СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТОКСИЧНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2002 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/66 

Изобретение относится к области экологии и генетической токсикологии и может быть использовано при тестировании химических веществ, загрязняющих окружающую природную среду.

Известные способы определения генотоксичности достаточно точны для сильных мутагенов с преобладанием генотоксического эффекта над токсическим. В случае тестирования мутагена с сильным токсическим эффектом возникают ошибки измерения. При определении генотоксичности сложных смесей, какими являются природные соединения, также возникают ошибки измерений и требуется защита от возникающих при переходе к тестированию артефактов.

Известен способ определения генотоксичности химических веществ с помощью теста Эймса (1), который заключается в индукции обратных мутаций в бактериальных генах канцерогенами.

Недостаток способа заключается в том, что при увеличении концентрации гистидина или его предшественников в полуселективной среде увеличивается спонтанный фон прототрофов, что значительно снижает точность оценки генотоксичности химических веществ. Соответственно, при тестировании экстрактов, богатых аминокислотами, например, рыб такая ошибка становится систематической.

Известен выбранный в качестве прототипа способ определения генотоксичности (2) с помощью SOS-lux теста, в котором тестируемое химическое вещество инкубируют в жидкой среде с рекомбинатным штаммом E.coli, несущим плазмиду, в котором lux оперон находится под контролем SOS-промотора (SOS-lux штамм), затем измеряют интенсивность биолюминесценции контрольных культур и содержащих тестируемое химическое вещество, а генотоксичность определяют по фактору индукции. Последний рассчитывают по формуле
I=Lc /Lk,
где I - фактор индукции
Lc - интенсивность свечения суспензии SOS-lux штамма, содержащего тестируемое химическое вещество;
Lк - интенсивность свечения контрольной суспензии.

В способе используется рекомбинатный штамм E.coli, несущий плазмиду, в котором lux оперон находится под контролем SOS-промотора. Повреждение ДНК этого штамма увеличивает интенсивность его люминесценции. В случае сложных соединений, которыми являются природные пробы, использование известного способа может вызвать серьезные артефакты, т.к. одни химические вещества усиливают свечение бактерий, другие - подавляют их свечение, действуя на фермент бактериальную люциферазу. Возникает необходимость корректировки результатов измерений.

В задачу изобретения входит повышение точности определения генотоксичности химических веществ за счет корректировки артефактов, возникающих при тестировании как чистых, так и сложных природных смесей.

Эта задача решается способом, который реализуется следующей совокупностью существенных признаков.

Проводят инкубацию тестируемого химического вещества на жидкой питательной среде со штаммом E.coli, несущим плазмиду, в котором lux оперон находится под контролем SOS-пpoмотopa (SOS-lux штамм), и отдельно со штаммом ( lux-штаммом), генотип которого аналогичен SOS-lux штамму, но lux оперон находится под контролем конститутивного промотора, затем измеряют интенсивность биолюминесценции суспензии контрольных культур и содержащих анализируемые химические вещества и определяют фактор индукции и коэффициент подавления свечения по формулам
I=Lc/Lk (1); K=Ic/Ik (2),
где I - фактор индукции;
Lc - интенсивность свечения суспензии SOS-lux штамма, содержащего тестируемое химическое вещество;
Lк - интенсивность свечения контрольной суспензии SOS-lux штамма;
К - коэффициент подавления свечения;
Iс - интенсивность свечения суспензии lux-штамма в присутствии тестируемого химического вещества;
Ik - интенсивность свечения контрольной суспензии lux-штамма.

После этого корректируют фактор индукции по формуле
I'=I/K, (3)
где I' - скорректированный фактор индукции.

Характеризующий генотоксичность фактор индукции I показывает, во сколько раз увеличилась интенсивность свечения тестерного штамма после инкубации с мутагеном.

Коэффициент подавления свечения К показывает, во сколько раз мутаген изменяет (подавляет или усиливает) свечение клеток с постоянным количеством молекул фермента бактериальной люциферазы.

Скорректированный фактор индукции I' показывает, во сколько раз увеличилось количество молекул люциферазы, т.е. интенсивнее ли стал работать SOS-lux оперон после инкубации с мутагеном.

Сравнение прототипа и заявляемого способа показывает, что последний отличается от прототипа тем, что проводят инкубацию тестируемого химического вещества с дополнительным штаммом, генотип которого аналогичен SOS-lux штамму, но lux оперон находится под контролем конститутивного промотора, а после измерения интенсивности биолюминесценции суспензий контрольной культуры дополнительного штамма и содержащей тестируемое химическое вещество определяют коэффициент подавления свечения и производят поправку фактора индукции.

Введение поправки на подавление активности люциферазы значительно повышает точность тестирования как чистых веществ, так и сложных химических веществ. Использование дополнительного штамма для определения этой поправки обеспечивает достаточно высокую пропускную способность тестов, а также защиту от возникающих при тестировании смесей артефактов.

Примеры осуществления способа
Пример 1. Тестировали N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина (МННГ) концентрации 5•10^-7 и 5•10^-8 М.

Штаммы E.coli выращивали на среде LВР (пептон - 10г, дрожжевой экстракт - 5г, хлористый натрий - 10г на 1л раствора; рН 7.0) в присутствии 50 мкг/мл ампициллина. В 50 мл среды вносили 0,1 мл ночной культуры E.coli С 600 и инкубировали в термостате в течение одного часа при t=37^oС. Затем добавляли среду LВР до достижения оптической плотности культуры 0,1 (550 нм). Аликвоты этой культуры по 1 мл переносили в стерильные пробирки и добавляли в них по 10 мкл тестируемого химического вещества. Содержимое пробирок тщательно перемешивали. Пробирки помещали на 1 час в термостат при t=37^oС. В процессе инкубации пробирки несколько раз встряхивали.

По окончании инкубации культуры охлаждали до комнатной температуры. На люминометре ЛТ-01 измеряли интенсивности биолюминесценции контрольных культур и содержащих анализируемые химические вещества. Получили следующие данные.

Интенсивность свечения контрольной суспензии SOS-lux штамма Lk=0,4
Интенсивность свечения суспензии SOS-lux штамма, содержащего N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (МННГ) концентрации 5•10^-7 М Lc=1,0,
а МННГ концентрации 5•10^-8 М Lc=0,69.

Интенсивность свечения контрольной суспензии lux-штамма
Ik=l,95.

Интенсивность свечения суспензии lux-штамма в присутствии МННГ концентрации 5•10^-7, М Iс=1,8, а для концентрации МННГ - 5•10^-8 М Iс=1,5.

Фактор индукции (I) МННГ обеих концентраций, коэффициент подавления свечения (К) определяли по формулам (1),(2).

Затем корректировали фактор индукции по формуле (3).

Данные по генотоксичности МННГ известным и предлагаемым способами представлены в таблице 1.

Пример 2. Аналогично примеру 1 тестировали перекись водорода (Н₂O₂) концентрации 10^-5 и 10^-6 М. Получены следующие исходные данные: Интенсивности свечения контрольных культур SOS-lux штамма Lк=0,4 и lux-штамма Ik = 1,95. Интенсивность свечения суспензии SOS-lux штамма, содержащего перекись водорода концентрации 10^-5 М Lc=2,3; концентрации 10^-6 М Lc=0,81. Интенсивность свечения суспензии lux-штамма в присутствии перекиси водорода концентрации 10^-5 М Iс=0,3; концентрации 10^-6 М Iс=0,81.

По формулам (1), (2) определяли фактор индукции (I) перекиси водорода обеих концентраций и коэффициент подавления свечения (К), после чего по формуле (3) корректировали фактор индукции.

Данные по генотоксичности перекиси водорода известным и предлагаемым способом представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что все исследуемые химические вещества способны маскировать индукцию SOS-lux оперона за счет подавления активности люцеферазы, что приводит к заниженным результатам генотоксичности.

В таблице приведен коэффициент коррекции I'/I, который показывает, во сколько раз применение дополнительного штамма позволяет откорректировать фактор индукции.

Из таблицы видно, что при действии сильных мутагенов, таких как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин с преобладанием генотоксического эффекта над токсическим, величина коэффициента коррекции не превышает 1.31. Но при действии перекиси водорода - мутагена с сильным токсическим эффектом, коэффициент коррекции увеличивается до 7.

Пример 3. Аналогично примерам 1, 2 было проведено тестирование экстрактов тканей осетровых рыб.

Данные по генотоксичности экстрактов тканей осетровых рыб в SOS-lux тесте с поправкой на подавление активности люциферазы даны в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что при тестировании генотоксичности тканей рыб чаще всего встречаются ложноотрицательные результаты, т.е. в изученных экстрактах встречаются химические вещества, маскирующие индукцию SOS-lux оперона за счет подавления активности люцеферазы. Реже встречаются неспецифические индукторы свечения, которые приводят к ложноположительным и завышенным результатам.

Преимуществом предложенного способа по сравнению с известным является то, что с его помощью можно достаточно просто определять генотоксичность как чистых веществ, так и сложных природных смесей, корректировать артефакты, возникающие при их тестировании, обеспечивая при этом высокую пропускную способность тестов.

Использованные источники
1. Книга "Методы общей бактериологии". Москва: Мир, 1984, стр. 48-55.

2. Птицын Л.Р. Биологический анализ SOS-ответа клеток Escherichia coli. Генетика, 1996г., т.32, 3, с.354-358 (прототип).

Изобретение относится к экологии и генетической токсикологии. Может быть использовано при тестировании химических соединений, загрязняющих окружающую природную среду. Способ заключается в том, что проводят инкубацию тестируемого вещества на жидкой питательной среде со штаммом E.coli, несущим плазмиду, в котором Lux oneрон находится под контролем SOS-промотора (SOS-lux штамм). Отдельно инкубируют это вещество со штаммом (Lux-штаммом), генотип которого аналогичен SOS-lux штамму, но Lux оперон находится под контролем конститутивного промотора. Измеряют интенсивность биолюминесценции суспензии контрольных культур и содержащих анализируемые химические вещества. Определяют фактор индукции I и коэффициент подавления свечения К по формулам I= Lc/Lk (1), K=Ic/Ik (2), где I - фактор индукции, Lc - интенсивность свечения суспензии SOS-lux штамма, содержащего тестируемое химическое вещество, Lk - интенсивность свечения контрольной суспензии SOS-lux штамма, К - коэффициент подавления свечения, Iс - интенсивность свечения суспензии lux-штамма в присутствии тестируемого химического вещества, Ik - интенсивность свечения контрольной суспензии lux-штамма. После чего корректируют фактор индукции по формуле I'=I/K, где I' - скорректированный фактор индукции. Способ позволяет повысить точность определения генотоксичности химических соединений за счет корректировки артефактов, возникающих при тестировании как чистых веществ, так и природных смесей. 2 табл.

Способ определения генотоксичности химических веществ, включающий инкубацию тестируемого химического вещества с рекомбинантным штаммом Е. соli, несущим плазмиду, в котором lux оперон находится под контролем SOS-lux-промотора, измерение интенсивности биолюминесценции контрольных культур и содержащих тестируемое химическое вещество и определение генотоксичности по фактору индукции, который рассчитывают по формуле
I= Lc/Lk,
где I - фактор индукции;
Lc - интенсивность свечения суспензии SOS-lux штамма, содержащего тестируемое химическое вещество;
Lk - интенсивность свечения контрольной суспензии,
отличающийся тем, что инкубацию тестируемого химического вещества проводят с дополнительным штаммом, генотип которого аналогичен SOS-lux штамму, но lux оперон находится под контролем конститутивного промотора, а после измерения интенсивности биолюминесценции суспензий контрольной культуры дополнительного штамма и содержащей тестируемое химическое вещество определяют коэффициент подавления свечения по формуле
K= Ic/Ik,
где К - коэффициент подавления свечения;
Ic - интенсивность свечения суспензии дополнительного штамма в присутствии тестируемого вещества;
Ik - интенсивность свечения контрольной суспензии дополнительного штамма,
и корректируют фактор индукции по формуле
I'= I/K,
где I' - скорректированный фактор индукции.