Способ получения культуральной жидкости SеRRатIа маRсеSсеNS, обладающей хитиназной активностью Советский патент 1992 года по МПК C12N9/42 C12N9/42 C12R1/43 

1

(21)4887682/13 (22)04.12.90 (46)07.11.92. Бюл. №41

(71)Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина и Вышневолоцкий завод ферментных препаратов

(72)Д.В.Юсупова, О.В.Порфирьева, В.П.Варламов, Р.Б.Соколова, О.С.Синявина и Г.В.Комарова

(56) Чигалейчик А.Г., Пириева Д.А., Рылкин С.С. Хитиназа Serratia marcescens ВКМ В- 851. - Прикладная биохимия и микробиология. 1976, т.12, вып.4, с.581-586.

Авторское свидетельство СССР № 1661214, кл. С 12 N 9/14, 1989.

Авторское свидетельство СССР № 1730146, кл. С 12 N 9/42, 05.02.90. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬ- НОЙ ЖИДКОСТИ Serratia marcescens, ОБЛАДАЮЩЕЙ ХИТИНАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

(57) Использование: биотехнология, может быть использована для биоконверсии хи- тинсодержащих отходов в белок одноклеточных дрожжей, в качестве биохимического реактива при количественном и качественном определении хитина в составе клеточной стенки грибов и других биологических объектов, для борьбы с насекомыми, для разрушения клеточной стенки грибов. Сущность изобретения: в качестве продуцента хитиназы используют мутант- ный штамм Serratia marcescens ВКПМ В- 4870, который выращивают в течение 48 ч на среде, содержащей, г/л: кристаллический хитин 10,0-30,0; кукурузный экстракт 2,5- 5,0; K2HPO/J-3H20 4,0; MgS04 7H20 0,9; рН среды 8,5 t-30°C. Активность культуральной жидкости достигает в среднем 2000 мкМмл ч , удельная активность - 1210 мкМ.мг белка .ч . 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности, к получению внеклеточной хитиназы S.marcescens (К.Ф.3.2.1.4), которая может быть использована для биоконверсии хитин соде ржа UIHX отходов в белок одноклеточных дрожжей, борьбы с вредителями сельскохозяйственных растений, в качестве биохимического реактива при качественном и количественном определении хитина, для разрушения клеточной стенки дрожжей.

Известны способы получения культу- ральной жидкости с хитиназной активностью с использованием штаммов ВКМ В-851 11.41-10 3.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ

получения культуральной жидкости с хитиназной активностью, в котором штамм 414- 10 выращивается на среде, содержащей коллоидный хитин в качестве источника углерода и азота, дрожжевой экстракт в качествеисточникавитаминов, культивирование проводится в течение 96- .

Недостатками прототипа являются необходимость получения хитина в коллоидной форме, что требует дополнительно времени, реактивов и оборудования; длительное время культивирования; относительно низкая активность фермента в культуральной жидкости.

Целью изобретения является получение культуральной жидкости с высокой хитиназVJ

ч оэ ю

W

о

ной активностью на среде с кристаллическим хитином.

Поставленная цель достигается путем культивирования продуцента S.marcescens ВКПМ В-4870 2 при оптимальной температуре и аэрации в одной питательной среде, содержащей КаНРО ЗНзО; MgSO/rTHaO, кристаллический хитин в концентрации 10,0-30,0 г/л. в качестве источника витаминов - кукурузный экстракт в концентрации 2,5- 5,0 г/л, а культивирование проводят в течение 48 ч. Применение данного способа позволяет повысить хитиназную активность культуральной жидкости в 5-6 раз по сравнению с прототипом.

П р и м е р 1. При постановке опытов использовали питательную среду следующего состава, г/л: кристаллический хитин 10,0; К2НРО4 ЗН20 4,0; MgS047H20 0,9, дрожжевой экстракт 0,25, рН среды 8,5.

Подготовка посевного материала. Культуру S.marcescens ВКПМ В-4870 выращивают в течение 1 сут в пробирках со скошенным мясо-пептонным агаром при 30°С. Выросшие клетки смывают 0,5%-ным раствором NaCl. Полученный таким образом посевной материал засевают в колбы с питательной средой из расчета 0,05 оптических единиц (Дб5о) на 1 мл среды.

Постановка опыта. Посевной материал засевают в конические колбы с 200 мл питательной среды. Отношение обьема пита- тельной среды в к объему колбы 1:5. Посевы выращивают на качалке (200 об/мин) при 30°С в течение 72 ч. Пробы отбирают через каждые 24 ч. Бактериальные клетки отделяют центрифугированием при 16000д в течение 10 мин. В надосадочной жидкости определяют хитиназную активность и содержание белка по методу Лоури.

Определение хитиназной активности. Хитиназную активность определяли по количеству образующегося при гидролизе коллоидного хитина М-ацетил-Д-глюкоза- мина с динитросалициловым реактивом. Инкубационная смесь объемом 1 мл содержит 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 6,75, 0,4 мл коллоидного хитина (12,5 г/л), 0,1 культуральной жидкости. Реакционную смесь инкубируют при 50°С в течение 30 мин. Затем пробы разбавляют в 2 раза дистиллированной водой, охлаждают,негидро- лизованныйхитинотделяют

Центрифугированием при 7000д в течение 10 мин, а в надосадочной жидкости определяют количество М-ацетил-Д-глюкозамина. Для этого к пробе 1 мл добавляют равный объем реактива, содержащего динитросали- циловую кислоту, и нагревают в кипящей

водяной бане в течение 15 мин. Пробы охлаждают и измеряют поглощение при 570 нм. Количество М-ацетил-Д-глюкозамина рассчитывают по калибровочной кривой. За

единицу активности хитиназы принимают количество фермента, которое при гидролизе коллоидного хитина освобождает 1 мкМ М-ацетилглюкозамина 1 ч инкубации.

В качестве субстрата используют хитин

0 фирмы Серва или мелко размолотый хитин завода им. Войкова.

Коллоидный хитин получают следующим образом. К 1 г тонко размолотого хитина добавляют последовательно 5 мл

5 ацетона и 30 мл концентрированной соляной кислоты при постоянном перемешивании. Полученную однородную взвесь фильтруют через стеклоткань так, чтобы фильтрат поступал в колбу, содержащую 1,5

0 л 30% этанола при постоянном перемешивании. Через 2 ч хлопья коллоидного хитина отделяют центрифугированием при ЗОООд в течение 30 мин и отмывают от кислоты дистиллированной водой до нейтрального рН.

5 Коллоидный хитин дополнительно гомогенизируют, диализуют в течение 1 сут против воды и используют в опытах.

На питательной среде, где в качестве источника углерода и азота использовали

0 кристаллический хитин в концентрации 10 г/л и в качестве источника витаминов-дрожжевой экстракт в концентрации 0,25 г/л, активность хитиназы в среде составляет через 24 ч 100 ед/мл и 220 ед/мг белка; через

5 48 ч - 300 ед/мл и 440 ед/мг белка; через 72 ч - 385 ед/мл и 380 ед/мг белка.

Примеры 2-18. В дальнейшем выращивание бактерий и определение хитиназной активности проводили, как в примере 1,

0 за исключением того, что в среде изменяли концентрацию хитина от 10,0 до 30,0 г/л, концентрацию дрожжевого экстракта от 0,25 до 2,0 г/л, заменяли дрожжевой экстракт на кукурузный экстракт в концентра5 ции2,5-5,0 г/л. Примеры 2-18и полученные результаты приводятся в таблице. Как видно из таблицы, наблюдается повышение активности хитиназы в среде при увеличении концентрации хитина до 30 г/л, активность

0 хмтиназы увеличивается при этом на 250%. Дальнейшее повышение концентрации хитина в среде нецелесообразно с экономической точки зрения.

Оптимальной концентрацией дрожже5 вого экстракта для биосинтеза хитиназы является концентрация 0,5 г/л. Повышение концентрации дрожжевого экстракта не вызывает повышения активности фермента.

Замена дрожжевого экстракта (0,5 г/л) кукурузным экстрактом в концентрации 2,5

г/л по сухому веществу равноценна и не снижает активности хитиназы в среде. Кукурузный экстракт является отходом производства, он более дешев и доступен по сравнению с дрожжевым экстрактом и широко применяется в ферментной промышленности.

Максимальный уровень хитиназной активности достигался при использовании кристаллического хитина в концентрации 30,0 г/л, кукурузного экстракта в концентрации 2,5 г/л, при выращивании в течение 48ч .и был равен 2000 ед/мл и 1210ед/мг белка.

Сравнение хитиназной активности в культуральной жидкости, полученной данным способом, с описанными ранее показывает, что предлагаемый способ позволяет увеличить.активность хитиназы в среде в 5-6 раз по сравнению с прототипом.

Формула изобретения Способ получения культуральной жидкости Serratla marcescens. обладающей хитиназной активностью, путем

культивирования продуцирующего микроорганизма при оптимальной температуре биосинтеза и аэрации в водной питательной среде, содержащей хитин, источник витаминов, К2НР04-ЗН20 и MgS04 7H20, о т л ичающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм SerraHa marcescens ВКПМ В- 4870, хитин используют кристаллический в

концентрации 10,0-30,0 г/л, в качестве источника витаминов-кукурузный экстракт в концентрации 2,5-5,0 г/л. а культивирование проводят в течение 48 ч.

Продолжение таблицы