ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КУЛЬТУР STAPHYLOCOCCUS AUREUS И CANDIDA ALBICANS Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/445 C12R1/725 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии, а именно к микробиологической лабораторной диагностике инфекционных болезней, и может быть использовано в исследовательских целях для характеристики штаммов по их биологической активности.

В микробиологии широко используются методы определения гемолитической активности микроорганизмов, у которых данный признак связывается с проявлением вирулентных свойств, например, таких как: возбудители стафилококковых, стрептококковых, гемофильных и др. инфекций.

Стафилококки синтезируют 4 типа β-пороформирующих гемолизина - α, β, γ и δ. Среди них наиболее патогенетически значимым является α-гемолизин. Еще одним гемолизином стафилококков является фосфолипаза С (лецитиназа) [Дерябин Д.Г. Стафилококки. Экология и патогенность. Екатеринбург: УрО РАН, 2000 - 239 с.]. В геноме Candida albicans обнаружено семь фосфолипазных генов (pla, plb1 plb2, plc1, plc2, plc3 и pld1), пороформирующие гемолитические субстанции кандид до сих пор не выявлены [Tsang C.S.P., Chu F.C.S., Leung W.K., Jin L.J., Samaranayake L.P., Siu S.C. Phospholipase, proteinase and haemolytic activities of Candida albicans isolated from oral cavities of patients with type 2 diabetes mellitus. // Journal of Medical Microbiology, 2007. - №56. - P.1393-1398].

Известно, что гемолизины микроорганизмов экспрессируются при культивировании как на жидких, так и на плотных питательных средах, уровень их экспрессии зависит от фазы роста, температуры, состава среды, в том числе и содержания доступного для усвоения микроорганизмами железа [Патент РФ №2318022 МПК C12Q 1/04, C12N 1/20, 07.02.2006].

Для выявления гемолитической активности стафилококков используют классический кровяной агар, состоящий из 1,5% мясопептонного агара с добавлением 5% дефибринированной крови барана. Для выявления гемолитической активности кандид используют кровяной агар Сабуро, состоящий из 1,5% мясопептонного агара с добавлением 5% дефибринированной крови барана и 40% сахарозы [Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследованиях. - М.: Медицина, 1978. - 396 с.]. Исследуемую суточную бульонную культуру микроорганизма высевают на поверхность кровяного агара. Посевы инкубируют при 37°C в течение 24-48 ч, после чего производят учет результатов визуально по наличию прозрачной зоны лизиса эритроцитов вокруг колоний [Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях, №535, М. 1985. - 135 с.].

Недостатком этой среды является ее низкая чувствительность, так как в готовой питательной среде концентрация железа, доступного для усвоения микроорганизмами, составляет менее 5 мкМ, что может быть недостаточно для экспрессии гемолизинов Staphylococcus aureus и Candida albicans [Леонов В.В., Костерина В.В., Варницына В.В., Тимохина Т.Х., Курлович Н.А. Железозависимый синтез гемолизинов Staphylococcus aureus.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2012. - Т.153. - №1. - С.49-51]. Кроме того, значение плотности агарового геля зависит от фирмы-производителя основы среды - мясопептонного агара, что может затруднять или наоборот способствовать диффузии экзотоксинов в толщу агара и, соответственно, искажать результаты выявления признака гемолитической активности. В целом, указанный недостаток приводит к невозможности унифицирования лабораторного способа выявления гемолитической активности штаммов S. aureus и С. albicans.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является кровяной агар с добавлением 5% дефибринированной крови барана, в котором в качестве основы используют триптон-соевый агар (15 г/л триптона, 5 г/л папаинового гидролизата соевой муки, 5,0 г/л хлорида натрия, 15,0 г/л агара) как наиболее эффективной основы для тестирования гемолитической активности гемпозитивных микроорганизмов (прототип) [Листериоз. Методические рекомендации №11, М.: Комитет здравоохранения Правительства Москвы, 2001. - 10 с.].

Основные недостатки прототипа в том, что кровяной агар, приготовленный по способу-прототипу, позволяет выявить гемолитическую активность микроорганизмов только через 18 (для бактерий) и 48 ч (для грибов) культивирования и имеет непостоянное содержание доступного для усвоения микроорганизмами железа, что не всегда позволяет выявить гемолитическую активность S. aureus и С. albicans и может приводить к неверной интерпретации результатов лабораторных исследований.

Заявляемое изобретение обеспечивает высокую эффективность и сокращение продолжительности выявления гемолитической активности S. aureus и С. albicans за счет создания оптимальных условий для экскреции гемолитических субстанций. Среда позволяет проводить скрининг и дифференциацию популяций штаммов стафилококков и кандид по признаку гемолитической активности.

Основные признаки заявляемого изобретения, общие с прототипом: использование в качестве компонентов основы для приготовления питательной среды триптона и хлорида натрия.

Основными отличиями от прототипа, обеспечивающими получение заявляемого технического результата, является добавление (из расчета на 1000 г питательной среды) 0,12 г сульфата железа(II), 10 г глюкозы, 5 г дрожжевого экстракта вместо папаинового гидролизата соевой муки и 50 г эритроцитов человека 0(I) группы Rh(+) вместо дефибринированной крови барана.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что в качестве питательной среды для выявления гемолитической активности используют триптон, дрожжевой экстракт, глюкозу, хлорид натрия, эритроциты человека 0(I) группы Rh(+) и сульфат железа(II), при следующем количественном содержании в ней компонентов (мас.%):

Триптон («Becton Dickinson») 1,0 Дрожжевой экстракт («Becton Dickinson») 0,5 Хлорид натрия 0,5 Эритроциты человека 0(I) группы Rh(+) 5,0 Глюкоза 1,0 Сульфат железа(II) 0,012 Агар «Дифко» 1,5-2,0 Дистиллированная вода остальное

Предлагаемое изобретение осуществляется следующим образом. Компоненты среды триптон, дрожжевой экстракт, глюкозу, хлорид натрия и агар суспендируют в необходимом количестве дистиллированной воды, полученную суспензию доводят до кипения и кипятят в течение 1 мин до полного растворения всех компонентов. Приготовленную таким образом основу питательной среды стерилизуют автоклавированием при 112°C в течение 15 мин и после охлаждения до 45°C в нее вносят (из расчета на 1000 г питательной среды) 50 г эритроцитов человека 0 (I) группы Rh (+) и 0,12 г сульфата железа(II). Готовую питательную среду разливают по 15-20 мл в чашки Петри. После полного застывания агарового слоя на его поверхность высевают исследуемые суточные бульонные культуры S. aureus и С. albicans. Посевы инкубируют при (37±1)°C в течение 12-24 ч, после чего производят визуальный учет результатов по наличию узкой прозрачной зоны лизиса эритроцитов вокруг колоний.

Использование в качестве основы питательной среды триптона, дрожжевого экстракта, глюкозы и хлорида натрия обеспечивает быстрый и обильный рост микроорганизмов, агар «Дифко» способствует более четкому проявлению гемолитической активности. Кроме того, глюкоза служит источником энергии и углерода для С. albicans.

Возможность практического использования изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.

Примеры 1-3. Для определения наличия гемолитической активности штаммов S. aureus получают их 18-24 ч бульонные культуры.

Кровь у донора, для получения взвеси эритроцитов, берут стандартным методом - из локтевой вены с соблюдением правил асептики в сосуд с бусами. Сосуд с бусами и кровью энергично встряхивают в течение 15-20 мин; при этом фибрин оседает на бусах в виде сгустка. Свободную от фибрина кровь переливают в стерильную центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 15-20 мин при 3000 об/мин. Эритроциты оседают на дно, надосадочную жидкость сливают, добавляют стерильный физиологический раствор до первоначального объема и вновь центрифугируют. Такое промывание эритроцитов производят 2-3 раза, пока надосадочная жидкость не станет бесцветной. Надосадочную жидкость сливают, а взвесь эритроцитов используют для приготовления питательной среды.

Приготовление питательной среды для выявления гемолитической активности производят следующим образом: в 900 мл дистиллированной воды суспендируют 10 г (1,0%) триптона, 5,0 г (0,5%) дрожжевого экстракта, 5,0 г (0,5%) хлорида натрия (х.ч.), 10 г (1,0%) глюкозы (х.ч.) и 15-20 г (1,5-2,0%) агара «Дифко». Полученную суспензию доводят до кипения и кипятят в течение 1 мин до полного растворения всех компонентов. Приготовленную таким образом основу питательной среды стерилизуют автоклавированием при 112°C в течение 15 мин. После охлаждения до 45°C в нее вносят 50 г (5%) взвеси эритроцитов человека 0 (I) группы Rh (+) и добавляют 0,12 г (0,012%) сульфата железа(II). Готовую питательную среду разливают по 15-20 мл в стерильные чашки Петри.

На поверхность приготовленной питательной среды бляшками наносят суточные бульонные культуры штаммов S. aureus: АТСС 25923, 4844, 372, 2888. Посевы инкубируют при температуре (37±1)°C. Учет результатов производят визуально через 12 ч. Вокруг изолированных бляшек S. aureus формируются четко ограниченные прозрачные зоны гемолиза вследствие разрушения эритроцитов (табл.1).

Примеры 4-6 проведены в условиях, аналогичных примеру 1, но с использованием в качестве исследуемого микроорганизма штаммов С. albicans: 24433 АТСС, 9708, 147. Учет результатов производят визуально через 24 ч, так как С. albicans образует изолированные колонии на плотных средах через 24 ч культивирования. Вокруг изолированных бляшек С. albicans формируются четко ограниченные прозрачные зоны гемолиза вследствие разрушения эритроцитов (табл.2).

Как видно при сравнении таблиц 1 и 2, заявляемый способ позволяет обеспечивает быстрый и обильный рост микроорганизмов и выявить наличие гемолитический свойств у культур S. aureus и С. albicans уже через 12 и 24 ч культивирования соответственно.

Примеры 7-9. Для сравнения эффективности питательной среды для выявления гемолитической активности известным способом и заявляемым были отобраны 3 штамма S. aureus: АТСС 25923, 4844, 372. При выявлении гемолитической активности у данных штаммов заявляемым способом были получены следующие результаты. Вокруг изолированных бляшек всех исследованных штаммов S. aureus, выращенных на питательной среде, приготовленной заявляемым способом, формируются четко ограниченные прозрачные зоны гемолиза вследствие разрушения эритроцитов. Вокруг изолированных бляшек штаммов S. aureus АТСС 25923 и 4844, выращенных на питательной среде, приготовленной по способу-прототипу, зоны гемолиза отсутствуют, лишь у штамма S. aureus 372 гиперпродуцента гемолизинов вокруг колоний формируется узкая зона лизиса эритроцитов (табл.3).

Полученные результаты говорят о более высокой эффективности заявляемого изобретения по сравнению с прототипом в выявлении гемолитической активности.

Технический результат: изобретение обеспечивает высокую эффективность и сокращение продолжительности выявления гемолитической активности S. aureus и С. albicans с 18 ч и 48 ч до 12 ч и 24 ч соответственно за счет создания оптимальных условий для экскреции гемолитических субстанций. Предлагаемая среда позволяет лучше, по сравнению с прототипом, проводить скрининг и дифференциацию популяций штаммов стафилококков и кандид по признаку гемолитической активности.

Таблица 1 Выявление признака гемолитической активности у штаммов S. aureus Пример Наименование штамма Наличие гемолиза 1 АТСС 25923 + 2 4844 + 3 372 +

Таблица 2 Выявление признака гемолитической активности у штаммов С. albicans Пример Наименование штамма Наличие гемолиза 4 АТСС 24433 + 5 9708 + 6 147 +

Таблица 3 Сравнительная эффективность выявления признака гемолитической активности у штаммов S. aureus с использованием заявляемого способа и способа-прототипа Пример Наименование штамма Наличие гемолиза способ-прототип заявляемый способ 7 АТСС 25923 - + 8 4844 - + 9 372 + +

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологической лабораторной диагностике инфекционных болезней. Питательная среда содержит триптон, дрожжевой экстракт, глюкозу, хлорид натрия, эритроциты человека 0(I) группы Rh(+), сульфат железа(II), агар «Дифко» и дистиллированную воду при заданных соотношениях компонентов. Изобретение позволяет повысить точность выявления стафилококков и кандид по признаку гемолитической активности и сократить сроки их выявления. 3 табл., 9 пр.

Питательная среда для выявления гемолитической активности культур Staphylococcus aureus и Candida albicans, содержащая в качестве основы триптон, хлорид натрия, агар, отличающаяся тем, что дополнительно содержит дрожжевой экстракт, глюкозу, эритроциты человека 0 (I) группы Rh (+), сульфат железа(II) при следующем количественном содержании в ней компонентов (мас.%):
Триптон («Becton Dickinson») 1,0 Дрожжевой экстракт («Becton Dickinson») 0,5 Хлорид натрия 0,5 Эритроциты человека 0 (I) группы Rh (+) 5,0 Глюкоза 1,0 Сульфат железа(II) 0,012 Агар «Дифко» 1,5-2,0 Дистиллированная вода остальное