ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SPECIES - ПРОДУЦЕНТ ХИТИНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 2002 года по МПК C12N1/20 C12N9/42 

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологического производства и может найти применение для получения хитинолитического ферментного препарата.

Известны штаммы Serratia marcescens - продуценты хитиназы [1]. Однако известные штаммы являются условно патогенными для человека и теплокровных животных и поэтому их промышленное применение небезопасно для обслуживающего персонала.

Наиболее ближайшим к заявляемому штамму (прототипом) является штамм бактерий Pseudomonas maltophilia CR-332D, обладающий хитинолитической активностью [2] . Однако эффективность известного штамма как продуцента хитинолитических ферментов сравнительно невысокая.

Цель изобретения - расширение ассортимента доступных продуцентов и выделение природного штамма-продуцента хитинолитических ферментов, отличающегося высокой эффективностью гидролиза хитина.

Новый штамм выделен из супесчаной почвы Иглинского района Республики Башкортостан и хранится в коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра Российской Академии Наук под номером 182.

Штамм характеризуется следующими признаками. Клетки палочковидной формы, подвижные, грамотрицательные, неспорообразующие. Колонии на мясопептонном агаре (МПА) круглые, с ровными краями, слабовыпуклые, непрозрачные, серовато-белые. Пигмент желто-зеленый, диффундирующий в среду, нефлюоресцирующий.

Физиолого-биохимические признаки. В факторах роста не нуждается. По отношению к кислороду - аэроб. Оксидазная реакция положительная. Желатин не разжижает. Гидролизует лецитин, крахмал, продуцирует каталазу, не редуцирует нитраты до нитритов. Образует аргининдигидролазу. Накапливает поли-β-оксибутират. Растет при 4^oС и при 41^oС, растет на среде с 10 мг/мл Ba²⁺. В качестве источника углерода использует глюкозу, ксилозу, рамнозу, сахарозу, галактозу, рибозу, трегалозу, L-валин, β-аланин, L-аргинин, малонат. Не усваивает арабинозу, мальтозу.

Штамм устойчив к ампициллину (500 мкг/мл), стрептомицину (50 мкг/мл), эритромицину (500 мкг/мл) и чувствителен к гентамицину (100 мкг/мл) и канамицину (100 мкг/мл). Штамм Pseudomonas species 182 проявляет активность по подавлению жизнедеятельности фитопатогенных грибов Bipolaris sorokiniana, Fusarium solani, F. culmorum, Altemaria altemata.

Хранится штамм на косяках МПА в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца.

По физиолого-биохимическим признакам штамм не соответствует ни одному из описанных в определителе бактерий (Берджи. т.1: Пер. с англ./Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П.Спита, Дж. Стейли, С. Уильямса. -М.: Мир, 1997.-432с.) и идентифицирован как Pseudomonas species 182.

Штамм Pseudomonas species 182 не является возбудителем оппортунистических инфекций животных, паразитом животных и человека.

Использование бактерий Pseudomonas species в качестве продуцента хитинолитических ферментов до настоящего времени не описано.

Пример 1. Определяют хитинолитическую активность нового штамма Pseudomonas species 182. Для этого штамм выращивают на среде с 1,5% агара следующего состава, г/л дистиллированной воды:
Дрожжевой экстракт - 0,5
(NH₄)₂SO₄ - 1
MgSO₄•7H₂O - 0,3
КН₂PO₄ - 1,36
В качестве источника углерода в среду вводят коллоидный хитин. Хитин добавляют в среду в количестве 0,5%. Культивируют штамм на чашках Петри при 28^oС.

Эффективность гидролиза хитина определяли по величине отношения диаметра зоны просветления мутной среды вокруг колонии к диаметру колонии.

Результаты представлены в таблице и свидетельствуют о наличии хитинолитической активности у штамма Ps. species 182, причем эффективность гидролиза хитина у нового штамма выше, чем у штамма по прототипу (ориентировочно на 15%).

Пример 2. Для получения хитинолитических ферментов штамм Ps. species 182 выращивают в жидкой культуре на среде, приготовленной по примеру 1, с добавлением 0,1% пептона. Инкубируют при 28^oС в течение 5-7 дней в условиях аэрации. Далее биомассу отделяют центрифугированием. Супернатант культуральной жидкости представляет собой неочищенный препарат хитиназы.

Для определения активности препарата в чашки Петри разливали агаризованную среду из примера 1 с добавлением 0,5% хитина. После застывания среды с помощью стерильного пробочного сверла вырезали в ней лунки, в которые вносили исследуемый препарат. Чашки Петри инкубировали при 28^oС. Активность препарата оценивали по диаметру зон просветления агара, образующихся вокруг лунок, результаты не отличались от приведенных в таблице.

Литература
1. Moreal J., Relse E.T. The chitinase of Serratia marcescens //Can. J. Microbiology.-1969.-v. 15, p. 689-696.

2. Патент 2031119, Россия, кл. С 12 N 9/42, 1/20, 1995, БИ 8.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии. Штамм выделен из супесчаной почвы. Выделенный штамм хранится в коллекции Института биологии УНЦ РАН под номером 182. Штамм бактерий Pseudomonas species 182 подавляет рост различных видов фитопатогенных грибов, вызывающих корневые гнили растений. Штамм не является возбудителем оппортунистических инфекций животных, паразитом животных и человека, отличается более высокой гидролитической активностью хитина. 1 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas species 182 коллекция УНЦ РАН - продуцент хитинолитических ферментов.