ШТАММ PESTIVIRUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЛАПИНИЗИРОВАННОЙ ВИРУСВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ Российский патент 1997 года по МПК C12N7/00 A61K39/187 

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии, в частности к штамму вируса классической чумы свиней, используемого для изготовления лапинизированной вирусвакцины против данного заболевания.

Для специфической профилактики классической чумы свиней (КЧС) в основном используют для получения вирусвакцин культуральные и лапинизированные штаммы вируса КЧС.

Известен лапинизированный штамм "Гудзон" Flavivirus suis "Hudson" вируса КЧС, который использовали в Советском Союзе в 60-х годах для изготовления лапинизированной вирусвакцины против КЧС [1,2]
Недостатком этого штамма является то, что он обладает повышенной реактогенностью. После вакцинации поросят температурная реакция наблюдается у 70-80% животных в течение 2-8 суток и достигает 40,6-42^oC. У 20-30% привитых животных отмечают угнетенное состояние, уменьшение поедаемости корма. Средний привес животных за месяц (в сравнении с контрольными) снижается на 4,2 кг.

Целью изобретения является получение высокоиммуногенного лапинизированного штамма вируса КЧС без повышенной реактогенности.

Новый штамм вируса КЧС получен из штамма "Гудзон" вируса КЧС путем последовательных пассажей через организм кролика и путем перемещающихся последовательных пассажей на культуре клеток ППС, а также кроликах с использованием метода "предельных разведений" с идентификацией в реакции нейтрализации со специфической сывороткой против эталонных штаммов вируса КЧС, селекцией вариантов по признакам безвредности для поросят 1,5-3-месячного возраста, иммуногенности методом контрольного заражения привитых свиней вирулентным штаммом вируса КЧС, интенсивности его репродукции в чувствительной системе организме кролика.

Штамм вируса депонирован в коллекции Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер "ГМ-94" ДЕП.

Штамм Pestivirus "ГМ-94" ВГНКИ характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки.

При электронномикроскопическом исследовании штамм "ГМ-94" ВГНКИ вируса КЧС представлен типичным для флавивирусов отдельными вирионами округлой формы, диаметром 40-44 нм. На ультратонких срезах величина нуклеокапсида определена в 34-38 нм, а толщина липопротеиновой оболочки 3 нм. Коэффициент седиментации равен 104±18 по Сведбергу.

Биологические свойства.

Штамм вируса КЧС "ГМ-94" ВГНКИ хорошо размножается в организме кролика. В крови и селезенке кролика, зараженного внутривенно, вирус накапливается через 48-72 часа в титре 3,5-4,5 lg ИКД₅₀/см³ (ИКД инфекционная кроличья доза).

Штамм вируса КЧС "ГМ-94" ВГНКИ относительно слабо размножается в культуре клеток ППС и в перевиваемой культуре клеток ПК-15. Инфекционная активность вируса через 96 часов, при заражении указанных культур клеток из расчета 0,015-0,03 ИКД₅₀ на клетку, при инкубации 37^oC, достигает значения 2,5-3,5 lg ИКД₅₀/см.

В первичных и перевиваемых культурах клеток штамм цитопатического действия не вызывает.

Антигенные свойства.

При парентеральном введении штамм "ГМ-94" ВГНКИ вируса КЧС в организм свиньи и кролика вызывает образование вируснейтрализующих антител в титре 1: 16-1:64.

Реактогенные свойства.

После инъекции штамма "ГМ-94" ВГНКИ вируса КЧС поросятам в дозе 100-1000 ИКД₅₀ у 20-25% привитых животных отмечает повышение температуры тела до 40,1-41^oC, которая удерживается в течение 1-4 суток без угнетения общего состояния. Средний привес животных (за месяц) после инъекции им штамма снижается (в сравнении с контролем) всего на 0,6-1,2 кг.

Иммуногенные свойства.

Штамм "ГМ-94" ВГНКИ вируса КЧС при парентеральном введении свиньям стимулирует образование напряженного иммунитета. В опытах на поросятах установлено, что после внутримышечного введения суспензии штамма вируса на 10-14 день у них при исследовании в реакции нейтрализации (PH) появляются антитела в титре 1:16 с последующим увеличением к 21 дню до 1:32-1:64.

Стабильность.

Приобретенные свойства (отсутствие реверсии и ослабленная реактогенность) штамм "ГМ-94" ВГНКИ вируса КЧС сохраняет в течение 8 последовательных пассажей на свиньях.

Сохраняемость.

В лиофилизированном состоянии при 2-8^oC штамм "ГМ-94" ВГНКИ вируса КЧС хранится в течение года без существенного снижения иинфекционной активности для кроликов. В нативном состоянии (кровь кролика) хранится при температуре 30^oC в течение 6 месяцев.

Дополнительные сведения о штамме.

Свободен от вирусных, бактериальных и микоплазменных контаминантов.

Штамм "ГМ-94 ВГНКИ используют для изготовления лапинизированной вирусвакцины против классической чумы свиней.

Пример 1. Кроликам живой массой 2,5-3,0 кг внутривенно вводят суспензию штамма "ГМ-94" ВГНКИ вируса КЧС в дозе 100 ИКД₅₀ в объеме 1,0-1,5 см³. У животных ежедневно измеряют температуру тела. Кроликов, реагирующих через 48-96 часов повышением температуры до 40,1-41,8^oC, обескровливают с извлечением селезенки и брыжеечный лимфоузлов. Полученную кровь и органы (селезенка и лимфоузлов) кроликов гомогенизируют с соблюдением правил антисептики. К гомогенату добавляют антибиотики в эффективном количестве, после чего разливают в стерильные флаконы (ампулы) по 2-4 cm³ и подвергают сублимационному высушиванию с последующей укупоркой.

Активность вируса в готовой вакцине, при проверке на кроликах, составляет 3,0-4,0 lg ИКД₅₀/см³.

Готовый биопрепарат представляет собой таблетку темно-красного цвета, который сохраняет свои иммунобиологические свойства в течение 12 месяцев при температуре не выше 8^oC.

Пример 2. Вирусвакцину против КЧС из штамма "ГМ" ВГНКИ, полученную по примеру 1, проверяют на иммуногенность на поросятах. С этой целью из смеси содержимого трех флаконов готовят на физиологическом растворе разведения 1: 10, 1:100, 1:1000 и 1:10000. Каждый разведением вирусвакцины по 2,0 см³ прививают по два поросенка внутримышечно, с внутренней стороны бедра или в области шеи. В качестве контроля оставляют двух поросят, которым вирусвакцину не вводят. После вакцинации за поросятами ведут наблюдение в течение 14 суток, ежедневно измеряя температуру тела. У вакцинированных животных (30%) отмечают повышение температуры тела до 40,1-41,0^oC без признаков угнетения и снижения поедаемости корма. Констатируют отсутствие заболеваемости среди вакцинированных животных.

Через 14 дней поросят, которых иммунизировали вирусвакциной в разведении 1:100, 1:1000, 1:10000 и двух контрольных (непривитых), заражают внутримышечно вирулентным штаммом вируса КЧС "Ши-Мынь" в дозе 10⁵ЛД₅₀.

За зараженными поросятами в течение 14 суток проводят наблюдение, ежедневно измеряя температуру тела. Устанавливают гибель 2-х опытных, вакцинированных (разведение 1:10000) и 2-х контрольных невакцинированных животных. Иммуногенную активность приготовленной вакцины рассчитывают по Керберу в модификации Ашмарина, которая составляет в данном случае 3,5 lg ИМД₅₀/2 см³.

Пример 3. В одном из неблагополучных по КЧС свинокомплексе поросят 30 и 90-дневного возраста иммунизируют в дозе 2 см³ лапинизированной вирусвакциной против КЧС из штамма "ГМ-94" ВГНКИ, полученной по примеру 1. Всего вакцинируют 81600 поросят. После вакцинации этой вакциной (через 12-15 дней) падеж поросят от чумы резко снизился (до 0,4%), а через 30-40 дней - прекратился. В последующем заболевших чумой среди этих животных не было. Всего за период наблюдения от КЧС пало 1870 гол. (2,3%).

В двух секторах этого же комплекса (группа доращивания) иммунизируют 620 поросят 10-кратной дозой культуральной вирусвакцины против КЧС ЛК-ВНИИВВиМ. Через 60-70 дней выделяют животных больных чумой. Всего в этих секторах пало от чумы и вынужденно убито 204 поросенка (32%), что свидетельствует о низкой эффективности данной вакцины в неблагополучном по КЧС свинокомплексе. Из-за высокого процента заболеваемости поросят КЧС, оставшееся поголовье животных убивают на санбойне.

Пример 4. Вирусвакцину против КЧС, изготовленную из штамма "ГМ-94" ВГНКИ, полученную по примеру 1, применяют в благополучных по КЧС секторах неблагополучного комплекса. Вакцинации подвергают поросят в те же сроки и в той же дозе по примеру 3. За животными проводят наблюдение с выборочной термометрией. У некоторых поросят (20-25%) отмечают кратковременное (в течение 2-4 дней) повышение температуры тела без видимых признаков угнетения или снижения поедаемости корма. Устанавливают полную сохранность поголовья после вакцинации. На 14-й день выборочно у животных берут кровь, получают сыворотки, которые исследуют в реакции нейтрализации. Титры антител у вакцинированного поголовья составляют 1:16-1:64, что говорит о высокой иммуногенности вакцины.

Проведенные исследования и испытания показывают, что новый штамм Pestivirus "ГМ-94" ВГНКИ высокоиммуногенен, безвреден для поросят и свиней, что позволяет рекомендовать его для изготовления эффективного биопрепарата против классической чумы свиней.

Применение в ветеринарной практике вакцины, полученной из данного штамма, позволит расширить арсенал высокоэффективных биопрепаратов, снизить затраты на проведение мероприятий по борьбе с классической чумой свиней.

Использование: биотехнология, ветеринария вирусология, штамм пестивируса, вакцина против классической чумы свиней. Сущность изобретения: новый штамм Pestivirus "ГМ-94" ВГНКИ обладает высокой иммуногенностью и малой реактогенностью и предназначен для изготовления лапинизированной вирусвакцины против классической чумы свиней. Штамм вируса классической чумы свиней депонирован в коллекции вирусов и микроорганизмов ВГНКИ и имеет регистрационный N "ГМ-94" - ДЕП. Вакцина, изготовленная из штамма Pestivirus "ГМ-94" ВГНКИ, безвредна для поросят и свиней. Сохранность среди благополучного вакцинированного поголовья составляет 100%, а среди неблагополучного по чуме свиней - 97,7%. Средний геометрический титр антител в сыворотках крови у поросят и свиней составляет 1:16 - 1:64. Вакцину, содержащую антиген из штамма Pestivirus "ГМ-94" ВГНКИ, используют с профилактической целью против классической чумы свиней однократно внутримышечно в эффективной дозе.

Штамм Pestivirus "ГМ-94" ВГНКИ ДЕП, используемый для изготовления лапинизированной вирус-вакцины против классической чумы свиней.