СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ СТРЕПТОКОККОВ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 C12Q1/14 A61K39/09 C12N1/20 C12R1/46 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к разработке питательной среды для выращивания стрептококков.

Известно использование бульона Хоттингера и питательной среды для выращивания энтерококков, содержащей панкреатический гидролизат серопротеина или альбумина, полученных из отходов глобулинового производства (Бошьян Е.Г с соавт. А.С. N 1412283 и N 1418284, 1986 г.).

Недостатком является сложность технологического процесса приготовления питательной среды, трудности в ее стандартизации.

За прототип взята среда N 2 Курской биофабрики, используемая в биологической промышленности для выращивания микобактерий туберкулеза и состоящая из следующих компонентов в граммах на 1 литр дистиллированной воды: лимонная кислота - 10,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный - 5,0; лимоннокислый аммоний - 5,0; хлористый натрий - 0,5; сернокислый магний - 0,5; сернокислое железо - 0,05; сернокислый цинк - 0,1; хлористый кобальт - 0,002; глицерин - 50; аспарагин - 1,0; гликокол - 1,0.

Среда представляет собой солевые питательные растворы, отличающиеся высокими питательными свойствами для микроорганизмов.

Попытки использовать для выращивания стрептококков данную синтетическую среду не имели положительного результата. Пересеянная с мясо-пептонного бульона (МПБ) на жидкую синтетическую среду культура стрептококков не обеспечивала надлежащий рост микроорганизмов. В отдельных пробирках, флаконах, колбах рост биомассы стрептококков составлял не более 1 - 2 млрд. микробных тел в 1 мл, что неэффективно.

Цель предлагаемого изобретения - разработка среды для выращивания стрептококков с большим содержанием микробных тел в 1 мл культуральной жидкости, пригодной для промышленного культивирования стрептококков при производстве стрептококковых антигенов и вакцинных препаратов.

Разработанная среда содержит компоненты в следующем соотношении на 1 литр дистиллированной воды: лимонная кислота - 4,9 - 5,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный - 4,9 - 5,0; хлористый натрий - 1,9 - 2,0; сернокислый магний - 4,9 - 5,0; сернокислое железо - 0,04 - 0,05; аспарагин - 0,9 - 1,0; гликокол - 0,9 - 1,0 и глицерин 30,0 - 31,0 мл.

Результаты исследований показали, что при увеличении содержания в питательной среде хлористого натрия с 0,5 до 1,5; 2,0; 2,5 г обеспечивалось последовательное накопление биомассы стрептококков соответственно 2 - 2,5; 3 - 3,5; 3,5 - 4,0; 3,5 - 4,0 млрд. микробных тел в 1 мл культуральной жидкости. Дальнейшее, начиная с 2 - 2,5 г/л, увеличение содержания в питательной среде хлористого натрия не сопровождалось увеличением биомассы стрептококков.

Лучшие результаты по накоплению биомассы стрептококков, до 8 - 9 млрд. микробных тел в 1 мл культуральной жидкости были получены на вариантах сред при уменьшении количества лимонной кислоты с 10 г до 5 г. Дальнейшее уменьшение количества лимонной кислоты в питательной среде до 4,8 - 4,5 г/л не сопровождалось увеличением биомассы стрептококков.

Увеличение содержания в питательной среде сернокислого магния с 0,5 г до 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 5,5 г/л обеспечивало последовательное накопление биомассы стрептококков 4 - 4,5; 5 - 6; 6 - 7; 7,5 - 8; 8,5 - 9; 8,5 - 9 млрд. микробных тел в 1 мл культуральной жидкости. Дальнейшее, начиная с 5 - 5,5 г/л, увеличение содержания в питательной среде сернокислого магния не сопровождалось увеличением биомассы стрептококков.

Снижение в питательной среде глицерина с 50 до 30 мл не влияло ни на увеличение, ни на снижение интенсивности роста и накопления биомассы стрептококков. В то же время дальнейшее уменьшение содержания в питательной среде глицерина, начиная с 30 до 25 мл, сопровождалось снижением накопления биомассы стрептококков. Таким образом установлено, что оптимальное количество содержания глицерина в питательной среде определено в пределах 30 - 31 мл.

Следует отметить, что в ходе поисковых опытов нами не отмечено влияние на рост стрептококков хлористого кобальта, лимоннокислого аммония и сернокислого цинка, в связи с чем они были исключены из компонентов нового варианта среды.

Таким образом, использование данного варианта жидкой солевой синтетической питательной среды обеспечивало хороший и бурный рост стрептококков с первого дня инкубирования и позволяло при 4-5-кратном пассировании на ней микробов, при плотности посева до 90 - 100 млрд. микробных тел на 1 мл среды, стабилизировать и обеспечить максимальное накопление биомассы до 10 - 12 млрд. микробных тел в 1 мл культуральной жидкости.

По данным Панина А. Н. (Автореф. дис. д.в.н., Стрептококкозы свиней, 1992, 27 с. ), для приготовления вакцинного препарата накопление биомассы стрептококков не должно быть менее 4 млрд./см³. Следовательно, данный вариант солевой синтетической питательной среды вполне пригоден для использования в биологической промышленности при производстве стрептококковых антигенов.

Среду готовят путем последовательного растворения или предварительно смешанных компонентов в дистиллированной воде с последующей нейтрализацией аммиаком до pH 7,0 - 7,1 перед автоклавированием.

Изобретение предназначено для накопления биомассы стрептококков. Среда содержит компоненты в следующем соотношении, г на 1 л дистиллированной воды: лимонная кислота 4,9-5,0, фосфорнокислый калий двухзамещенный 4,9-5,0, хлористый натрий 1,9-2,0 сернокислый магний 4,9-5,0, сернокислое железо 0,04-0,05, аспарагин 0,9-1,0, гликокол 0,9-1,0 и глицерин 30,0-31,0 мл. Среда обеспечивает хороший и бурный рост стрептококков с первого дня инкубирования и позволяет при 4-5-кратном пассировании и плотности посева 90-100 млн. микробных клеток (м.к.) в 1 мл среды стабилизировать и обеспечить максимальное накопление биомассы до 10-12 млрд. м.к. в 1 мл культуральной жидкости.

Среда для выращивания стрептококков, содержащая лимонную кислоту, фосфорнокислый калий двузамещенный, хлористый натрий, сернокислый магний, сернокислое железо, аспарагин, гликокол и глицерин, отличающаяся тем, что среда содержит компоненты в следующем соотношении, г на 1 л дистиллированной воды:
Лимонная кислота - 4,9 - 5,0
Фосфорнокислый калий двузамещенный - 4,9 - 5,0
Хлористый натрий - 1,9 - 2,0
Сернокислый магний - 4,9 - 5,0
Сернокислое железо - 0,04 - 0,05
Аспарагин - 0,9 - 1,0
Гликокол - 0,9 - 1,0
Глицерин - 30,0 - 31,0 мл