ген устойчивости к канамицину и выщепленным из плазмиды рестрйктазой sal 1. Из шести гибридизующихся бляшек наращивают фаг, выделяют ДНК и анализируют с помощью рестриктаз EcoR 1, Bam 1 и sal 1. Все фаги содержат инактивированный ген устойчивости к канамицину и один из них (AgSK5) используют для конструирования ASK15.

Стадия 3. Конструирование фага-вектора ASK15.

ДНК фага AEMBL 3 гидролизуют рестрйктазой Ват 1 и вставочный фрагмент размером около 13,7 т п.н очищают гель- электрофорезом в 0,7%-ной легкоплавкой агарозе. ДНК фага ASK5 гидролизуют рестрйктазой Ват 1 и фермент инактивируют прогреванием 15 мин при 65°С. Оба препарата смешивают в эквимолярных соотношениях и лигируют. Лигированную ДНК упаковывают In vitro в белки фага и полученные фаговые частицы рассевают на газон клеток Е. coli штамм LE392. Выросшие бляшки перекалывают на газон клеток Q 359, лизогенных по фагу Р2. Вставочный фрагмент из Л EMBL 3 обеспечивает spl+ фенотип, т.е. невозможность размножаться на клеткахЕ, coli, лизогенных по фагу Р2. Поэтому из шести бляшек, не выросших на Q 359, наращивают фаг, выделяют ДНК и анализируют с помощью рестриктаз EcoR 1, Bam 1 и sal 1. Два из них имеют ожидаемую структуру и названы ASK15A и Я5К15В.

Применение ASK15. Фаг вектор ASK15 используют для получения библиотек кДНК по стандартной методике с использованием EcoR 1 -участка. Для элиминации нереком- бинантных и фальшивых рекомбинантов рассевают фаги на газон Е, coli Q 359. поскольку ни исходные, ни фаги, содержащие вставку, соединенную с линкером, не будут размножаться на этих клетках. Фаги, образованные соединением плечей ЯЗК15 с линкером(ами), нежизнеспособны из-за малой длины ДНК на любых штаммах Е. coli. Минимальный размер ДНК, способной давать жизнеспособные частицы фага, 37,7 т.п.н., а размер плечей Я5К15 37,5, т.е. меньше минимального на 0,2 т.п.н., причем ясно, что встраивание даже многих копий линкеров не приведет к существенному изменению длины ДНК и образованию жизнеспособных фальшивых рекомбинантов. При этом будет также практически исключено образование частичных рекомбинангов, т.е. фагов, содержащих как исходную вставку, так и вставку кДНК, так как размер А5К15(около51,2т.п.н.)близокк максимальному для фага А (около 52,9 т.п.н ). Эффективность этого метода повышается, если предварительно очистить плечи ASK15 электрофорезом или центрифугированием от вставочного фрагмента. Для конструирования библиотек кДНК по EcoR 1 участку используют ASK15 не в виде Я фага, а в виде дифазмиды, содержащей только плечи ASK15 и поэтому не способной к эффективной упаковке в белки фага А из-за недостаточной длины. Для получения дифазмиды расщепляют ДНКА5К15 рестриктазой EcoR 1 и проводят самолигирование при низкой концентрации ДНК, обеспечивающей образование в основном кольцевых, а не конкатемерных форм Этой ДНК трансформируют клетки Е. coli, не дающие возможности проходить полный лигический цикл фагу А (например, штамм НВ101). Очевидно, что при конструировании библиотеки генов в этой дифазмиде все жизнеспособные фаги будут рекомбинантными. В этой форме ASK15 напоминает векторы-фазмиды ApMYF131 nApSL51.

Однако более удобно использовать ASK15 для конструирования библиотек кДНК с использованием Ват 1 участка. Дву- цепочечную ДНК синтезируют по обычной методике, однако обрабатывают не EcoR 1, а Ват 1 метилазой (или dam-метилазой). Затек к ней пришивают Ват 1-линкеры и обрабатывают рестриктазой Ват 1 (или МЬо г). ДНК ЯЗК15 гидролизуют одновременно рестриктазами Ват 1 и EcoR 1, После остановки реакции прогреванием 15 мин при 65°С проводят очистку от олигонукяео- тидных линкеров Ват 1 - EcoR 1 осаждением ПЭГ-6000. В результате плечи содержат липкие концы Ват 1, а вставочный фрагмент - EcoR 1 и, таким образом, образование исходного фага при лигирова- нии возможно только за счет остаточных линкеров Ват 1 - EcoR 1, причем эта реакция более высокого порядка, чем образование рекомбинантного фага. Поэтому при получении библиотеки кДНК по этому методу опускают пассирование библиотеки на Е. coli Q 359.-Ясно, что и в этом случае фальшивые рекомбинанты нежизнеспособны.

Использование участка Ват 1 в ASK15 для получения библиотек кДНК позволяет объединить преимущества двух методик - с использованием техники частичной достройки липких концов и конструирование библиотек без применения метилаз. К кДНК

пришиваются линкеры sal 1 (или Xho 1) без предварительной обработки метилазой Поскольку рестриктаза sal 1 щепит эукариоти- ческую ДНК редко (один участок узнавания

на 50 т.п.н } и преимущественно в регуля- торных областях, которые не представлены в кДНК, то последующий гидролиз кДНК рестриктазой sal 1 не приведет к существенному изменению размеров кДНК После

инактивации фермента проводят в соответствующей инкубационной среде частичную достройку липких концов ДНК фрагментом Кленова (или ревертазой) в присутствии d СТР и d TTP ДНК ASK15 гидрслизуют рестриктазами EcoR 1 и Ват 1 и затем проводят частичную достройку липких концов ДНК с помощью фрагмента Кленовэ или ре- вертазы в присутствии d Al Pud GTP 06s препарата смешивают и лигируют, причем

лигирование в данном случае можег юпько в одном направлении кДНК пипюуе я с векторной ДНК, так как сзмолигирсаанке и векторной и кДНК невозможно Исгюььзуч стандартные методы, легированную ДНК

упаковывают in vitro в белки фага Я и полученными фаговыми частицами заражают клетки Е coli штамм I E392 Сравнение этой методики с конструированием библиотек кДНКс использованием частичной достройки липких концов в других векторах (. Я5К12 ;.gt18/19;:gt22.AZAP) позволяв сделать вывод, что -ISK15 наибочзе сдобен из них.

Синтез специального линкера ппзг-оляет обойтись без метилирования кДНК и ее дальнейшее гидролиза рестриктазой, ч го еще больше облегчает конструирование библиотеки. Особенно это удобно при использовании последней схемы, поскольку

отпадает необходимость частичной достройки липких концов.

В ASK 5 можно конструировать и направленные библиотеки кДНК с использованием двух рестриктаз (пары EcoR 1 - Xba

1, sac 1 - Bam 1 и др.

Экспрессию кДНК вЯ5К15 осуществляют также, как и в других векторах с использованием lac-промотора (Ядт 11, /ISK11, /ZAP ит.д.), однако эффективная трансляция этой

мРНК может осуществля гься только в строго контролируемых условиях при наличии (или введении плазмиды, несущей соответствующий ген) в клетках Е. coli мутации sup С и/или sup G, sup В, sup V. Это связано с

тем, что через 6 триплетов после инициирующего кодона AYG встроен терминирующий кодон YAA (охра), действие которого супрессируется мутациями sup С, supG, sup V, sup В. Таким образом, конструирование

библиотеки кДНК в ASK15 позволяет избежать неконтролируемой экспрессии кДНК, что приводит к повышению репрезентативности этой библиотеки. Следователь- HO.ASK15 представляет собой в этом отношении новый тип векторов для получения библиотек структурных генов(кДНК, поскольку в зависимости от используемого штамма E.-coli он может быть как экспрес- сирующим,та;с и не экспрессирующим и поэтому объединяет достоинства обоих видов векторов.

При конструировании библиотеки кДНК в ASK15 можно осуществлять и неконтролируемую экспрессию, как в других экспресси- рующих векторах. Для этого достаточно в линкер, присоединяемый к кДНК, ввести ко- дон АТС. При этом транслируемый белок практически лишен дополнительных, чужеродных аминокислот.

Вставка кДНК B/ISK15 может быть легко переведена в плазммдную форму. При этом используется иной принцип, чем в AZAP. ДНК рокомбинанта ASK 12 частично гидро- лизуют рестрикгазой sal 1 (можно применять также 1) и инэктивируют фермент .трехкратным замораживанием/оттаиванием. Обе рестриктазы достаточно редко расщепляют эукариотическую ДНК, причем эти участки сосредоточены в основном в регуля- торных областях, которые отсутствуют в кДНК. Затем ДНК разбавляют и самолиги- руют. Цитированную ДНК вводят в компетентные клетки Е. coli, которые высевают на L-arap с ампициллином. Выросшие колонии содержат вставку кДНК в плазмидной форме, причем плазмида либо вовсе не содержит нуклеотидных последовательностей фага А (в случае sal 1), либо небольшую их часть (в случае Da 1). Процесс перевода в плазмидную форму быстр (3-4 ч) и эффективен. 0,1 мкг ДНК рекомбинанта дает много сотен и тысяч колоний. При необходимости для специальных экспериментов как фаг ASK15, так и его рекомбинанты, могут быть переведены в плазмидную форму и по другому методу, В этом случае достаточно адсорбировать фаг на клетках- E.coll, резистентных к размножению фага А (например, НВ101, j.M.109, Q 359) в течение 5-10 мин при 0-37°С и рассеять клетки на газон с ампициллином. В этом случае, однако, плазмида содержит и все нуклеотидные последовательности фага А, присутствующие в SK12. С другой стороны, такая плазмида может быть легко переведена в форму фага А, что может быть полезно для специальных целей.

При суперинфекции клеток Е coli, содержащих плазмуду, фагом М 13 ДНК плаз- миды упаковывают в белки фага в одноцепочечной форме, удобной для секвенирования по известному методу Сэнгера. Другое преимущество ASK15, связанное с тем, что это вектор замещения, заключается в том, что при конструировании в нем библиотек кДНК давление отбора направлено

на клонирование более крупных вставок кДНК (2-8 т.п.н.), а не мелких, как во всех других векторах этого класса, являющихся векторами включения. Емкость ASK15 - до 15,4т.п.н., что достаточно для клонирования

полных копий мРГК практически всех генов.

Процент рекомбинантов в библиотеке,

полученной в ASK15, легко определить по

фенотипу, перекалывая бляшки на газон Q

359 или используя двойной газон

LE392/Q359. При перекапывании на газон Q 359 не рекомбинажные фаги не размножаются, а рекомбинантные размножаются. Однако перекалывание довольно трудоемкий процесс, а прямой посев фагов на газон

Q 359 может привести к артефактным результатам. Разработанная нами техника двойного газона позволяет преодолеть эти недостатки. В этом случае анализируемые фаги инкубируют с клетками Е. coli штамм

LE392 и после добавления 0,6%-ного L-ara- ра высевают на чашки Петри. Поверх этого газона высевают газон клеток Q 359 также в 0,6%-ном L-arape. При этом рекомбинантные фаги дают прозрачные бляшки, а не

рекомбинантные - мутные, что легко детектируется визуально.

Таким образом, фаг ASK14 - единственный вектор замещения, который можно использовать для конструирования библиотек

кДНК.

Основные достоинства этого вектора заключаются в возможности получения библиотек как по стандартным, так и по новым методикам, в том числе, с использованием

частичной достройки липких концов и без применения метилаз, возможности использовать для клонирования рестриктазу Ват 1, объединяет достоинства экспрессирую- щих и не экспрессирующих векторов и может быть использован з зависимости от штамма Е. coli как в виде экспрессирую- щего, так и в виде не экспрессирующе- го, фенотипическом определении доли рекомбинантных фагов, минимальной (до

15,4 т.п.н.) емкости среди векторов этого класса, возможности биохимической и генетической селекции против исходных, не рекомбинантных фагов, наличии эффективного механизма элиминации как фальшивых.

так и частичных рекомбинантов, возможности быстрого, эффективного и контролируемого перевода в плазмидную форму, свободную от плечей фага, возможности перевода в одноцепочечную форму для определения первичной структуры по методу Сэнгера, гарантированное™ невозможности неконтролируемого перевода вставки кДНК в в одноцепочечную форму, возможности специфического мечения как 5-, так и З -концов вставки кДНК с использованием стандартных, коммерчески доступных препаратов затравок.

П р и м е р 2. Клонирование в ASK15 фрагментов геномной ДНК человека.

3 мкг ДНК человека расщепляют ре- стриктазой Ват 1 в стандартных условиях и инактивируют фермент прогреванием 15 мин при 65°С. 3 мкг ДНКА5К9 гидролизуют рестриктазами Ват 1 и EcoR 1 и инактиви- руют ферменты прогреванием и очищают от олигонуклеотидных линкеров осаждением ПЭГ-6000.

Оба препарата смешивают (весовое соотношение ДНК вектора и геномной ДНК 2:1) и проводят лигирование при суммарной концентрации ДНК 250 мкг/мл. 1 -10 мкг лигированной ДНК упаковывают в белки фага In vitro и 1/500 полученных фаговых частиц рассевают на газон Е. coll штамм LE329. При переколе 50 бляшек на газон Q 359 только одна из них не выросла, таким образом, рекомбинантные фаги составляют свыше 95%.

Из шести случайно отобранных бляшек С газона LE392 в 10 мл L-среды с LE392 были выращены фаги и выделена из них ДНК. Электрофоретический анализ ДНК показал, что все они рекомбинанты и содержат вставку ДНК от 4 до 7 т.п.н. 0,5 мкг ДНК одного

из них (№ 1) гидролизуют в течение 30 мин 1 ед. рестриктазы sal I. Фермент инактивируют трехкратным замораживанием/оттаиванием. ДНК разводят и лигируют при

комнатной температуре в течение 1 ч. 0,1 мкг лигированной ДНК добавляют к компетентным клеткам Е. coli штамм j M 109, инкубируют 10 мин, при 0°С, затем 5 мин при 38°С и после добавления 1 мл L-среды

еще 45 мин при 37°С. Затем 0,2 мл клеток рассевают на L-arap с ампициллином (25 мкг/мл). Из трех колоний в 10 мл L-среды с ампициллином (50 мкг/мл) наращивают клетки и выделяют ДНК щелочным

лизисом. Электрофоретический анализ ДНК показывает, что плазмиды содержат ту же вставку ДНК, что и исходный фаг № 1

Формула изобретения Фаговый вектор замещения ASK15 для конструирования библиотек структурных генов кДНК размером 51,2 т.п.н., содержащий ДНК фага ASK9 размером 47,7 т.п.н.; sal 1 - фрагмент плазмиды рИС4К размером 1,5 т.п.н.; встроенный в sat 1 участок размером 20,3 т.п.н. ДНК фагаА5К9; Hind III - фрагмент фага Д. размером 2,023 т.п.н. (23130 н. - 25157 н.), встроенный в Hind III участок sal 1 - фрагмент плазмиды рИС4К; места вставки чужеродного фрагмента EcoR 1 и Bam H 1; емкость вектора 0,2- 15,4 т.п.н,; спектр хозяев; хозяевами могут служить штаммы Е. coll, используемые при работе с Agt 11.AEMBL 3. /IZAP, рИС 18, mp 18 и др., в том числе;

LE 392 F1, hsd R 514 (г. m). skp Е 44, sup F 58, lac Y 1 OZ (lac 1Z Y) 6, gal К 2, gal Т 22, met В 1, trp R 55. Q 359 hsd RK. hsd MK+. skp F, Ф60. P 2.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии Целью изобретения является создание вектора на основе фагаА-i, сочетающего свойства как экспрессирующих, так и неэкспрессирующих векторов, а также повышение эффективности перевода вс-тзвки в плазмидную и одноцепочечную формы. Способ заключается в том. что в вектор ASK 9 встраивают sal 1 фрагмент плазмиды риС4К, в которую встроен Hind III - фрагмент фага А