СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ "ДИАГНОСТИКУМА ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ КУЛЬТУРАЛЬНОГО, ПОЛИВАЛЕНТНОГО ДЛЯ НЕПРЯМОГО МЕТОДА ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ" Российский патент 2011 года по МПК G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к области вирусологии, в частности к способу получения тест-систем, предназначенных для специфической диагностики вирусных инфекций, а именно инфекции геморрагической лихорадки с почечным синдромом.

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - острое, вирусное заболевание зоонозной природы, характеризующееся системным поражением мелких кровеносных сосудов, геморрагическим диатезом и своеобразным поражением почек, высоким уровнем заболеваемости, тяжелым течением (нередко с летальным исходом) и стойкой потерей трудоспособности. Отсутствие специфических средств лечения и профилактики обусловливают высокую социальную и медицинскую значимость ГЛПС как в России, так и во многих странах мира.

Случаи заболевания ГЛПС регистрируются в 57 административных регионах Российской Федерации и составляют ежегодно 8-10 тысяч больных, в целом по стране.

Возбудители ГЛПС - вирусы Пуумала, Хантаан, Сеул и Добрава - относятся к роду Хантавирус (семейство Буньявириде), который включает в настоящее время более 30 различных хантавирусных серотипов или генотипов. К ним относятся не только патогенные для человека хантавирусы, но также вирусы с неустановленной к настоящему времени эпидемиологической значимостью. Переносчиками хантавирусов и источником заражения людей являются дикие мышевидные грызуны. К настоящему времени доказана этиологическая роль хантавирусов в структуре заболеваемости ГЛПС: вирусы Пуумала и Добрава вызывают заболевание у людей на территории европейской части России и в странах Европы, а вирусы Хантаан и Сеул - в российских регионах Дальнего Востока и странах Азии. То есть под одним названием «ГЛПС» регистрируются, по крайней мере, четыре этиологически самостоятельные хантавирусные инфекции. Становится все более очевидной зависимость клинических и эпидемиологических проявлений этих инфекций от их этиологической обусловленности, выражающейся принадлежностью возбудителя к определенному хантавирусному генотипу или серотипу. Кроме того, не исключено, что другие известные и еще не известные хантавирусы могут проявлять в определенных условиях вирулентные для человека свойства и вызывать новые клинические формы хантавирусной инфекции. В связи с вышеизложенным, проблема заболеваемости хантавирусными инфекциями, вызываемыми разными вирусами, приобретает особую важность для здравоохранения в плане проведения эффективной диагностики, лечения и профилактики этих инфекций. Выраженные иммунологические различия между вирусами-возбудителями хантавирусных инфекций создают трудности, связанные с их специфической диагностикой. Для решения этой проблемы необходима разработка и применение универсальных тест-систем, способных выявлять и идентифицировать не только известные к настоящему времени, но и новые, ранее неизвестные вирусы-возбудители хантавирусных инфекций у больных людей и животных.

В настоящее время для серологической диагностики ГЛПС фирмой PROGEN, Гейдельберг, Германия производятся антигенные препараты, которые, в отличие от предлагаемого Диагностикума ГЛПС, представляют собой моновалентные антигены 3-х хантавирусов Пуумала, Хантаан и Сеул. Существенным недостатком применения таких антигенов в сочетанных очагах циркуляции одновременно нескольких хантавирусов является необходимость использования для определения антител в одной пробе сыворотки крови больного ГЛПС параллельно трех моновалентных антигенов. 3-этапная процедура исследования приводит к значительному увеличению как числа манипуляций, так и продолжительности постановки опытов и, соответственно, повышает стоимость диагностического обследования больных. Кроме того, фирма PROGEN не выпускает диагностикум для выявления ГЛПС, вызываемой хантавирусом Добрава, который является широко распространенным возбудителем ГЛПС в европейских очагах инфекции.

Принцип действия предлагаемого изобретения основан на специфическом иммунохимическом взаимодействии антигенов хантавирусов с антителами к этим вирусам. Визуализация антихантавирусных антител, связавшихся с антигеном, осуществляется с помощью антивидовых антител, меченных флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Результат регистрируется с помощью флюоресцентного микроскопа.

Процесс получения диагностикума включает: репродуцирование хантавирусов разных серотипов в перевиваемой культуре клеток VERO, сбор клеток, содержащих антиген, нанесение таких клеток на предметное стекло и фиксирование их ацетоном. Для получения диагностикума используют штаммы хантавирусов: Пуумала (штамм ПУУ-ТКД/VERO), Добрава (штамм ДОБ-EAT-VERO), Хантаан (штамм Уссури-4590) и Сеул (штамм СК-515/Грузия-88), вызывающие ГЛПС в странах Европы и Азии.

Краткое описание изобретения

Изобретение касается способа получения диагностикума для специфической диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом, представляющего собой поливалентный антигенный препарат, путем репродуцирования четырех хантавирусов: Пуумала (штамм ПУУ-ТКД/VERO), Добрава (штамм ДОБ-EAT-VERO), Хантаан (штамм Уссури-4590) и Сеул (штамм СК-515/Грузия-88) в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки, линии VERO, проверки на содержание вирусспецифического антигена, получения поливалентного антигена, фиксации антигена на предметном стекле и обработки ультрафиолетовым облучением. При достижении 90% и более клеток, содержащих антиген, используют смесь суспензий клеток, инфицированных вирусами Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул и незараженных клеток VERO, объединенных в соотношении 2:1:1:1:1.

Также изобретение касается набора для диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом, включающего: а) поливалентный антигенный препарат, полученный путем репродуцирования четырех хантавирусов Пуумала (штамм ПУУ-ТКД/VERO), Добрава (штамм ДОБ-EAT-VERO), Хантаан (штамм Уссури-4590) и Сеул (штамм СК-515/Грузия-88) в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки, линии VERO, проверки на содержание вирусспецифического антигена, получения поливалентного антигена, фиксации антигена на предметном стекле и обработки ультрафиолетовым облучением; б) три контрольных образца, представляющих собой 2 положительных образца - по одной ампуле с сыворотками крови, содержащими антитела, взаимодействующие с антигенами хантавирусов Хантаан, Добрава и Сеул, и антитела, взаимодействующие с антигеном хантавируса Пуумала, а также 1 отрицательный образец - ампула с нормальной сывороткой, не содержащей антител к хантавирусам; в) люминисцирующую сыворотку против глобулинов человека (например, производства Института им. Н.Ф.Гамалеи), обработанную для контрастирования фона раствором Эванса голубого.

Антиген может быть нанесен на предметные стекла по 6 пятен в 2-х рядах для экспресс-диагностики спорадической заболеваемости ГЛПС, когда необходимо обследовать только одного большого или по 7 пятен в 3-х рядах при экспресс-диагностике крупных вспышек заболеваемости ГЛПС, когда необходимо обследовать одновременно многочисленную группу больных.

Подробное описание изобретения.

Более подробно получение диагностикума осуществляют следующим образом. Выращивают культуру клеток VERO в однолитровых роллерных бутылях в среде Игла MEM с двойным набором витаминов и аминокислот и 5% сыворотки крови плодов коров. По достижении монослоя (3-4 сутки) в бутыли вносят пул вируса, предварительно разводенного средой Игла 2МЕМ до концентрации, обеспечивающей множественность заражения 0,1-0,5 ФОЕ/кл при объеме инокулята 15 мл на 1 литровую роллерную бутыль. Для адсорбции вируса на клетки зараженные бутыли помещают в роллерную установку и инкубируют 1 час при температуре (37±1)°C. По истечении указанного времени в каждую бутыль вносят 100 мл поддерживающей рост клеток среды и снова помещают в роллерную установку в термостатную комнату с температурой (37±1)°C. Сбор клеток, содержащих вирусные антигены, проводят на 10-11 сутки. Клетки снимают со стекла смесью 0,02% версена и 0,5% трипсина, 5-кратно отмывают 0,85% раствором NaCl, готовят суспензию инфицированных клеток (450-550 тыс. кл./мл) и наносят ее по 0,005 мл на предметные стекла для иммунофлюоресценции. После высушивания стекла помещают на 20 минут в охлажденный ацетон для фиксации клеток и инактивации вируса и затем высушивают при комнатной температуре. Полученные антигенные (моновалентные, то есть приготовленные для каждого в отдельности вируса) препараты исследуют методом непрямой иммунофлюоресценции на содержание вирусного антигена, используя контрольные сыворотки переболевших ГЛПС людей, содержащие антитела к вирусам Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул, а также сыворотку человека, не содержащую антитела к хантвирусам. При наличии 90% и более клеток, содержащих антиген, суспензии клеток, инфицированных вирусами Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул, и незараженные клетки объединяют в соотношении 2:1:1:1:1. Полученную суспензию клеток (поливалентный антиген) наносят по 0,005 мл на предметные стекла для иммунофлюоресценции в два ряда по 6 капель в ряду или в 3 ряда по 7 капель. Предметные стекла выдерживают при комнатной температуре до полного высыхания суспензий, после чего препараты фиксируют в охлажденном (при температуре минус 15°C) ацетоне в течение 15-20 минут. После извлечения из ацетона препараты высушивают и обрабатывают ультрафиолетовым облучением в течение 3-х часов для полной инактивации инфекционной активности вирусов.

Для выявления специфических антител к возбудителям ГЛПС исследуемые сыворотки крови наносят на препараты с поливалентным культуральным антигеном в разведениях, начиная с 1:16 и выше. В опытах используют три контроля: положительный контрольный образец - сыворотка крови, содержащая антитела, взаимодействующие с антигенами хантавирусов Хантаан, Добрава и Сеул; положительный контрольный образец - сыворотка крови, содержащая антитела к хантавирусу Пуумала, и отрицательный контрольный образец - нормальная сыворотка, не содержащая антител к хантавирусам. Препараты помещают во влажную камеру и выдерживают при 37°C в течение 30 минут или при 4°C в течение 18-20 часов. После окончания экспозиции стекла 3-кратно по 3 минуты промывают 0,85% раствором NaCl, ополаскивают водой и подсушивают при комнатной температуре. После этого в лунки с антигеном наносят люминисцирующую сыворотку против глобулинов человека (или против глобулинов того вида животного, чью сыворотку крови исследуют) в рабочем разведении, которое определяют в предварительном опыте. Для контрастирования фона применяют Эванс голубой в конечной концентрации 1:10000. Препараты вновь инкубируют во влажной камере при температуре 37°C в течение 30 минут, промывают 0,85% раствором NaCl 3 раза по 3 минуты, ополаскивают водой, высушивают при комнатной температуре и просматривают с помощью люминесцентного микроскопа под водно-иммерсионным объективом (x60 или x65).

Для хантавирусов характерна локализация флюоресцирующего антигена с четкой гранулярной структурой в цитоплазме клеток. В зависимости от стадии накопления антигена можно наблюдать как мелкие или крупные гранулы в перинуклеарной зоне, так и глыбки флюоресцирующего материала, заполняющие всю цитоплазму клетки. Яркое изумрудно-зеленое гранулярное свечение хантавирусного антигена четко просматривается на фоне от серо-бурого до темно-коричневого или кирпично-красного окрашивания структуры неинфицированных клеток. Такой же фон отмечают и на антигене с нормальной сывороткой, используемой в качестве контроля. Титром сыворотки считают ее наивысшее разведение, способное выявлять специфический антиген вируса ГЛПС.

Предлагаемый способ позволяет получать диагностикум ГЛПС, обладающую следующими достоинствами:

1) универсальностью, проявляющейся в том, что диагностикум, содержащий антигены всех известных к настоящему времени хантавирусов, вызывающих ГЛПС на евразийском континенте, может использоваться с одинаковой эффективностью в различных эндемичных регионах, независимо от вида хантавирусов, циркулирующих на территориях этих регионов.

2) высокой чувствительностью выявления антител с первых дней клинических проявлений болезни, что обеспечивает раннюю специфическую диагностику этого заболевания.

Принципиальное отличие предлагаемого «Диагностикума геморрагической лихорадки с почечным синдромом культурального, поливалентного для непрямого метода иммунофлюоресценции» от разработанного ранее Диагностикума ГЛПС (Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К. и др. Способ получения диагностикума геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Автор. свидет. 1365918, 1985) и выпускавшегося впоследствии согласно ФСП 42-0070592404 заключается в том, что штаммы вирусов Пуумала и Добрава заменены на более активные штаммы, адаптированные к размножению в культуре клеток VERO с высоким уровнем продуцирования внутриклеточного антигена, что в свою очередь повышает чувствительность Диагностикума ГЛПС в 2-4 раза. Активная репликация вируса в культуре способствует сокращению периода накопления антигена в клетках с 14 до 10-11 дней и, соответственно, уменьшает материальные затраты на его производство (снижается количество питательной среды, используемой для поддержания жизнедеятельности клеток, а также расход электричества для работы роллерной установки и термостатирования). Штамм вируса Пуумала CG-1820-Уфа, изолированный от рыжей полевки, заменен штаммом ПУУ-ТКД-VERO, выделенный от больного ГЛПС. Штамм вируса Добрава АР-47/Сочи-01, изолированный от кавказской лесной мыши, заменен на штамм ДОБ-EAT-VERO, выделенный от больного ГЛПС. Кроме того, предлагаемый Диагностикум ГЛПС комплектуется антигенными препаратами с дизайном предметного стекла двух видов: помимо варианта нанесения хантавирусного антигена по 7 пятен в трех рядах, в набор будут входить стекла, на которых антиген нанесен по 6 пятен в 2-х рядах. Таким обазом, количество антигенных препаратов в наборе Диагностикума возрастет с 10 до 15. Включение в набор Диагностикума антигена в виде 12 пятен на стекле создает экономию и удобство при экспресс-диагностике спорадической заболеваемости ГЛПС, когда необходимо обследовать только одного больного. Внесенные изменения позволяют повысить чувствительность диагностического теста, удешевить производство и эффективность применения Диагностикума ГЛПС по сравнению с Диагностикумом, выпускавшимся ранее по условиям ФСП 42-0070592404. Штамм ПУУ-ТКД/VERO (PUU-TKD/VERO) вируса "ПУУМАЛА" (Puumala, род Hantavirus, семейство Bunyaviridae) депонирован 24 ноября 2009 г. под №1026 в Государственной коллекции вирусов (НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМП). Штамм ДОБ-EAT/VERO (DOB-TEA/VERO) вируса "ДОБРАВА" (Dobrava, род Hantavirus, семейство Bunyaviridae) депонирован 24 ноября 2009 г. под №1027 в Государственной коллекции вирусов (НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН).

Пример 1. Обследование парных сывороток крови больного с подозрением на ГЛПС, взятых на 2 и 5 день болезни.

Перед использованием предметное стекло с антигенным препаратом, хранившееся при температуре не выше минус 20°C, подсушивают при комнатной температуре (16-24°C).

В лунках пластиковых панелей готовят двукратные разведения исследуемых сывороток крови на 0,85% растворе NaCl и, начиная с разведения 1:16, наносят по одной капле (5 мкл) на отдельное "пятно". На отдельное "пятно" наносят также 3 контрольные сыворотки в рабочих разведениях. Препараты с нанесенными исследуемыми и контрольными образцами помещают во влажную камеру и инкубируют при 37°C в течение 30 мин или при 2-8°C в течение 18 ч. После окончания инкубации препараты 3-кратно по 3 мин выдерживают в физиологическом растворе, промывают в течение 1 мин водой и высушивают при комнатной температуре. На каждое "пятно" наносят люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека в рабочем разведении по 1 капле (5 мкл). Препараты инкубируют во влажной камере при температуре 37°C в течение 30 мин, после чего 3-кратно по 3 мин выдерживают в физиологическом растворе, ополаскивают водой и высушивают при комнатной температуре.

Опыт учитывают с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-2 или другой марки под водно-иммерсионным объективом (x60 или x65). Вначале микроскопируют лунки с контрольными сыворотками. При выявлении флюоресцирующего антигена с четкой гранулярной структурой в цитоплазме клеток в лунках с контрольными положительными сыворотками и отсутствии свечения в контроле с нормальной сывороткой приступают к просмотру исследуемых сывороток крови. Сыворотка №1 выявляет хантавирусный антиген в разведениях от 1:16 до 1:256, что определяется по характерному гранулярному изумрудно-зеленому свечению. Аналогичное свечение регистрируется в разведениях с 1:16 до 1:1024 в лунках с нанесенной сывороткой №2. Таким образом, титр сыворотки №1 - 256; сыворотки №2 - 1:1024.

Пример 2. По вышеописанной методике исследованы сыворотки крови больных с подозрением на ГЛПС с помощью Диагностикума (1), выпускавшегося по условиям ФСП 42-0070592404, и Диагностикума (2), предлагаемого для патентования. Результаты, представленные в таблице, показывают преимущества предлагаемого Диагностикума для ранней диагностики ГЛПС.

День болезни Число обследованных сывороток Выявление антител против хантавирусов Диагностикум-2 Диагностикум-1 абс. (%) абс. (%) 1 8 6 (75%) 2 (25%) 2 13 12 (92%) 9 (69%) 3 25 24 (96%) 20 (80%) 4 32 32 (100%) 30 (94%) 5 58 58 (100%) 58 (100%)

Предлагаемое изобретение относится к области вирусологии, в частности к способу получения тест-систем, предназначенных для специфической диагностики вирусных инфекций, а именно инфекции геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Способ получения Диагностикума ГЛПС путем репродуцирования четырех хантавирусов: Пуумала штамм ПУУ-ТКД/VERO, Добрава штамм ДОБ-EAT-VERO, Хантаан штамм Уссури-4590 и Сеул штамм СК-515/Грузия-88, в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки, линии VERO, проверки на содержание вирусспецифического антигена, получения поливалентного антигена, фиксации антигена на предметном стекле и обработки ультрафиолетовым облучением. Изобретение касается также набора для дигностики. Изобретение позволяет повысить чувствительность диагностического теста, удешевить производство и эффективность применения Диагностикума ГЛПС. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения Диагностикума для специфической диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом, представляющего собой поливалентный антигенный препарат, путем репродуцирования четырех хантавирусов: Пуумала штамм ПУУ-ТКД/VERO, Добрава штамм ДОБ-EAT-VERO, Хантаан штамм Уссури-4590 и Сеул штамм СК-515/Грузия-88 в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки, линии VERO, проверки на содержание вирусспецифического антигена и при достижении 90% и более клеток, содержащих антиген, для получения поливалентного антигена смешивают суспензии клеток, инфицированных указанными вирусами и незараженные клетки VERO, в соотношении 2:1:1:1:1, фиксации антигена и обработки ультрафиолетовым облучением.

2. Набор для диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом, включающий: а) поливалентный антигенный препарат, полученный путем репродуцирования четырех хантавирусов Пуумала штамм ПУУ-ТКД/VERO, Добрава штамм ДОБ-EAT-VERO, Хантаан штамм Уссури-4590 и Сеул штамм СК-515/Грузия-88, в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленной мартышки, линии VERO, проверки на содержание вирусспецифического антигена, получения поливалентного антигена, фиксации антигена на предметном стекле и обработки ультрафиолетовым облучением;
б) три контрольных образца, представляющих собой 2 положительных образца - сыворотки крови, содержащие антитела, взаимодействующие с антигенами хантавирусов Хантаан, Добрава и Сеул и антитела, взаимодействующие с антигеном хантавируса Пуумала, а также 1 отрицательный образец - нормальную сыворотку, не содержащую антител к хантавирусам, контрольные образцы, расфасованные в ампулы,
в) люминисцирующую сыворотку против глобулинов человека, обработанную для контрастирования фона раствором Эванса голубого.

3. Набор по п.2, отличающийся тем, что антиген нанесен на предметные стекла по 6 пятен в 2 рядах.

4. Набор по п.2, отличающийся тем, что антиген нанесен на предметные стекла по 7 пятен в 3 рядах.