СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ IN VITRO Российский патент 2002 года по МПК A61B10/00 G01N33/48 

Настоящее изобретение относится к фотобиологии и медицине, а более конкретно - способам оценки эффективности фотосенсибилизаторов - препаратов, используемых для фотодинамической терапии.

Известен способ определения фотодинамической активности in vitro, при котором в оптически прозрачный сосуд для фотобиологических исследований помещают биологическую культуральную среду, содержащую культуру опухолевых клеток, вводят фотосенсибилизатор, инкубируют культуру клеток с фотосенсибилизатором, затем культуру клеток отмывают от фотосенсибилизированной культуральной среды, добавляют чистую культуральную среду, затем этот сосуд облучается светом соответствующей длины волны. В результате фотодинамического воздействия часть клеток гибнет, и по соотношению погибших и выживших клеток определяют фотодинамическую активность фотосенсибилизатора [Р.И. Якубовская и др. "Скрининг и медико-биологическое изучение отечественных фотосенсибилизаторов". Российский химический журнал, том XLII, с. 17-23] /1/.

Недостатком известного способа является его сложность, трудоемкость, неоперативность, необходимость использования сложных микроскопических, радиоактивных или флуоресцентных методов для контроля соотношения погибших и выживших клеток. При этом требуется значительное число проб, но даже при этом условии высока вероятность неудачного завершения исследований (например, из-за контаминации ("зарастания") клеток, вызванной нарушением стерильности и т.д.), что снижает достоверность определения.

В настоящем изобретении решается задача упрощения способа и повышения достоверности определения фотодинамической активности in vitro.

Указанная задача решается тем, что в предлагаемом способе определения фотодинамической активности in vitro, при котором в оптически прозрачный сосуд для фотобиологических исследований помещают биологическую культуральную среду, содержащую культуру опухолевых клеток, вводят фотосенсибилизатор, инкубируют культуру клеток с фотосенсибилизатором, отмывают культуру клеток от фотосенсибилизированной культуральной среды, добавляют чистую культуральную среду, дополнительно в культуральную среду непосредственно перед облучением вводят эритроциты, полученную среду облучают, во время облучения измеряют спектр поглощения или рассеяния среды в оптическом диапазоне, по соотношению вкладов спектров окси- и дезоксигемоглобина в упомянутый спектр определяют степень оксигенации среды и скорость ее изменения, а именно определяют фотодинамическую активность фотосенсибилизатора по отношению скорости изменения оксигенации среды к плотности мощности облучения.

Предпочтительно введение эритроцитов в количестве 0,2...1 об.%.

Предлагаемый способ определения фотодинамической активности in vitro осуществляется следующим образом.

В биологическую культуральную среду, содержащую культуру опухолевых клеток, вводят фотосенсибилизатор, инкубируют культуру клеток с фотосенсибилизатором, отмывают культуру клеток от фотосенсибилизированной культуральной среды, добавляют чистую культуральную среду, добавляют эритроциты. Оптимально эритроциты добавляют в среду в количестве 0,2...1 об.%. Такое количество достаточно для надежной регистрации спектра поглощения окси- и дезоксигемоглобина и не влияет на свойства изучаемой среды. Далее проводится облучение и в автоматическом режиме мониторинга регистрируются спектры поглощения или рассеяния, производится расчет соотношения окси- и дезоксигемоглобина, по динамике изменения которого оценивается скорость изменения оксигенации среды, по которой и определяют фотодинамическую активность фотосенсибилизатора.

Пример конкретной реализации способа. В 24-луночный культуральный планшет помещают культуральную среду RPMI 1640, дополненную 10% FCS, со взвесью клеток мелкоклеточного рака легкого Н69 с концентрацией 10⁵ клеток/мл, добавляют препарат "Фотосенс" до конечной концентрации 10 мкг/мл, инкубируют в СО₂-инкубаторе при температуре 37^oС в течение 24 ч, отмывают культуру клеток от фотосенсибилизированной культуральной среды, добавляют чистую культуральную среду, затем в среду добавляют эритроциты в количестве 1 об.% и в течение 2 мин облучают излучением с длиной волны 670 нм и плотностью мощности 100 мВт/см², используя для облучения лазер ЛД-680-2000 со световодом ^TF-FC-5m-600-SMA. Для контроля оксигенации эритроцитов используют спектроанализатор ЛЭСА-6-Ох с волоконно-оптическим приемным катетером FOC-R-!-6 и источник белого света LS-H-3 со световодом TF-FC-5m-600-SMA. Значения оксигенации за время облучения уменьшаются от 100% вплоть до 0%. В качестве критерия для оценки фотодинамической активности используют значение скорости дезоксигенации или приведенную величину - коэффициент эффективности ФДТ (КФДТ) - отношение скорости дезоксигенации к плотности мощности облучения. В данном эксперименте время дезоксигенации от уровня 100% до уровня 0% при плотности мощности облучения 300 мВт/см² составляет 90 с, КФДТ соответственно равен 36% см²/Вт, что соответствует высокой фотодинамической активности.

Исследования авторов показали, что поскольку большинство фотосенсибилизаторов являются фотосенсибилизаторами второго рода, и основным цитотоксическим агентом при их фотодинамическом действии является синглетный кислород, то при исследовании фотодинамической активности in vitro происходит утилизация растворенного в этой среде молекулярного кислорода, и эта утилизация проходит тем быстрее, чем выше скорость фотодинамической реакции. В свою очередь, это приводит к уменьшению насыщения кислородом гемоглобина в эритроцитах, которое вычисляется из спектра поглощения или рассеяния среды в оптическом диапазоне ( по соотношению вкладов спектров окси- и дезоксигемоглобина в упомянутый спектр). Были получены достаточно точные и повторяемые результаты при широкой вариации параметров облучения, концентрации и состава фотосенсибилизаторов, позволяющие сделать вывод о высокой точности, оперативности и надежности предлагаемого способа для определения фотодинамической активности in vitro.

Таким образом, предлагаемый способ является более достоверным и простым по сравнению с известным.

Изобретение может быть использовано в медицине для определения фотодинамической активности in vitro. В оптически прозрачный сосуд для фотобиологических исследований помещают биологическую культуральную среду, содержащую культуру опухолевых клеток, вводят фотосенсибилизатор, инкубируют культуру клеток с фотосенсибилизатором, отмывают культуру клеток от фотосенсибилизированной культуральной среды, добавляют чистую культуральную среду, дополнительно в культуральную среду непосредственно перед облучением вводят эритроциты, полученную среду облучают, во время облучения измеряют спектр поглощения или рассеяния среды в оптическом диапазоне, по соотношению вкладов спектров окси- и дезоксигемоглобина в упомянутый спектр определяют степень оксигенации среды и скорость ее изменения, а именно определяют фотодинамическую активность фотосенсибилизатора по отношению скорости изменения оксигенации среды к плотности мощности облучения. Предпочтительно эритроциты вводят в количестве 0,2-1 об.%. Предлагаемый способ является более достоверным и простым по сравнению с известными. 1 з.п.ф-лы.

1. Способ исследования фотодинамической активности in vitro, включающий помещение в оптически прозрачный сосуд для фотобиологических исследований биологической культуральной среды, содержащей культуру опухолевых клеток, введение фотосенсибилизатора, инкубирование культуры клеток с фотосенсибилизатором, отмывание культуры клеток от фотосенсибилизированной культуральной среды, добавление чистой культуральной среды, облучение сосуда с культурой клеток светом соответствующей длины волны, отличающийся тем, что дополнительно в исследуемую культуральную среду непосредственно перед облучением вводят эритроциты, во время облучения измеряют спектр рассеяния полученной среды в оптическом диапазоне, определяют степень оксигенации среды и скорость ее изменения, а именно определяют по отношению скорости изменения оксигенации среды к плотности мощности облучения, по которой и определяют фотодинамическую активность фотосенсибилизатора. 2. Способ определения фотодинамической активности in vitro по п. 1, отличающийся тем, что эритроциты вводят в количестве 0,2-1 об. %.