СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/12 

Изобретение относится к области экологической химии и может быть использовано для определения полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) в биоматериале высокой жирности.

Известен способ определения микроколичеств углеводородов в биологических объектах (1), основанный на извлечении углеводородов нефти из исследуемой биопробы органическим растворителем, путем экстракции хлороформом в статических условиях в течение суток, очистке экстракта от коэкстрактивных веществ и делении экстрагированных углеводородов на группы колоночной хроматографией, где в качестве адсорбента используют оксид алюминия, импрегнированный азотистокислым натрием. Группы углеводородов (нормальные и изопреноидные, моно-, би- и трициклические углеводороды) выделяют из колонки последовательно гексаном, затем смесью гексан:эфир=8:2 и снова гексаном. Выделенные фракции концентрируют и анализируют на газовом хроматографе.

Известным способом определяют углеводороды в биопробах с жирностью не более 8%, например, в мышцах рыб. Но при большом содержании жиров в органах и тканях исследуемых биологических объектов этот способ недостаточно эффективен, т.к. дальнейшая очистка экстракта в колонке, заполненной оксидом алюминия, импрегнированным азотистокислым натрием, не обеспечивает полное удаление мешающих анализу липидов.

Кроме того, для экстракции углеводородов из рыб используется хлороформ, в растворе которого некоторые ПАУ претерпевают изменения, что приводит к искажению получаемых результатов анализа.

Известен способ (2), основанный на смешивании суспензии образца с адсорбентом C₁₈ (35-75 мкм), высушивании смеси, помещении в камеру для сверхкритической флюидной экстракции, экстракции с помощью СO₂ при 100^oС и 35 МПа, экстракции ПАУ метиленхлоридом, анализе методом газовой хроматографии на колонке Ultra-2 в режиме программирования температуры с масс-спектрометрическим детектированием. Степень извлечения из матрицы, содержащей модельные липиды (стеариновая кислота и холестерин), равна 94,0-100,3%. Методика применена для анализа ткани краба. Совместно экстрагируется 9-17% липидов.

Недостатком известного способа является определение углеводородов только в мышцах рыб, т.е. в пробах с невысокой жирностью - не более 8%. Для анализа более жирных тканей и органов рыб, особенно печени, гонад, мозга, которые в наибольшей степени накапливают полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) и являются индикаторами состояния рыб, этот способ недостаточно точен, т.к. при наличии большого количества липидов этим способом не достигается их удаление.

Для экстракции углеводородов из рыб используется метиленхлорид, в растворе которого некоторые ПАУ претерпевают изменения, что приводит к искажению получаемых результатов анализа.

Кроме того, в реализации способа используются дорогостоящие малодоступные аналитические приборы.

Известны также способы, в которых для выделения углеводородов из гидробионтов предварительно удаляют липиды путем взаимодействия тканей и органов гидробионтов с водными или спиртовыми растворами едкого кали или натра при различных температурах и времени обработки и последующей экстракции органическими растворителями и отделении от мешающих соединений различными хроматографическими методами.

Выбранный в качестве прототипа способ определения ПАУ в гидробионтах (3) включает отбор образца, гомогенизацию и обезвоживание пробы, взаимодействие ее со щелочью; 3-кратную экстракцию (дважды 100 см³ гексана и затем 150 см³ смеси гексан: эфир=1:1); выделение суммы углеводородов методом тонкослойной хроматографии (сорбент - оксид алюминия); выделение полиаренов из суммы углеводородов при помощи тонкослойной хроматографии на силикагеле; идентификацию и количественное определение полиаренов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Взаимодействие пробы со щелочью проводят 3-часовым кипячением 50 г биологической пробы в 300 см³ 92% этилового спирта в присутствии 24 г едкого кали.

Однако, при высоком содержании липидов в органах и тканях исследуемых гидробионтов в экстракт вместе с ПАУ выделяется значительное количества липидов. Дальнейшая очистка гидролизата в колонке, заполненной оксидом алюминия 3-й степени активности, не обеспечивает полное удаление мешающих веществ, что приводит к искажению результатов анализа.

Другими недостатками известного способа являются трудоемкость, длительность, многостадийность, что влечет за собой увеличение потерь и снижение точности анализа, а также неэкономичность, т.к. используются большие количества дорогостоящих реактивов.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение точности анализа ПАУ в биоматериалах высокой жирности, уменьшение трудовых и материальных затрат.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, заключающегося в том, что биологическую ткань (например, ткань печени) гомогенизируют, обезвоживают, экстрагируют гексаном, полученный экстракт подвергают взаимодействию со щелочью и одновременно хроматографической очистке на колонке, где в качестве сорбента используют силикагель, импрегнированный едким натром, при этом углеводороды из колонки выделяют 50-80 мл гексана. Выделенные ПАУ идентифицируют и количественно определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Предложенный способ осуществляется следующим образом: биологическую ткань, содержащую ПАУ, гомогенизируют, обезвоживают безводным сульфатом натрия и экстрагируют гексаном на механическом встряхивателе порциями по 20 мл до исчезновения люминесценции в последней порции экстракта. Объединенный экстракт, сконцентрированный до 0,5 мл, помещают на вершину колонки с силикагелем, импрегнированным едким натром, и вытесняют его 50-80 мл гексана.

Пример 1. Эксперименты проведены на растворах 16 ПАУ, признанных Международной Организацией по стандартизации в качестве приоритетных, и их смеси с рыбьим жиром, который наиболее адекватно отражает состав липидов.

Проводили элюирование смеси 16 ПАУ из колонки, заполненной силикагелем, импрегнированным едким натром. Для оптимизации проводимого эксперимента стеклянную колонку устанавливали в темной камере и хроматографирование пробы контролировали визуально под ультрафиолетовым освещением. Полиарены под УФ-светом светились голубым цветом, липиды - желтым. Вымывали ПАУ из колонки гексаном порциями по 10 мл.

Результаты анализа даны в табл. 1. Из табл. 1 видно, что практически полное (99,5%) элюирование ПАУ из колонки происходит 50-80 мл гексана.

Пример 2. Смесь ПАУ с рыбьим жиром помещали на вершину колонки, заполненной силикагелем, импрегнированным едким натром, и вытесняли ее 10 порциями гексана. Каждая порция составляла 10 мл. Как и в примере 1, хроматографирование пробы контролировали визуально под ультрафиолетовым освещением. Продвижение ПАУ и липидов по колонке происходило следующим образом: ПАУ выходили из колонки в первых 80 мл элюента, ширина фронта ПАУ, продвигающегося по колонке, составляла 4 см; жиры при прохождении 27 мл элюента оставались на вершине колонки, а в последующих 29 мл элюента расслаивались на отдельные зоны, которые затем размывались и теряли свечение, но из колонки не выходили. Результаты даны в табл.1.

Из табл. 1 видно, что достаточно полное элюирование ПАУ (91,3%) из колонки, заполненной силикагелем, импрегнированным едким натром, происходит 50-80 мл гексана. При этом первая фракция гексана содержит наибольшее количество липидов (0,06%) и не содержит ПАУ. Эту фракцию отрасывают.

Кроме того, из табл. 1 очевидно, что в присутствии жира выход ПАУ из колонки незначительно уменьшается (на 4,2%), а жир практически полностью остается на колонке - вымывается только 0,22%. При отбрасывании 1-й фракции гексана в выделенных фракциях выход жира составляет 0,16%. Количество жира при этом может превышать суммарную концентрацию ПАУ в 50000 раз.

Предел обнаружения суммы ПАУ - 10 нг в пробе.

Пример 3. 10 г печени осетра, содержащей 30% липидов (3 г), гомогенизировали, обезвоживали сульфатом натрия, экстрагировали дважды гексаном (порциями по 20 мл). Сконцентрированный экстракт сажали на колонку, заполненную силикагелем, импрегнированным едким натром. Результаты анализа даны в табл. 2
Из табл. 2 видно, что, как и в примерах 1, 2, ПАУ из колонки вымываются 50-80 мл гексана. Первую фракцию гексана объемом 10 мл отбрасывают, т.к. она содержит наибольшее количество липидов и не содержит ПАУ. Во фракциях (2-8), содержащих ПАУ, обнаружено только 0,19% липидов от общего их содержания. Фракции с ПАУ объединяют и концентрируют. Далее концентрацию суммы ПАУ определяют методом ВЭЖХ.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом характеризуется более высокой точностью определения ПАУ в биоматериале высокой жирности за счет повышения эффективности отделения углеводородов от липидов. При этом в 7-8 раз сокращаются продолжительность анализа (с 30-32 ч до 3,5-4,5 ч) и материальные затраты (стоимость реактивов в прототипе для одной пробы равна 156 рублей, в предложенном способе - 20 рублей).

Источники информации
1. Авторское свидетельство 1390561, МКИ G 01 N 30/06.

2. SFE plus C[18] lipid cleanup method for selective extraction and GC/MS quantitation of polycyclic aromatic hydrocarbons in biological tissues // Anal.Chem. - 1998. - 70, 15. - С. 3242-3248. - Англ. Место хранения ГПНТБ России.

3. Рекомендации по выделению, идентификации и количественному определению углеводородных компонентов нефтяных загрязнений в гидробионтах и в продуктах, вырабатываемых из них. Москва, ВНИРО, 1988, 27с., прототип.

Изобретение относится к области экологической химии и может быть использовано для определения полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) в биоматериале высокой жирности. Изобретение позволит повысить точность анализа ПАУ в биоматериалах высокой жирности, уменьшить трудовые и материальные затраты. Биологическую ткань, например ткань печени, гомогенизируют, обезвоживают, экстрагируют гексаном, полученный экстракт подвергают взаимодействию с щелочью и одновременно хроматографической очистке на колонке, где в качестве сорбента используют силикагель, импрегнированный едким натром, при этом углеводороды из колонки выделяют 50-80 мл гексана. Выделенные ПАУ идентифицируют и количественно определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). 2 табл.

Способ определения полициклических ароматических углеводородов в биологических объектах, включающий гомогенизацию и обезвоживание пробы, взаимодействие ее с щелочью, экстракцию гексаном, хроматографическую очистку на колонке с силикагелем с выделением углеводородов и их идентификацию с количественным определением, отличающийся тем, что экстракцию гексаном проводят перед взаимодействием пробы со щелочью, которое осуществляют одновременно с хроматографической очисткой, причем для хроматографии используют силикагель, импрегнированный едким натром, а углеводороды из колонки выделяют 50-80 мл гексана.