СПОСОБ БИОДЕТЕКЦИИ ПОЛИАРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ (ПАУ) Российский патент 2003 года по МПК C12Q1/02 G01N33/18 C12N1/21 C12N1/21 C12R1/19 

Способ биодетекции ПАУ относится к токсикологии и может быть использован для определения ПАУ, растворенных в воде, с помощью люминесцирующих бактерий.

ПАУ являются одними из наиболее опасных токсикантов окружающей среды вследствие их мутагенного и канцерогенного действия на живые организмы. В организме человека и животных ПАУ подвергаются метаболическим превращениям с образованием диоловых эпоксидов - конечных метаболитов, реагирующих с клеточной ДНК. Результаты действия, наиболее опасного из ПАУ, бенз(а)пирена (БП) довольно хорошо изучены. Так, например, при инкубировании икры осетра с БП в концентрации 0,5 мкг/л отмечено повышение частоты аберраций хромосом в 1,9 раза. У личинок достоверный мутагенный эффект отмечен при концентрации в 100 раз меньшей, начиная с 0,005 мкг/л. Частота аберраций при этом превышала контрольный уровень в 1,8-3,4 раза соответственно.

ПАУ поступают в окружающую среду с выбросами промышленных предприятий и отопительных систем, с выхлопными газами наземного, воздушного и водного транспорта, со сбросами нефтепродуктов (в том числе аварийными и несанкционированными). Кроме технических, существуют и естественные источники ряда ПАУ.

Вышеназванные источники формируют глобальный фоновый уровень, который составляет для БП 0,0001 мкг/л для воды, 1-3 мкг/кг для донных песчаных отложений и 1-3 мкг/кг для водных растений пресных водоемов.

При поступлении ПАУ в водные объекты происходит их закономерное распределение в абиотических элементах водных экосистем с последующим накоплением в рыбах и других гидробионтах путем передачи по пищевой цепи.

Биолюминесцентный метод, где тест-объектом являются светящиеся бактерии, интенсивно используют в токсикологии.

Известно проведение экспресс-мониторинга окружающей среды путем измерения светового потока, испускаемого клетками Escherichia coli, несущими плазмиду pPLSI, в которую встроен люциферазный оперон светящихся бактерий Photobacterium leiognathi под контролем SOS-промотора (1).

Этот способ, определяющий генотоксичность пробы, требует присутствия активирующей смеси из микросом млекопитающих для определения действия промутагенов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является тест Microtox, который основан на регистрации падения люминесценции Vibrio fischeri. Концентрация ПАУ, вызвавшая 50%-ное подавление свечения (ЕС[50]), составила 0,5 мкг/мл, для ЕС[20] - 1,13 мкг/мл (2).

Очевидно, что чувствительность тест-объекта Microtox позволяет регистрировать концентрации ПАУ, которые на несколько порядков превышают фоновые.

Целью настоящего изобретения является повышение чувствительности определения ПАУ.

Эта цель достигается тем, что ПАУ выявляются по изменению биолюминесценции суспензии штамма E.coli, несущего плазмиду, содержащую lux-оперон, например штамма НВ 101/pUC7 lux 37, зарегистрированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под номером В-5356. Плотность суспензии составляет 10⁵-10⁷ кл/мл в зависимости от чувствительности люминометра, время экспозиции с тестируемой пробой 60-120 мин.

Сравнение прототипа с заявленным техническим решением показало, что указанные выше признаки являются отличительными, в связи с чем заявленный способ соответствует критерию "новизна".

При поиске указанных отличительных признаков в других технических решениях, относящихся к определению ПАУ по их токсичности, таковых не обнаружено. Таким образом, заявленное решение соответствует критерию "изобретательский уровень".

Достижение положительного эффекта согласно цели изобретения обеспечивается следующим.

1. Использование рекомбинантного штамма E.coli B5356.

2. Чувствительность предложенного метода по сравнению с прототипом выше в 1000 раз, что позволяет выявлять ПАУ по их токсичности в концентрациях, близких к фоновым.

3. Исключается применение системы метаболической активации, таким образом, способ упрощается и значительно удешевляется, так как составляющие системы (микросомальная фракция S-9, NADP, глюкоза-6-фосфат) достаточно дорогостоящи.

Способ осуществляется следующим образом.

Культуру бактерий Е.соli штамма В5356 выращивают в течение 18 часов при 36^oС на чашках Петри со средой LB (3), содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Затем клетки ресуспендируют в буфере А (0,1% глюкоза, 0,85% NaCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5). Буфер А готовят непосредственно перед опытом, смешивая с бидистиллированной водой необходимые количества стерильных растворов: 19% NaCI; 20% глюкозы; 1М Трис-НСl рН 7,5. Для измерения интенсивности биолюминесценции используют люминометр ЛТ-01 (НИБИ РГУ, Россия). Плотность суспензии доводят до величины, дающей интенсивность биолюминесценции 0,4-1,2 единицы прибора.

Суспензию аликвотами по 900 мкл разливают в стеклянные центрифужные пробирки. В контрольные пробирки добавляют по 100 мкл бидистиллированной воды, в опытные по 100 мкл раствора бенз(а)пирена в исследуемой концентрации. В вариантах с использованием активации в контрольные пробирки к 995 или 975 мкл суспензии добавляют по 5 или 25 мкл фракции S-9, в опытные - по 5 или 25 мкл фракции S-9, содержащей бенз(а)пирен в исследуемой концентрации.

Интенсивность люминесценции опытной и контрольной проб измеряют через 60 или 120 мин инкубации при 25^oС.

В качестве показателя токсичности используют величину Т, вычисляемую по формуле
T=100%(I_o-I)/I_o,
где I_о и I - соответственно интенсивность биолюминесценции контрольной и исследуемой пробы.

Согласно общепринятым методам анализа результатов (3) по величине индекса токсичности анализируемые пробы классифицируются на четыре группы (см. табл. 1).

Токсический эффект считают достоверным при статистически значимом превышении I над I_о (критерий Стьюдента, р<0,01).

Для приготовления растворов используют воду, дважды перегнанную в стекле. Все неорганические реактивы имеют марку х.ч., органические - ч.д.а. Раствор бенз(а)пирена готовят следующим образом: навеску вещества растворяют в гексане. Необходимый объем гексанового раствора в пробирке с ватной пробкой помешают под тягу для испарения гексана. Затем в случае применения активирующей смеси добавляют рассчитанное количество раствора с фракцией S-9 или для варианта без активации переводят бенз(а)пирен в водный раствор через промежуточный растворитель - ацетон.

Активирующую смесь готовят непосредственно перед опытом в следующем соотношении:
- 0,4 мл фракции S-9;
- 3 мг NАDР;
- 0,5 мл калий-фосфатного буфера;
- 0,1 мл раствора Sold;
- 3,5 мг глюкозо-6-фосфат.

Пример 1. Суспензию клеток Е.соli, полученную описанным выше способом, аликвотами по 900 мкл разливали в 6 стеклянных пробирок. В три контрольные пробирки добавляли по 100 мкл бидистиллированной воды. В опытные пробирки добавляли по 100 мкл раствора БП так, чтобы его концентрация в пробирке была равна 0,1 мкг/л или 1 мкг/л. Уровень биолюминесценции в контроле составил после 60 мин экспозиции - для концентрации БП 0,1 мкг/л составили 0,555±0,056 (Т= -36,02%) и 1,253±0,175 (Т= -107,17%) соответственно; для концентрации БП 1 мкг/л - 0,342±0,006 (Т=16,18%) и 0,451±0,024 (Т=25,45%) соответственно.

Пример 2. Аналогично примеру 1 в опыте и контроле использовали метаболическую активацию. В контрольные пробирки к суспензии клеток бактерий добавляли по 5 мкл фракции S-9, в опытные - 5 мкл фракции S-9, содержащей БП в концентрации 0,1 и 1 мкг/л. Уровень биолюминесценции в контроле после 60 мин экспозиции составил 1,547±0,078; после экспозиции 120 мин - 2,52±0,08. Для опытных вариантов после 60-минутной экспозиции уровень биолюминесценции равнялся 1,291±0,016 (Т=16,55%) при концентрации БП 0,1 мкг/л и 0,93±0,065 (Т= 39,88%) при концентрации БП 1 мкг/л. После 120 мин инкубации этот показатель вырос до 1,92±0,03 (Т=23,81%) для 0,1 мкг/л БП и 1,562±0,083 (Т=38,01%) для 1 мкг/л БП.

Пример 3. Аналогично примеру 2 использовали метаболическую активацию, увеличив содержание активирующей смеси до 25 мкг на пробирку. Уровень биолюминесценции в контроле составил 1,361±0,049 после 60 мин и 2,76±0,15 после 120 мин экспозиции. Для варианта с БП 0,1 мкг/л показатель равнялся 1,272±0,004 (Т=6,53%) и 2,33±0,11 (Т=15,58%) соответственно. Для варианта с БП 1 мкг/л показатель был равен 0,957±0,087 (Т=29,71%) и 1,643±0,127 (Т= 40,47%) соответственно.

Результаты опытов сведены в табл. 2.

Из данных табл. 2 следует, что данный метод позволяет обнаружить токсический эффект изученных концентраций БП без присутствия активирующей микросомальной смеси. Время обработки тест-объекта существенно для проявления токсического действия БП в концентрации 0,1 мкг/л. Достоверный токсический эффект для этой концентрации в опыте без активации регистрируется после 120-минутной экспозиции. Однако согласно величине коэффициента токсичности (-36%) можно говорить о "токсичности образца" и после 60 мин инкубации. Отметим, что БП в концентрации 0,1 мкг/л после 120-минутной экспозиции индуцирует двукратное повышение уровня биолюминесценции по сравнению с контролем. Наблюдаемый эффект возможно связан с активизацией механизма окисления БП у Е.соli.

Источники информации
1. Зинчук О.А., Гвозденко С.И. Использование биолюминесцентного анализа SOS-ответа клеток Escherichia coli для скрининга гетоноксических веществ. //2-й междунар. Симп. "Ресурсосберег. технол. в аквакультуре", Адлер, 4-7 окт. 1999: Матер. докл. - Краснодар, 1999 - с.40.

2. Пределы чувствительности и величины ЕС (50) анализа с использованием Vibrio fischeri для определения микроколичеств загрязняющих веществ в природных донных отложениях и экстрактах из них. Salizzato M., Bertato V., Pavoni В. , Ghirardini A.V., Ghetti P.F. Sensitivity limits and EC50 values of the Vibrio fischeri test for organic micropollutants in natural and spiked extracts fouv sediments// Environ. Toxicol. And Chem. - 1998. - 17, N 4. - p. 655-661 - (прототип).

3. Суслов А.Н., Данилов B.C. Определение токсичности воды и водных экстрактов из объектов окружающей среды по интенсивности биолюминесценции бактерий. Методические рекомендации. - M.: Издание официальное, 1996. С.11.

Изобретение относится к токсикологии. ПАУ выявляют по изменению биолюминесценции рекомбинантного штамма Е. coli В-5356, несущего плазмиду, содержащую lux-оперон, при плотности суспензии 10⁵-10⁷ кл/мл и экспозиции 60-120 мин. Способ обеспечивает повышение чувствительности определения ПАУ. 2 табл.

Способ биодетекции полиароматических углеводородов (ПАУ), включающий использование люминесцирующих микроорганизмов в качестве биосенсора, отличающийся тем, что ПАУ выявляют по изменению биолюминесценции рекомбинатного штамма Е. coli B-5356, несущего плазмиду, содержащую lux-оперон, при плотности суспензии 10⁵-10⁷ кл/мл и экспозиции 60-120 мин.