Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS, используемый для получения энтомопатогенных препаратов Советский патент 1989 года по МПК A01N63/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения энтомопатогенных бактериальных препаратов, а именно нового штамма бактерий для их получения Вас.thuringien- sis.

Цель изобретения - создание нового штамма бактерий Bacillus thuringi- tnsis var. kurstaki, обладающего устойчивостью к фагам, наиболее часто поражающим культуру в производственных условиях, и сохраняющего продуктивность на уровне известных штаммов .

Штамм бактерий Bacillus chuiingi- ensis var. kurscaki получен обратной

N-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидином в концентрации 50 мкг/мл при З7 с и ;послед тощей селекции на фагоустойчи- Бость, в результате чего был выделен штамм Bacillus churingiensis var. kurscaki Z-86.

Штамм депонирован во Всесоюзнск коллекции промьшшенньгх микроорганизмов Всесоюзного научно-исслелоялтел,- ского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов под коллекционным номером ВК1Ш-15-3827 .

Полученный штамм характеризусп-ся следующими свойствами,

Морфолого-культуральные спойс-1 м,1.

СП

00

ел

со

Аэроб. Грамположнтелен. Вегетатип- ные клетки - крупные палочки с закругленными концами, расположенные одиночно, парами или цепочками. Цепочки короткие. Размер клеток составляет (1,7-1,9)х(3,5-6,9) мкм. Морфологической особенностью является наличие в одном спорангии двух белковых патогенных для насекомых параспоральны включений - кристалл-токсинов ромбовидной и квадратной формы с четкими гранями.

Указанная форма клеток характерна для любой твердой питательной среды: агар Хоттингера; MIIA, пептоно-куку- рузный агар. Штамм Вас.churingiensis var. kurscaki Z-86 хорошо растет при 28-37 с, оптимальная температура .

Мясопептонный бульон. Образует сплошную пленку, гладкую, рыхлую, опадающую через 48-72 ч. Рост умеренный.

Желточная среда. Образует колонии R-формы, крупные, плоские с шероховато-матовой поверхностью, маслянистой консистенции, белого цвета. Рост обильный. Лицетин белка не расщепляе

Ломтики картофеля. Образует колонии R-типа, крупные, плоские с шероховатой матовой поверхностью, маслянистой консистенции. Рост обильный. Пигмент не образует,

Молочный агар. Образует колонии R-формы, крупные, с шероховатой матовой поверхностью, маслянистой консистенции. Колонии белого цвета, вокруг которых образуетсячзона просветления до 20 мм. Рост обильный.

Пептоно-кукурузный агар. Образует колонии R-формы, крупные, плоские с шероховатой матовой поверхностью ,маслянистой консистенции, с ветвистым краем. Рост обильный,

Кровяной агар. Образует колонии R-формы, крупные с ветвистым краем. Поверхность шероховатая, матовая, малянистой консистенции, белого цвета. Вокруг колонии образуется светлая прозрачная зона гемолиза до 20 мм. . Рост обильный. Возраст культуры при описании колоний на твердых средах 24 ч,

Физиолого-биохимические свойства.

Дает положительную реакщпо Фельге на, выделяет в культуральную жидкость протеазу, обладающую казеиноли тической активностью 90x10 протеол

0

5

0

5

0

35

40

45

0

5

ед./мл, фибринолитической активностью 800 усл.ед,/мл, а гемолитической активностью (гемолиз типа Ь) ,

Для определения гемолитической способности применяли Мясопептонный агар с добавлением 5% дефибринированной крови. Гемолиз (лизис эритроцитов) узнавали по образованию светлой прозрачной зоны вокруг выросшей колонии или штриха. Гемолитическую активность выражали в миллиметрах радиуса зон просветления.

Фибринолитическую активность оценивали по величине зоны лизиса фибрина, oбpaзyюp eйcя при помещении фиб- риновой пластинки в термостат при температуре 37°(; на 3 ч, и выражали в условных единицах в пересчете на 1 мл культуральной жидкости. Одна условная единица равна зоне лизиса в 10 мм, В работе использованы фибриноген, фибринолизин и плазма крови.

Казеинолитическун) активность определяли на молочном агаре.

Не способен к образованию лецитина зы .

Отношение к исч очникам углерода.

Использует глюкозу, ци срат, декстрозу, эскулин, салицин, лобиозу, мальтозу, кукурузный и картофельный крахмал, соевую и кукурузную муку, кукурузный экстракт.

Не использует лактозу, арабинозу, рамнозу, глицерин, сахарозу, маннозу, маннит, ксилозу.

Отношение к источникам азота.

Усваивает нитратные и аммонийные формы азота.

Органические ис гоч))ики азота, используемые данным микроорганизмом: пептоны (продукты перенаривания мяса и казеина); мясные, рыбные и растительные зкстракты (кукурузный, дрожжевой и др.) или настои; мука из семян хлопчатника, соевая, кукурузная, рыбокостная; атолизаты дрожжей и казеина; гидролизаты (из соевых бобов, кукурузной и осевой муки); кормовые дрожжи (БВК); кровь крупного рогатого скота; мясная вода; мочевина. Нитриты восстанавливают молоко. Пептони- цирует желатину, не разжижает крахмал, гидролизует ан шгенные свойства.

Относится к HI се.ро снпу. (11 За И Зв) , Не продуиируе 1 1 ерм(1стаб|1льный S-зкзотоксии. IlarfirfMifiH д.пя многих насекомых отрп.ил n M:yeKpiiijn..

Не отличаясь по перечисленным свойствам от известного, штамм характеризуется устойчивостью к ряду фагов, наиболее часто поражающих куль- туру в производственных условиях, которые имеют удлиненный капсид и структуру типа воротничка, расположенную между капсидом и коротким отростком. Подобные фаги выделены из фаголиза- тов. Эта группа фагов широко распространена и дает высокий относительный урожай (титр фага из одной негативной колонии) - до 9,0x10 фаговых частиц/мл, а также высокий абсолютный урожай: при размножении на чувствительной культуре титр достигает 1,0х х10 фаговых частиц/мл (БОЕ/мл). Длл определения устойчивости к фагам на чашку Петри с нижним слоем - средой Хоттингера (2%), выливают 0,3 мл агаризованной (0,7%) солевой среды и 0,1 мл испытуемой культуральной жидкости (3,5 ч б .Хоттингера). После то

сят препарат фага (концентрация фага не ниже 1 10 ). Наличие или отсутствие зоны лизиса свидетельствовало о чувствительности или устойчивости испытуемого варианта (штамма) к данному фагу.

Сравнительная характеристика штамма Bac.churingiensis var. kutscaki ii-86 и известного штамма Вас. churin- giensis var. kurscaki Z-52 приведена в следующей таблице.

Таким образом, представленные данные показьшают, что штамм Вас. thu- ringiensis var. kurstaki Z-8b не отличается от известного по продуктивности и биологической активности, но дополнительно фагоустойчив.

Пример. В параллельном опыте в 20 колб емкостью 750 мл было внесено по 30 мл среды, содержащей, г/л кормовые дрожжи 20,0; кукурузную муку 15,0; воду остальное. До стерилизации рН среды 7,-7,6. Половина колб засевают штаммом Вас. churingiensis var. kurscaki Z-86, a остальные ,. ю

5

01396

штаммом Вас. thuringiunsis var. kurscaki Z-.S2. Посевная доза составляет 1% к объему. Культивирование осуществляют в одинаковых условиях при температуре 30+1°С и при скорости вращения качалки 300 об/мин.После 22 ч культивирования средний титр спор составляет 3,81±(), 19 для штамма Вас.churingiensis var, kurscaki Z-8b и 3,74+0,20 для штамма Bac.churingiensis var. kurscaki Z-52.

Споруляция культуры на производственной дрожжеполисахаридной среде (ДПС) начинается 16-18 ч, автолиз - 21-22 ч.

Биомасса, выращенная на ферментационной питательной среде, состоит из 70% спор и 30% параспоральных кристаллов.

Биопробы на насекомых (биологическая оценка) определяют на гусеницах . второго возраста трех видов чешуекрылых вредителей: непарном шелкопряде, капустной совки и пчелиной огневки. Культивирование насекомых и постановку опытов проводят на специальных искусственных питательных средах. Инсектицидную активность бацилл определяют по интенсивности гибели опытных гусениц при свободном поглощении зараженного корма. Количество погибших гусениц с пересчетом на контроль подсчитывают на 5-е сут. (в процентах и в миллионах спор на миллилитры) рассчитывают по формуле Кербера в модификации Ашмарина и Воробьева.

70

25

30

35

Практическое использование штам- ма позволяет сократить потери, имеющие место в результате лизиса культуры наиболее распространенными в производстве фагами.

45 Формул

изобретения

Штамм бактерий Bacillus churingi- ensis var. kurscaki BKIIM B-3827, используемый для получения энтомопато- генных препаратов.

Примечание, Знак + означает чувствительность к фагу. Знак - означает устойчивость к фагу. Состав среды следующий, нас.Х: кормовые дрожжн 2,0; кукурузная мука t,S; вода остальное.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения энтомопатогенных бактериальных препаратов, а именно нового штамма бактерий BACILLUS THURINGIENSIS для их производства. Цель изобретения - создание нового штамма бактерий BACILLUS THURINGIENSIS VAR. KURSTAKI, обладающего устойчивостью к фагам, наиболее часто поражающим культуру в производственных условиях и сохраняющего продуктивность на уровне известных штаммов. Штамм бактерий BACILLUS THURINGIENSIS подвида KURSTAKI получен из штамма B. THURINGIENSIS подвида KURSTAKI Z-52 в результате мутагенной обработки нитрозогуанидином. Ему присвоен N Z-86. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов под коллекционным номером ВКПМ В-3827. Штамм не отличается от известного по продуктивности, токсичности для насекомых, и фагоустойчив к фагам К, Э, Т_Д18, Т_Д 81, Т_Д 20 Т_Д 101. 1 табл.