СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ С ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ in vitro С ПРИМЕНЕНИЕМ НАДФ•Н-ОКСИДАЗНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ Российский патент 2002 года по МПК C12Q1/26 G01N33/49 A61K39/39 

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунофармакологии и фармации.

Несмотря на целый ряд известных способов выявления веществ с потенциальной иммуномодулирующей активностью остается актуальным создание новых, более экономичных, экспресс-методов, в том числе биохимических методов с использованием ферментов в качестве тест-объектов.

Известен способ оценки фагоцитарной активности клеток миелоидного ряда, заключающийся в окрашивании живых макрофагов нитросиним тетразолием (НСТ) (Okamura N. et al., 1976; Гордиенко С.М., 1983). В этом случае необходимо иметь свежие функционирующие фагоцитарные клетки и лабораторных животных для получения крови либо использовать в модельных экспериментах переживающие клетки. Данный способ имеет невысокую пропускную способность.

Известен способ оценки фагоцитарной активности клеток миелоидного ряда по хемилюминесценции клеток, развивающейся при контакте полиморфно-ядерных лейкоцитов или макрофагов с иммуномодуляторами (Зенков Н.К., Куликов В.Ю., 1985; Kato Т. , 1985). В данном случае необходимы свежие фагоцитирующие клетки и прибор для измерения хемилюминесценции. Этот способ имеет более высокую чувствительность и пропускную способность, но также требует использования только свежих полиморфно-ядерных лейкоцитов и макрофагов.

Нами предлагается биохимический способ выявления веществ с потенциальной иммуномодулирующей активностью in vitro с использованием гомогенатов белых клеток периферической крови и перитонеальных макрофагов. Он основан на эффекте активации НАДФ•Н-оксидазы иммуномодуляторами in vitro при их добавлении к гомогенату клеток.

НАДФ•Н-оксидаза - ключевой фермент терминальной стадии фагоцитоза - респираторного взрыва. В спокойных не активированных клетках фермент существует в виде четырех пространственно разобщенных субъединиц и не активен. Известно, что активный НАДФ•Н-оксидазный комплекс образуется в клетках при их взаимодействии с иммуномодуляторами.

Предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью, хорошей воспроизводимостью, меньшей трудоемкостью и более высокой экономичностью, чем известные способы. Отличительной чертой способа является возможность использования длительно хранившихся замороженных клеток, заготовленных заранее и стандартизованных. Это позволяет при проведении скрининга исключить влияние факторов, связанных со старением клеток. Кроме того, данным способом можно определять интервал действующих концентраций изучаемого вещества в одной и той же пробе.

Патентов по способам выявления веществ с потенциальной иммуномодулирующей активностью с применением НАДФ•Н-оксидазы в качестве тест-объекта найдено не было.

Пример 1. Изучение влияния иммуностимулятора метилурацила (2,4-диоксо-6-метил-1,2,3,4-гетрагидропиримидин) на скорость НАДФ•Н-оксидазной реакции белых клеток периферической крови in vitro.

В кювету измерения и сравнения спектрофотометра помещают К, Na-фосфатный буфер в концентрации 65 mM рН 5,55-5,65, гомогенат из 1 млн. клеток, перемешивают. В кювету измерения добавляют НАДФ•Н в конечной концентрации 0,7 мкМ, перемешивают, включают запись поглощения при 340 нм. Через 1-2 мин одновременно в обе кюветы добавляют метилурацил в концентрации 0,01•10^-3 - 0,50•10^-3 нмоль/мл пробы и продолжают запись поглощения при 340 нм в течение 1,5-2 мин. Без добавления иммуностимулятора метилурацила поглощение при 340 нм не изменяется, что свидетельствует об отсутствии НАДФ•Н-оксидазной реакции. После добавления метилурацила скорость ферментативной реакции составляет 0,12±0,07 - 0,35±0,07 рмоль/(мин•10³ клеток).

Пример 2. Изучение влияния иммуностимулятора тактивина (полипептидный препарат из вилочковой железы крупного рогатого скота) на скорость НАДФ•Н-оксидазной реакции белых клеток периферической крови in vitro.

В кювету измерения и сравнения спектрофотометра помещают К, Na-фосфатный буфер в концентрации 65 mM рН 5,55-5,65, гомогенат из 1 млн. клеток, перемешивают. В кювету измерения добавляют НАДФ•Н в конечной концентрации 0,7 мкМ, перемешивают, включают запись поглощения при 340 нм. Через 1-2 мин одновременно в обе кюветы добавляют тактивин в концентрации 1,0-5,0 мкг/мл пробы и продолжают запись поглощения при 340 нм в течение 1,5-2 мин. Без добавления иммуностимулятора тактивина поглощение при 340 нм не изменяется, что свидетельствует об отсутствии НАДФ•Н-оксидазной реакции. После добавления тактивина скорость ферментативной реакции составляет 0,48±0,02 - 0,93±0,02 рмоль/(мин•10³ клеток).

Пример 3. Изучение влияния иммуностимулятора сухого экстракта травы эхинацеи на скорость НАДФ•Н-оксидазной реакции в белых клетках периферической крови in vitro.

В кювету измерения и сравнения спектрофотометра помещают К, Na-фосфатный буфер в концентрации 65 mM pH 5,55-5,65, гомогенат из 1 млн. клеток, перемешивают. В кювету измерения добавляют НАДФ•Н в конечной концентрации 0,7 мкМ, перемешивают, включают запись поглощения при 340 нм. Через 1-2 мин одновременно в обе кюветы добавляют сухого экстракта травы эхинацеи в концентрации 3 мкг/мл пробы и продолжают запись поглощения при 340 нм в течение 1,5-2 мин. Без добавления сухого экстракта травы эхинацеи поглощение при 340 нм не изменяется, что свидетельствует об отсутствии НАДФ•Н-оксидазной реакции. После добавлении сухого экстракта травы эхинацеи скорость ферментативной реакции составляет 0,25±0,05 рмоль/(мин•10³ клеток).

Пример 4. Изучение влияния сухого экстракта травы змееголовника на скорость НАДФ•Н-оксидазной реакции в белых клетках периферической крови in vitro.

В кювету измерения и сравнения спектрофотометра помещают К, Na-фосфатный буфер в концентрации 65 mM рН 5,55-5,65, гомогенат из 1 млн. клеток, перемешивают. В кювету измерения добавляют НАДФ•Н в конечной концентрации 0,7 мкМ, перемешивают, включают запись поглощения при 340 нм. Через 1-2 мин одновременно в обе кюветы добавляют сухого экстракта травы змееголовника в концентрации 3 мг/мл пробы и продолжают запись поглощения при 340 нм в течение 1,5-2 мин. До и после добавления сухого экстракта травы змееголовника поглощение при 340 нм не изменяется, что свидетельствует об отсутствии НАДФ•Н-оксидазной реакции.

Литература
1. Хаитов Р.М., Гущин И.С., Пинегин Б.В., Зебрев А.И. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов // Ведомости Фармакологического комитета. -1999. - 1. -С.31-36.

2. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П. Хемилюминесценция клеток животных // Итоги науки и техники. Биофизика. - Т.24. - М.: ВИНИТИ, 1989. - 173 с.

3. Машковский М.Д. Лекарственные средства. 4.2. - М., 1993. - 736.

4. Меньшиков В. В. Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина. -1987. -117 с.

5. Новиков Д. К. , Новикова В.И. Оценка иммунного статуса. - Мн.: Витебский мединститут. 1996. -282 с.

6. Энциклопедический словарь лекарственных растений и продуктов растительного происхождения: Ученое пособие / Под ред. Г.П. Яковлева и К.Ф. Блиновой. - С-Пб.: Специальная литература, 1999. -407 с.

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунофармакологии и фармации. В гомогенатах белых клеток, или фракции полиморфно-ядерных лейкоцитов периферической крови, или макрофагов определяют скорость НАДФ•Н-оксидазной реакции до и после добавления изучаемых веществ в пробу. О наличии иммуномодулирующей активности судят по повышению скорости НАДФ•Н-оксидазной реакции. Специфическим свойством иммуномодуляторов является непосредственная активация НАДФ•Н-оксидазы в гомогенатах неактивированных белых клеток периферической крови и перитонеальных макрофагов. На примере иммуномодуляторов различного химического строения, таких как производное пиримидина метилурацил, полипептидный препарат из вилочковой железы крупного рогатого скота Тактивин, сухой экстракт травы эхинацеи, действующим началом которого являются сесквитерпеновые лактоны, установлено свойство потенциальных иммуномодуляторов активировать НАДФ•Н-оксидазу в гомогенатах "спокойных" белых клеток периферической крови и макрофагов при непосредственном добавлении к гомогенатам in vitro. Доказательством специфичности предложенного способа служит отсутствие активирующего эффекта у сухого экстракта травы змееголовника, обладающего антиоксидантными свойствами. Изобретение позволяет повысить чувствительность и экономичность выявления иммуномодулирующей активности in vitro.

Способ выявления веществ с потенциальной иммуномодулирующей активностью in vitro с применением НАДФ•Н-оксидазной тест-системы, характеризующийся получением в качестве тест-объекта гомогената неактивированных свежих или хранившихся при низких температурах белых клеток, или полиморфно-ядерных лейкоцитов периферической крови, или перитонеальных макрофагов, измерением в гомогенатах скорости НАДФ•Н-оксидазной реакции без добавления титруемого вещества и после его добавления, по появлении которой судят о наличии иммуномодулирующей активности у тестируемого вещества.