Способ определения тимола в биологических объектах Советский патент 1983 года по МПК G01N33/02 G01N33/12 

Ю

СО

о М

О) Изобретение относится к и может быть использовано при санитарно-гигиенической оценке продуктов животноводства после применения тим ла в качестве лечебного препарата f Известны способы определения фе НОЛОВ (тимол представляет собой изопропилметилфенол) на хроматографической пластине с помощью реактив Гиббса (2,6-дибромхинонхлоримида), диазотирующей смеси, состоящей из нитроанилина в соляной кислоте и нитрита натрия, 4-аминоантипирина, родамина Б, нитробенздиазонийфторбората (соль Прочный синий Б ) C Наиболее близким к изобретению по технической:сущности является способ определения фенолов в воде, заключающийся в экстракции фенолов из подкисленой воды хлороформом,отделении хлороформа едким натрием и повторном извлечении препарата из вновь подкисленной водной фазы эфиром с конечным определением на хроматографической пластине с силикагелем путем обработки, ее диазотирую щей смесью Гз 3. Недостатками этого способа являются низкая чувствительность (10 мг/л) и непригодность для опред ления фенолов в биологических объек (тах, содержащих коэкстрактивные вещества, мешающие выявлению фенолов методом тонкослойной хроматографии, Цель изобретения - повышение точ ности способа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения тимола в биологических Объектах включающему экстрагирование тимола из биологического объекта органичес КИМ растворителем, очистку полученного экстракта и хроматографию очищенного экстракта в тонком слое с последующей обработкой хроматографи ческих пластин солью Прочный сини Б и раствором едкого натра, после очистки экстракта дополнительно про водят э,кстракцию тимола гексаном, хроматографические пластины дополнительно обрабатывают 2-4 н.раствором соляной кислоты, а очистку проводят путем осаждения эгимола уксуснокислым свинцом и/или путем вымораживания экстракта. Пример 1. Навеску Ю г мяса, 2,5 г ткани легких измельчают и экстрагируют мясо 30 мл, а легки 15 мл ацетона на аппарате для встря хивания в течение 60 мин. Ацетоновый экстракт фильтруют через воронку с ватным фильтром в чисхгую колбу промывая фильтр 5-10 мл ацетона. К экстракту добавляют дистиллированну воду в соотношении 1:1,20%-ный водный раствор уксуснокислого свинца и расчета 1 мл на 60-70 мл водноацето нового экстракта и помеп ают в морозильную камеру бытового холодильника (температура ) на 60-120 мин (из мяса 60 мин,ткани легких 120 мин) Затем экстракты центрифугируют 3- , . 5 мин при частоте вращения 3000 Надосадочную жидкость сливают в чистую делительную воронку. Если в экстракте имеются взвешенные частицы его дополнительно фильтруют через воронку с ватным фильтром. После этого проводят реэкстракцию тимола в гексан. Для этого к отцентрифугированному водно-ацетоновому экстракту в делительную воронку добавляют дистиллированную воду в количестве, равном объему ацетона, взятого для экстракции, а также 19 мл гексана .и воронку встряхивают в течение 2 мин, Реэкстракцию в гексан проводят дважды (порциями по 10 мл), Гексановые экстракты объединяют, сушат- безводным сернокислым натрием и отгоняют, до объема 0,2-0,3 мл, который наносят на хроматографическую пластину силуфол или со слоем окись,алюминия-гипс. Рядом с пробой на пластине наносят известные количества тимола в гексане (стандарты), При необходимости проводят дополнительную очистку экстракта. Для этого хроматографическую пластину помещают вначале в камеру с гексаном. После прохождения растворителя через всю пластину ее вынимают из камеры, оставляют на воздухе до испарения гексана и затем Помещают в камеру со смесью подвижных растворителей гексан-ацетон в соотношении 24:6, . Пластину силуфол последов-ательно обрабатывают Од1%-ным раствором соли Прочный синий Б в 70%-ном этаноле, 0,1 н, раствором едкого натра,и 3 н, раствором соляной кислоты, После обработки пластины 0,1%-ным растбором соли Прочный синий Б , а затем 0,1 и, раствором едкого натра остатки тимола проявляются в виде пятен оранжевого цвета. После нанесения 3 н. раствора соляной кис лоты цвет пятен изменяется до синего иногда в пробе до сиреневого,t Пластину со слоем окись алюминиягипс обрабатывают О, раствором соли Прочный синий Б в 70%-йом этаноле и 3 н. раствором соляной кислоты. После обработки пластины солью тимол Проявляется в виде пятен оранлсевого цвета, которые через несколько секунд превращаются в темно-серые, После нанесения 1-2 капель 3 н,раствора соляной кислоты цвет пятен тимола изменяется до синего. Общее количество тимола в исследуемом объекте определяют по формуле .. X - ,., гдеX - общее количество тимола, в мг/кг; А - количество тимола, обнаруженное в пробе, мкг; Р - масса исследуемой пробы/ г, Количество тимола в пробе определдаот путем сравнения интенсивност окраски и площади пятна стандарта и пятна исследуемого образца. П р и м е р 2. Навеску 10 г 7«е;да растворяют в 10 мл дистиллирован ной воды и -экстрагируют 30 мл ацетона в течение 15 мин на аппарате для встряхивания. Водно-ацетоновый экстракт (верхний слой) отделяют с помощью, делит ель ной воронки добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:1 и помещают в морозильную камеру бытового холодильника на 45-60 мин, Затем экстракт фильтруют через ватный фильтр в делительную воронку., добавляют 30 мл дистиллированной и тимол реэкстрагируют гексансЯл дважды порциями по 10 мл и далее поступают, как в примере 1. . . ; В таблице представлены результаты определения количества тимола при добавлении к исследуемво объектам.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИМСША в БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ, включающий экстраги| ование тимола из &иологичес кого объекта органическим растворителем, очистку полученного экстракта и хроматографию очищенного экстракта в тонком слое с последующей обработкой хроматографических пластин солью Прочный синий Б и раствором едкого натра, о тл и чаю щи и с я тем, что, с целью повышения точности способа, после очистки экстракта дополнительно проводят экстракцию тимола гексанс 4, хроматографические пластины дополнительно обрабатывают 2--4 н. раствором соляной кислоты, а § очистку проводят путем осаждения тимола уксуснокислым свинцом и/или путем вымораживания экстракта.

Среднее значение ,07. Чувствительность предлагаемого ;способа составляет 0,5 мкг тимола в нанесенной на пластину пробе или для мяса и меда 0,05 мг/кг, .а для ткани легких 0,20 мг/кг. Предлагаемый способ дает возможность осуществлять контроль за чис:тотой продуктов животного происхожде ния после применения тимола с лечебной профилактической целью. Способ требует для проведения анализа небольшое количество реактивов (20- 40 мл ацетона, 20-30 мл гексана, 1 мл 20%-ного уксуснокислого свинца на анализ одной пробы). Максимум времени на проведение анализа 3,5-4 ч. Анализу могут быть подвергнуты мясо, ткани легких и мед, что отличает предлагаемый способ от известных и делает его перспективным для широкого использования.