СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ЖИВОЙ КЛЕТКИ К ПРОТИВООПУХОЛЕВОМУ АНТИБИОТИКУ Российский патент 1996 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/04 C12Q1/68 C12N15/09 

Изобретение относится к микробиологии и онкологии и может быть использовано при выявлении устойчивости живых клеток к антибиотикам.

Применение противоопухолевых антибиотиков является одним из важнейших компонентов комплексной терапии опухолей. Однако в ряде случаев опухолевые клетки остаются жизнеспособными в присутствии таких антибиотиков, т. е. приобретают устойчивость к ним. Предполагают, что в основном она связана с изменениями в мембранном аппарате клеток, происходящими в ходе опухолевой трансформации. Поэтому, цель современной химиотерапии опухолей не в обнаружении веществ, обладающих противоопухолевой активностью вообще, а в направленном поиске активных препаратов для лечения опухолей, резистентных к противоопухолевой терапии (1, 2). Однако до применения в клинике необходимо установить вероятность выживания клеток-мишеней в присутствии препарата. Для этой цели необходима разработка новых подходов к определению устойчивости живых клеток к противоопухолевым антибиотикам.

В настоящее время известен способ серийных разведений антибиотиков в жидкости (чаще используется 0,85% раствор хлористого натрия), применяемый с целью определения устойчивости живых клеток к антибиотикам (3). Метод осуществляют следующим способом: готовят ряд разведений антибиотика в жидкости, затем к каждому разведению добавляют культуру микроорганизмов с одинаковой концентрацией клеток и после инкубации при оптимальной температуре в течение определенных промежутков времени определяют концентрацию жизнеспособных клеток.

Для этого либо определяют плотность культуры с помощью фотоэлектроколориметра, либо готовят ряд 10-кратных разведений культуры и высевают по 0, 1 мл на мясо-пептонный агар. Полученные данные сравнивают с контролем. Описанный метод из-за низкой специфичности, связанной с использованием любого штамма микроорганизмов, не может быть применен для определения устойчивости к противоопухолевым антибиотикам.

С целью определения чувствительности живых клеток к новым противоопухолевым антибиотикам в настоящее время наиболее широко применяют штаммы перевиваемых опухолевых клеток. В разных странах широко применяются культуры, среди которых большое признание получила клеточная система КВ (рак гортани человека). Используются также культуры клеток He1a, культуры клеток опухоли яичника человека. О чувствительности к противоопухолевым антибиотикам судят по подавлению роста культуры (4). Однако при этом каждое новое вещество, предлагаемое в качестве противоопухолевого препарата, испытывают на большом наборе различных опухолей, либо для испытания веществ некоторых классов приходится подбирать определенные виды опухолей. Это весьма трудоемкие процессы, занимающие много времени, особенно при скриненге большого количества новых веществ. Кроме того, если противоопухолевый эффект не наблюдается, невозможно решить, связано это с устойчивостью клеток к нему (возможно, из-за изменений мембранного аппарата), либо таковое вещество в принципе не обладает активностью в отношении опухолевых клеток.

Сказанное выше, свидетельствует о необходимости создания принципиально нового подхода к определению устойчивости живых клеток к противоопухолевым антибиотикам для быстрого предварительного отбора новых веществ, предлагаемых для лечения опухолей.

Задачей изобретения является разработка системы отбора препаратов для лечения опухолей, в т.ч. и химиорезистентных.

Сущностью изобретения является то, что в живую клетку штамма микроорганизма, в частности E.coli DН 1, вводят плазмиду рМ 5 и, при условии повышения степени выживаемости этих клеток относительно контрольных, определяют устойчивость к данному антибиотику.

Ранее были описаны микроорганизмы, чувствительные к некоторым противоопухолевым антибиотикам (1). Объяснением этому служила общность механизма действия этих антибиотиков в отношении клеток высших организмов и микробов, например, влияние на синтез нуклеиновых кислот. Однако штаммы микроорганизмов, устойчивые к противоопухолевым антибиотикам, вне зависимости от механизма действия, до сих пор известны не были.

Нами для решения задачи использован штамм E.coli DH 1 с плазмидой рM 5, содержащей участок плазмиды гемолиза рRD1 (5) размером около 5 Кв в составе вектора рАСУС184(6).

При инкубации этого штамма в присутствии различных противоопухолевых антибиотиков наблюдали в среднем 10-кратное повышение выживаемости клеток в сравнении с родительским штаммом E.coli DН 1,а также штаммом E.coli DН 1 с вектором рАСУC184.

Таким образом, плазмида рМ 5 придает штамму-хозяину устойчивость к противоопухолевым антибиотикам, независимо от механизма действия. Предположительно, плазмидные гены контролируют изменения мембранного аппарата бактерий, способствующие выведению антибиотиков, поступающих в клетку, аналогично известным для опухолей механизмам. Это открывает возможность использования штамма E. coli DН 1 с плазмидой рM 5 для скрининга новых противоопухолевых антибиотиков.

Способ осуществляется следующим образом: штамм E.coli DН 1 с плазмидой рD 5 выращивают в течение 18 ч при 37^oC с в мясопептонном бульоне, затем разводят 1: 10 свежим бульоном 3 ч при 37^oC для получения экспотенциальной культуры.

К раствору антибиотика в 0,85% растворе хлористого натрия в концентрации, бактерицидной для контрольного штамма, добавляют до конечной концентрации около 10⁷ клеток в 1 мл и инкубируют в течение 2-2,5 часов при 37^oС. Затем готовят 10-кратные разведения в 0,85% -ном растворе хлористого натрия и высевают на чашки Петри с мясо-пептонным агаром для подсчета колоний. Параллельно те же действия производят с культурой E. coli DН 1 с векторной плазмидой, которую используют в качестве контроля.

В случае, если количество колоний штамма E.coli DH 1 с плазмидой не менее, чем в 10 раз превышает таковое для контрольного штамма, культуру считают устойчивой к антибиотику.

При разработке способа применяли систему контролей из двух штаммов: E. coli DН 1 с векторной плазмидой рАСУС184 и E.coli DH 1 не содержащего плазмид. В дальнейшем в качестве контроля для осуществления способа можно применять один штамм E.coli- DH 1 с плазмидой рАСУС184.

Решение задачи обосновано следующим материалом: в примере приведены результаты определения устойчивости штамма E.coli DH 1 с плазмидой рМ 5 к противоопухолевому антибиотику рубомицину.

Результаты апробаций, проведенных с противоопухолевыми антибиотиками, приведены в таблице 1.

Пример практического применения.

В качестве противоопухолевого антибиотика использовали рубомицин, бактерицидная концентрация которого в отношении контрольных штаммов Е.соli DH 1 и Е.соli DН 1 с плазмидой рM 5 cоставляет 500 мкг мл.

Клетки штамма Е.соli DM 1 с плазмидой рН 5 выращивали в течение 18 часов при 37^oС, затем развели 1:10 свежим бульоном и подрастили при той же температуре в течение 2,5 часов для получения культуры в экспотенциальной фазе роста. Затем к раствору антибиотика в 0,85% растворе хлористого натрия добавили 0,1 мл культуры и инкубировали в течении 2,5 часов при 37^oС. Приготовили ряд 10-кратных разведений смеси и высеяли по 0,1 мл из каждого разведения на мясо-пептонный агар. На следующий день подсчитали количество выросших колоний. Те же действия параллельно производили со штаммом E.coli DН с плазмидой рАСУС184, используемым в качестве контроля. При сравнении количества колоний, выросших после инкубации каждого из штаммов в присутствии и отсутствии антибиотика, установили, что введение плазмиды рМ 5 в штамм E.coli ОН 1 повышает его выживаемость по отношению к контрольному штамму в 8,6 раза. Данный препарат можно считать перспективным для лечения химирезистентных опухолей.

Литература:
1. Блохин Н. Н. Система создания противоопухолевых препаратов в СССР и США. М. Медицина, 1977,с. 73-74.

2. Блохин Н. Н. Химиотерапия злокачественных опухолей. М. Медицина, 1977г.

3. Бриан Л.Е. Бактериальная резистентность и чувствительность к химиопрепаратам. М. Медицина, 1984г.

4. Халеев Т.Г. Исследование действия ряда противоопухолевых препаратов на культуры опухолей человека. Бюл. эксп. биологии и медицины, 1960, N 1, с. 95-97.

5. Романова Л.В. и др. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1984, N 2.

6. Cang A. Cohen S. J.Bacteriology, 134. 1141, 1978. ТТТ1

Применение: микробиология, онкология. Сущность изобретения: путем введения плазмиды рМ 5, содержащей участок плазмиды гемолиза pRD1 в составе вектора рАСУС 184, в E.coli ДН 1 получают рекомбинантный штамм бактерий, клетки которого затем обрабатывают исследуемым противоопухолевым антибиотиком в бактериостатической концентрации и определяют выживаемость; при условии, что она не менее, чем в 10 раз превышает выживаемость клеток контрольного штамма /E.coli ДН 7 с векторной плазмидой рАСУС 184/, делают вывод о наличии у живой клетки механизма устойчивости к данному агенту. 1 табл.

Способ определения устойчивости живой клетки к противоопухолевому антибиотику, предусматривающий подращивание клеток тест-системы на подходящей питательной среде, обработку их исследуемым препаратом и оценку результата по выживаемости клеток в eго присутствии, отличающийся тем, что в качестве опытного образца тест-системы используют клетки штамма Escherichia coli ДН 1, трансформированного плазмидой рМ5, содержащей участок плазмиды гемолиза pRD1 размером около 5 кв в составе вектора рAСYС 184, a в качестве контрольного образца клетки штамма E.coli ДН1 с векторной плазмидой рACYC 184, оба образца обрабатывают исследуемым противоопухолевым антибиотиком в бактериостатической для родительского штамма концентрации и при условии, что выживаемость клеток опытного штамма в 10 и более раз превышает выживаемость клеток контрольного, делают вывод о наличии у живой клетки устойчивости к данному виду препарата.