ШТАММ ВИРУСА КРАСНУХИ "ОРЛОВ-В" ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении вакцины против краснухи.

Известны вакцинные штаммы вируса краснухи HPV77, HPV77DE5, HPV77DK12, Cendehill, KPT, MEQ₁₁, RA27/3 и BPD-2 (см. например: Best J.M. Epidemiol. Infect. 1991, 107, 17 30; Galazka A. Epidemiol. Infect. 1991, 107, 43 54; Herrmann K.L. Epidemiol. Infect. 1991, 107, 55 61).

Однако вакцины из штаммов HPV высоко реактогенны для людей, о чем сообщается в (Thomson C. R. Weiss J.J. Shillis J.L. et al. Am. J. Dis. Child. 1973, 125, 526 530). Вакцины из штамма RA27/3 вызывают 40% артралгий у взрослых (Best J.M. Banatlava J.E. Princiales and practice of clinical Virology, 1990, 337 374), а штамм Gendehill потенциально опасен в отношении контаминации онкогенными вирусами, так как получен с использованием клеточных культур приматов. Штамм MEQ₁₁ обладает низкой иммуногенностью. Остальные штаммы недостаточно изучены в отношении целевого назначения.

Наиболее близким к заявляемому является вакцинный штамм вируса краснухи "Орлов" (Мешалова В. Н. Опыт получения и аттенуации краснушного штамма "Орлов", В кн. "Респираторные вирусные инфекции", Труды ЛНИИЭМ им. Пестера, Л. 1973, 137 143), выделенный из зева ребенка, больного манифестной формой краснухи, и аттенуированный путем пассирования в первичной культуре клеток почки кролика (ППК).

Однако данный штамм обладает низкой иммуногенностью.

Целью изобретений является повышение иммуногенности штамма.

Указанная цель достигается тем, что в качестве продуцента краснушной вакцины используют селекционированный штамм вируса краснухи "Орлов-В".

Штамм-продуцент краснушной вакцины "Орлов-В" (ГКВ N 2326 от 04.04.95) получен путем многократного пассирования в ППК прототипного штамма "Орлов", взятого спустя 16 лет хранения в Государственной коллекции музейных вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского, с последующим клонированием методом предельных разведений и селекцией по признаку утраты репродукционной активности при температуре 40^o Указанный признак селекции использован для обеспечения ареактогенности штамма. В результате получен новый штамм с измененными культуральными свойствами: он не размножается при 40^oC, тогда как прототипный штамм при этой температуре размножается до 1,3 1,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл. Штамм прошел Государственные испытания на подлинность, специфическую активность и отсутствие контаминирующих агентов.

Штамм "Орлов-В" характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. При электронном микроскопировании популяция представляет однородные сферические частицы с диаметром 50 70 нм. Плавучая плотность в градиенте сахарозы 1,18 1,20 г/см³. Размножается с развитием цитодеструктивного действия до инфекционного титра 4 6 lg ТЦД₅₀/0,5 мл в клеточных культурах животных и человека: ППК, диплоидных клетках почки легкого и кожно-мышечного лоскута человека, перевиваемых культурах клеток гипернефромы, RK-1, RK-13, BHK-21, SIRK, HAK. Слабо размножается в первичных тканевых культурах куриных и перепелиных фибробластов. При роллерном или суспензионном способах культивирования на клетках BHK-21 выход вирусной биомассы достигает 7 8 lg ТЦД₅₀/0,5 мл. Не размножается при температуре ниже 20^oC и выше 40^oC. Оптимальная температура культивирования в тканевых культурах +35^oC.

Физиолого-биохимические признаки. Оптимальная pH 7,4±0,6. Инактивируется в течение 30 мин при 56^oC. Чувствителен к действию эфира и ацетона.

Антигенные свойства. Гемагглютинирующая активность in vitro 2 8 ГАЕ. Агглютинирует эритроциты голубей, 1-дневных цыплят, человека с группой крови 0.

Иммуногенные свойства. Специфические антитела при контроле на кроликах и морских свинках образуются в 100% случаев и характеризуются обратным титром антител в РТГА от 640 2560 до 1280 10240 соответственно в зависимости от условий культивирования. Наблюдаемость сероконверсий 80 100%
Вирулентные свойства. Штамм не обладает вирулентными и контагиозными свойствами.

Токсичность. Штамм не токсичен при введении морским свинкам и мышам в дозе 1000 ТЦД₅₀/0,5 мл (1 прививочная доза человека).

Пример 1. В 1-литровый матрац с тканевой культурой ППК в ростовой среде 199 с добавлением 10 об. сыворотки эмбрионов коров (ЭС) вносят вирус краснухи шт. "Орлов-В" в заражающей дозе 0,1 ТЦД₅₀/кл. и инкубируют в роллере при температуре 35^oC и скорости 0,3 об/мин до образования монослоя клеток, что происходит не позже, чем на 3 сутки инкубирования. Затем ростовую среду удаляют, а монослой 6-кратно отмывают от сыворотки раствором Хенкса pH 7,4.

Далее в матрац с зараженным клеточным монослоем добавляют 150 мл поддерживающей среды 199 с 1 об. ЭС и производят культивирование вируса в роллере при 35^oC и 0,3 об/мин в течение 18 суток. Через каждые 2 4 дня по мере нарастания цитопатогенных изменений клеточного монослоя, характерных для вируса краснухи (наблюдают под микроскопом), вируссодержащую жидкость сливают во флаконы и хранят под резиновой пробкой при (-20)^oC для последующего использования, а в матрац добавляют 15 мл свежей поддерживающей среды 199 с вышеуказанным количеством ЭС и культивируют при тех же условиях. В данном примере осуществляют 4 полезных съема вируса (съемов вируса не менее 4 lg ТЦД₅₀/0,5 мл).

Все операции выполняют в стерильных условиях.

Выход вируса на различных рабочих съемах указана табл. 1.

Собранный вируссодержащий материал 1 4 съемов объединяют, добавляют стабилизатор (желатину с сахарозой из расчета конечной концентрации 1 об.), разливают в 10-миллилитровые флаконы и хранят при (-20)^oC.

В результате получают 12000 доз живой краснушной вакцины (в одной дозе 5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл).

После контроля на стерильность и отсутствие посторонних агентов вакцину испытывают на иммуногенность. Для этого серонегативным морским свинкам (10 особей) и кроликам (5 особей) однократно внутривенно вводят по 1 дозе вакцины. Результат учитывают через 28 дней в РТГА с референс-антигеном. В данном примере средний геометрический обратный титр антител в сыворотках крови морских свинок и кроликов составляет 3820 и 2200 соответственно. Сероконверсий 100%
Пример 2. Два 1-литровых матраца с клеточной культурой ППК заражают в дозе 0,01 ТЦД₅₀/кл. вирусом краснухи шт. "Орлов-В" и "Орлов" соответственно. В данном примере низкая заражающая доза взята для обеспечения адекватности сравнения в связи с низкой активностью прототипа.

Штаммы культивируют как в примере 1.

Результаты приведены в табл. 2.

Как видно из таблицы, новый штамм дает существенно больший (на 0,8 1,4 lg ТЦД₅₀/0,5 мл) выход инфекционного вируса, чем прототипный.

Собранные поштаммно вируссодержащие материалы 2 4 съемов разводят средой 199 до концентрации 3,7 lg ТЦД₅₀/0,5 мл, добавляют стабилизатор (желатину с сахарозой из расчета конечной концентрации 1 об.), разливают в ампулы и лиофильно высушивают.

В результате получают две серии живой краснушной вакцины из данных штаммов (в одной дозе 3,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл).

Вакцины контролируют как в примере 1. При испытании на иммуногенность животным вводят по 2 дозы соответствующей вакцины. Результаты представлены в табл. 3. Как видно из таблицы, среднегеометрический обратный титр краснушных антител в сыворотке крови животных, привитых штаммом "Орлов-В", составляет 1360 3890, а при использовании прототипа 680 1120. Увеличено также количество сероконверсий на 20%
Как видно из приведенных примеров, использование предлагаемого штамма вместо прототипного позволяет повысить иммуногенность краснушной вакцины как в отношении титра иммунной сыворотки, так и процента сероконверсий. Кроме того, увеличен выход инфекционного вируса.

Использование, медицинская биотехнология. Сущность изобретения: для повышения иммуногенности вакцины против краснухи в качестве продуцента предложен штамм "Орлов-В", ГВК N 2326. Культурально-морфологические признаки. Однородные сферические частицы с диаметром 50 - 70 нм. Плавучая плотность в градиенте сахарозы 1,18 - 1,20 г/см³. Размножается с развитием цитодеструктивного действия до титра 4 - 6 lg ТЦД₅₀/0,5 мл в клеточных культурах животных и человека. Слабо размножается в первичных тканевых культурах куриных и перепелиных фибробластов. При роллерном или суспензионном способах культивирования на клетках ВНК-21 выход вирусной биомассы 7 - 8 lg ТЦД₅₀/0,5 мл. Не размножается при температуре ниже 10^oC и выше 40^oC. Физиолого-биохимические признаки. Оптимум pH = 7,4. Инактивируется в течение 30 мин при 56^oC. Чувствителен к эфиру и ацетону. Антигенные свойства. Гемагглютинирующая активность in vitro 2 - 8 ГАЕ. Агглютинирует эритроциты голубей, 1-дневных цыплят, человека с группой крови 0. Иммуногенные свойства. Специфические антитела при контроле на кроликах и морских свинках образуются в 100% случаев и характеризуются обратным титром антител в РТГА от 640 - 2560 до 1280 - 10240 соответственно. Наблюдаемость сероконверсии 80 - 100. Вирулентные свойства. Штамм не обладает вирулентными и контагионзными свойствами. Токсичность. Штамм не токсичен при введении морским свинкам и мышам в дозе 1000 ТЦД₅₀/0,5 мл /1 прививочная доза человека/. 3 табл.

Штамм вируса краснухи ГКВ N 2326 для получения вакцины.