СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРИОПРОТЕКТОРА ДЛЯ КРИОСРЕД Российский патент 2004 года по МПК C12N5/00 C12N9/02 A61D19/02 

Изобретение относится к биотехнологии и криобиологии, в частности к способам получения криопротекторов для криоконсервации, и может быть использовано в качестве добавок в криосреды для длительного хранения в замороженном состоянии клеток, эмбрионов, спермы и образцов тканей.

Известен способ изготовления раствора для консервации клеток посредством замораживания [1], в котором в основной раствор в качестве криопротектора добавляют глицерин или этиленгликоль. Количество глицерина составляет примерно 10-20% (об./об.). Количество этиленгликоля - около 5-10% (масс./об.).

Для обеспечения более полной жизнеспособности при глубоком замораживании объектов в основные среды, содержащие глицерин, диметилсульфоксид или этиленгликоль, а также буферные питательные растворы, в качестве криопротектора дополнительно вводят антифризовые гликопротеиды. Сырьем для получения антифризовых гликопротеидов являются арктические (тресковые) или антарктические (нототениевые) рыбы. Гликопротеиды выделяют из сыворотки крови этих рыб способом дифференциального осаждения и очистки посредством гельфильтрации либо изоэлектрического фокусирования [2].

Состав углеводной части антифризовых гликопротеидов позволяет связывать и особым образом структурировать молекулы воды, предотвращая образование крупных повреждающих внутриклеточные структуры кристаллов льда при глубоком замораживании клеток. Этот эффект используется в криобиологии.

Недостатком известных способов получения антифризовых гликопротеидов являются трудоемкость и неэкономичность, связанная с предварительным получением сыворотки крови, что вызывает удорожание конечного продукта.

Кроме того, использование гликопротеидов крови антарктических рыб в настоящее время затруднительно из-за снижения численности нототении в естественном ареале. Арктические рыбы более доступны как источник антифризовых гликопротеидов - криопротекторов, однако при получении из них гликопротеидов требуется большое количество исходного сырья.

В связи с вышеизложенным используемые гликопротеиды дороги и малодоступны для широкого массового применения.

Задача изобретения - получение более дешевого и доступного антифризового гликопротеида

Поставленная задача достигается тем, что в качестве источника антифризового гликопротеида используют гребневик, например, Beroe ovata, а гликопротеид выделяют из его тела.

Новизной способа и основным существенным признаком изобретения является использование нового, нетрадиционного для криобиологии источника сырья для получения гликопротеидов - гребневиков, например, Beroe ovata.

Выбор гребневиков, например, Beroe ovata как источника гликопротеида связан с тем, что они могут обитать в арктических водах при отрицательных температурах морской воды, ареал их широтного распространения и температурной толерантности совпадает с тресковыми рыбами, кровь которых используется для получения криопротекторов. Биохимический состав тела гребневиков представлен преимущественно гликопротеидами и гликозаминогликанами. Таким образом, гребневики являются более доступным по массе и количеству гликопротеидов объектом для получения криопротекторов. Важным криозащитным эффектом для использования в качестве криопротектора является также свойство гликопротеидов тела гребневиков выступать в роли “структурных антиоксидантов”, что обеспечивает дополнительную сохранность жизнеспособности объектов при размораживании.

Способ получения гликопротеидов.

Для приготовления криопротекторных антифризовых гликопротеидов используют разноразмерных гребневиков Beroe ovata длиной от 40 до 95 мм. Биомассу гребневиков гомогенизируют до получения однородного вязкого раствора. Полученный гомогенат центрифугируют при 2500-3000 об/мин для осаждения относительно плотных образований. Надосадок представляет собой опалесцирующую прозрачную слабовязкую желеобразную жидкость, которую используют для выделения криопротектора. Содержание гликопротеидов в жидкости составляет от 110 до 160 мкг; серомукоидов - от 60 до 85 мкг; гликозаминогликанов - от 105 до 160 мкг по остаткам глюкозы в 1 мл гомогената в зависимости от размера используемых особей. В надосадок добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 28-30% (об./об.) и смесь охлаждают при температуре 4-6°С в течение 6-8 ч. Смесь центрифугируют при 2500-3000 об/мин в течение 15 мин, полученный осадок отбрасывают, а в надосадок по каплям добавляют 0,8-1N раствор НС1 до создания рН 5,0, затем добавляют цетилтриметиламмония бромид до конечной концентрации 0,1% и смесь охлаждают при температуре 4-6°С в течение 6-8 ч. Смесь центрифугируют при 2500-3000 об/мин в течение 15 мин, полученный осадок отбрасывают, а в надосадок при перемешивании добавляют 0,5-0,7 N раствор хлорной кислоты до конечной концентрации 0,3 N и через 15 мин центрифугируют при 5500-6000 об/мин в течение 10 мин. В надосадочную жидкость добавляют 5%-ный раствор ацетона в соотношении 1:1 об/об и центрифугируют при 5500-6000 об/мин в течение 10 мин. Осадок дважды промывают 96%-ным этиловым спиртом методом центрифугирования и растворяют в трис-НСl буфере рН 8,2. Полученный раствор антифризового гликопротеида берое очищают от микропримесей методом гельфильтрации на хроматографической колонке, заполненной сефадексом G-25. Фракцию гликопротеида высушивают методом вакуумного испарения или лиофилизации. Выход составляет в среднем 45-55 мг гликопротеида из 1 кг взятой массы берое.

Пример 1.

Для приготовления криопротекторных гликопротеидов используют гребневиков Beroe ovata, которых гомогенизируют. Полученный гомогенат центрифугируют при 1800 об/мин. Надосадок используют для выделения криопротектора. В надосадок добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 48% (об/об) и смесь охлаждают при температуре 4-6°С в течение 3 ч, после чего центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин, полученный осадок отбрасывают. В надосадочную жидкость при перемешивании добавляют 0,4 N раствор хлорной кислоты до соотношения 1:2 об/об и через 15 мин центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин, осадок отбрасывают, добавляют охлажденный ацетон в соотношении 1:3 об/об и центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин. Осадок высушивают методом вакуумного испарения или лиофилизации. Выход составляет в среднем 35 мг гликопротеида из 1 кг взятой массы Beroe ovata.

Пример 2.

Гребневики берое длиной 40-95 мм гомогенизируют до получения однородного вязкого раствора. Полученный гомогенат центрифугируют при 2500 об/мин для осаждения относительно плотных образований. В надосадок добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 28% (об/об) и смесь охлаждают при температуре 4-6°С в течение 6-8 ч. Смесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, полученный осадок отбрасывают, а в надосадок по каплям добавляют 0,8 N раствор НСl до создания рН 5,0, затем добавляют цетилтриметиламмония бромид до конечной концентрации 0,1% и смесь охлаждают при температуре 4-6°С в течение 6-8 ч. Смесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, полученный осадок отбрасывают, а в надосадок при перемешивании добавляют 0,5 N раствор хлорной кислоты до конечной концентрации 0,3 N и через 15 мин центрифугируют при 5500 об/мин в течение 10 мин. В надосадочную жидкость добавляют 5%-ный раствор ацетона в соотношении 1:1 об/об и центрифугируют при 5500 об/мин в течение 10 мин. Осадок дважды промывают 96%-ным этиловым спиртом методом центрифугирования и растворяют в трис-НСl буфере рН 8,2. Полученный раствор антифризового гликопротеида берое, как в примере 1, очищают от микропримесей и высушивают. Выход составляет в среднем 45 мг гликопротеида из 1 кг взятой массы Beroe ovata.

Пример 3.

Разноразмерные гребневики Beroe ovata длиной от 40 до 95 мм гомогенизируют до получения однородного вязкого раствора. Полученный гомогенат центрифугируют при 3000 об/мин для осаждения относительно плотных образований. В надосадок добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 30% (об/об) и смесь охлаждают при температуре 4-6°С в течение 6-8 ч. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин, полученный осадок отбрасывают, а в надосадок по каплям добавляют 1N раствор HCl до создания рН 5,0, затем добавляют цетилтриметиламмония бромид до конечной концентрации 0,1% и смесь охлаждают при температуре 4-6°С в течение 6-8 ч. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин, полученный осадок отбрасывают, а в надосадок при перемешивании добавляют 0,7 Н раствор хлорной кислоты до конечной концентрации 0,3N и через 15 мин центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин. В надосадочную жидкость добавляют 5%-ный раствор ацетона в соотношении 1:1 об/об и центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин. Далее, как и в примере 2, осадок дважды промывают этиловым спиртом и растворяют в трис-НСl буфере рН 8,2. Полученный раствор антифризового гликопротеида берое очищают от микропримесей, а затем высушивают. Выход составляет в среднем 55 мг гликопротеида из 1 кг взятой массы берое.

Пример 4.

Для приготовления криопротекторных глнкопротеидов используют гребневиков Beroe ovata. Биомассу берое гомогенизируют. Полученный гомогенат центрифугируют при 6000 об/мин. Надосадок используют для выделения криопротектора. В надосадок добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 36% (об/об) и смесь охлаждают при температуре 4-6°С в течение 3 ч. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин, полученный осадок отбрасывают, а в надосадок при перемешивании добавляют 0,6 N раствор хлорной кислоты до соотношения 1:1 об/об и через 15 мин центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин. В надосадочную жидкость добавляют охлажденный до 0°С ацетон в соотношении 1:2 об/об и центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин. Далее процесс получения гликопротеида проходит, как и в примере 1. Выход в этом случае составляет в среднем 35 мг гликопротеида из 1 кг взятой массы гребневика Beroe ovata.

Как видно из примеров, наибольший выход гликопротеида получен во втором и третьем вариантах.

Эффективность полученных предлагаемым способом гликопротеидов получила практическое подтверждение. В качестве объекта криоконсервации использовали донорскую сперму. Контролем служил тот же образец спермы в криосреде без добавления гликопротеидов гребневика Beroe ovata. Сравнение обоих сред показало, что в стандартной среде спермии после размораживания сохраняли прямолинейную подвижность в течении 2-7 мин, а при добавлении гликопротеида гребневика Beroe ovata - 22-36 мин.

Гребневик Beroe ovata является доступным и массовым видом морей, поэтому использование предлагаемого способа позволит получать необходимые количества криопротекторных гликопротеидов при значительном упрощении и удешевлении процесса их получения.

Использованные источники:

1. Патент Японии 3025931, МКИ C12N 5/06.

2. Цветкова Л.И. и др. Методическое пособие по криоконсервации спермы карпа, лососевых и осетровых видов рыб. - М.: ВНИИПРХ, 1997. - 11 с.

Изобретение относится к биотехнологии и криобиологии. Способ включает использование гребневика, например Beroe ovata, в качестве источника гликопротеида для криосред. Способ позволяет повысить качество криосред при значительном упрощении и удешевлении процесса их получения.

Способ получения криопротектора для криосред, включающий выделение гликопротеида из гидробионтов, отличающийся тем, что в качестве источника гликопротеида используют гребневик, например Веrое ovata, а гликопротеид выделяют из его тела.