ФОТООТВЕРЖЕННЫЙ ГЕЛЬ НА ОСНОВЕ СШИТОЙ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2003 года по МПК C08B37/08 A61L15/50 A61L27/20 A61K47/36 A61K47/48 

Область техники
Изобретение относится к биосовместимому фотоотвержденному гелю на основе сшитой гиалуроновой кислоты, который имеет специфические физические свойства, способам его получения и применениям его в качестве биомедицинских материалов.

Предпосылки к созданию изобретения
Гиалуроновая кислота присутствует в животных тканях и имеет биосовместимость и способность к биологическому разложению. Что касается физических свойств, то она имеет такие превосходные свойства, как высокая водопоглотительная способность, а ее водный раствор имеет высокую вязкость.

Гидрогель получают путем химического модифицирования гиалуроновой кислоты, сшивания модифицированной гиалуроновой кислоты некоторыми способами с образованием сетчатой структуры и включением водной среды, такой как вода, в сетчатую структуру. Гидрогель обнаруживает вязкоупругость, а также вязкость.

Сшитая гиалуроновая кислота, по-видимому, образует макромолекулы независимо от типа связывания. Способность к биоразложению сшитой гиалуроновой кислоты можно регулировать путем подбора степени сшивания.

Существуют различные типы сшивания. Например, как осуществление типа сшивания с использованием гидрофобного связывания или ионного связывания, известны сшивание гиалуроновой кислоты путем введения в нее нуклеофильного реагента (JP-W-3-502704 (соответствующая патенту США 4937270), термин "JP-W", как используется здесь, обозначает "не прошедшая экспертизу опубликованная международная патентная заявка"), сшивание посредством гидрофобного связывания путем этерификации гиалуроновой кислоты (патент США 4851521) и сшивание посредством ионного связывания поливалентными ионами (ЕР 0507604 А2). Так как они связываются слабой силой связывания по сравнению с силой ковалентного связывания, они подвержены влияниям внешних изменений, таких как рН, ионная сила, температура и тому подобное. В дополнение, когда они используются как биомедицинские материалы, способность оставаться в живом организме коротка, и трудно регулировать должным образом способность оставаться в организме так, чтобы обеспечить физиологические воздействия гиалуроновой кислоты на организм.

Коме того, как тип сшивания путем связывания молекул гиалуроновой кислоты ковалентным связыванием известны сшивание посредством дивинилсульфона (JP-В-4-30691 (соответствующая патенту США 4582865), термин "JP - В", как используется здесь, обозначает "прошедшая экспертизу патентная публикации Японии") и сшивание посредством эпоксида (JP-W-61-502729 (соответствующая патенту США 4886787), JP-А-5-140201, термин "JP - А", как используется здесь, обозначает "не прошедшая экспертизу опубликованная патентная заявка Японии"). Однако сшивающие агенты или сшивающие соединения, использованные в этих сшивках, являются токсичными. Кроме того, трехмерная сетчатая структура создается путем сшивания в то же самое время, когда дивинилсульфон, эпоксид или тому подобное вводятся в гиалуроновую кислоту и образованный структурированный гель на основе гиалуроновой кислоты переводится в нерастворимое состояние в растворителе, таком как вода и тому подобное. Непрореагировавшие низкомолекулярные соединения, включенные таким образом в сетчатую структуру, трудно отделять и удалять.

С другой стороны, сшивание гиалуроновой кислоты путем сшивающей реакции фотоотверждения при облучении ультрафиолетовыми лучами (JP-А-6-73102 (соответствующая патенту США 5462976), ASAIO Journal, 38, М154-М157 (1992)) также известно. Этот тип сшивания имеет преимущества в том, что фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты, в которое вводится фотореакционноспособная сшивающая группа, является растворимым в воде до фотоотверждаемой сшивки, и трехмерная сетчатая структура не образуется в это время, так что непрореагировавшие низкомолекулярные соединения легко могут быть удалены; фотореакция сама по себе является такой чистой реакцией, что дает фотоотвержденное производное сшитой гиалуроновой кислоты без непрореагировавших низкомолекулярных соединений, и получающаяся в результате сшитая структура образуется путем ковалентного связывания, так что контроль способности оставаться (в организме) фотоотвержденного производного сшитой гиалуроновой кислоты может быть легко осуществлен путем регулирования степени сшивания.

Кроме того, когда описанное выше фотоотвержденное производное сшитой гиалуроновой кислоты предназначено для применения в качестве биомедицинских материалов, например антиадгезивных материалов, то они в пленкообразной форме исследованы (ASAIO Journal, 38, М154-М157 (1992), но их трудно использовать для предотвращения спаек в тонких частях тканей или органов. Поэтому существует потребность в пригодном для инъекции геле фотоотвержденной сшитой гиалуроновой кислоты, который может быть инъецирован в такое тонкое место.

Однако гидрогель фотоотвержденной сшитой гиалуроновой кислоты и способы его получения, как раскрытые в данном изобретении, неизвестны.

Обычный гидрогель сшитой гиалуроновой кислоты имеет трудность в удалении примеси, такой как непрореагировавшие низкомолекулярные соединения и тому подобное, и регулировании физических свойств гидрогеля. Кроме того, затруднительно создать условия для получения гидрогеля, имеющего желательные физические свойства.

Описание изобретения
Первая цель данного изобретения - обеспечить фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, содержащий водную среду, который получают облучением ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в которое вводят фотореакционноспособную сшивающую группу, и димеризацией смежных фотореакционноспособных сшивающих групп с образованием циклобутанового кольца и с образованием таким образом сетчатой структуры, и способы легкого получения вышеописанного геля.

Вторая цель данного изобретения - обеспечить пригодный для инъекции биомедицинский материал, содержащий фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, который является превосходным по безопасности, биосовместимости и способности к биоразложению.

В результате интенсивных исследований авторы данного изобретения преуспели в достижении вышеуказанных целей путем следующего построения.

1) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты,
который имеет модуль накопления (динамический модуль упругости) (G') от 50 до 1500 Па, модуль потерь (G") от 10 до 300 Па и тангенс дельта (G''/G') от 0,1 до 0,8 в динамической вязкоупругости, измеренной реометром при следующих условиях,
способ измерения:
осцилляционный метод испытания, контроль нагрузки
температура измерения 37^oС
геометрия измерения 4 см
зазор 800 мкм
частота 10 Гц,
и который является гидрогелем, полученным путем облучения ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособную сшивающую группу химически связывают с функциональной группой гиалуроновой кислоты, и сшивания смежных фотореакционноспособных сшивающих групп.

2) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты,
который имеет плотность полимерной сетки (частоту поперечных связей или узлов сетки) от 0,01 до 0,5% на 1 моль составляющего дисахаридного звена гиалуроновой кислоты и
который является гидрогелем, полученным путем облучения ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособную сшивающую группу химически связывают с функциональной группой гиалуроновой кислоты, и путем сшивания смежных фотореакционноспособных сшивающих групп.

3) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты,
который имеет абсорбцию воды от 2000 до 15000%, как определено следующим:
абсорбция воды (%) = масса абсорбированной воды/масса высушенного геля • 100,
и который является гидрогелем, полученным путем облучения ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособную сшивающую группу химически связывают с функциональной группой гиалуроновой кислоты, и путем сшивания смежных фотореакционноспособных сшивающих групп.

4) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты согласно любому из указанных выше с 1) по 3), где указанная фотореакционноспособная сшивающая группа является производным коричной кислоты, содержащим спейсер (разделительную группу), и химически связана с функциональной группой гиалуроновой кислоты, чтобы обеспечить указанное фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты;
указанные смежные фотореакционноспособные сшивающие группы указанного фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты димеризуют путем облучения ультрафиолетовыми лучами с образованием циклобутанового кольца и с образованием таким образом сетчатой структуры, и
указанный гель является гидрогелем, содержащим водную среду в указанной сетчатой структуре.

5) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты согласно указанному выше 4), где указанный спейсер является группой, полученной из аминоспирта, аминокислоты или пептида.

6) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты согласно указанному выше 4) или 5), где указанная фотореакционноспособная сшивающая группа представлена следующей формулой (1) или (2):
-NH(CR¹R²)_nOCOCH=CH-Ph (1)
где R¹ и R² каждый независимо представляют атом водорода или алкилгруппу, имеющую от 1 до 8 атомов углерода; Ph представляет фенилгруппу и n представляет целое число от 2 до 18;
-A-NH-Ph-CH=CHCOOR³ (2)
где R³ представляет алкилгруппу, имеющую от 1 до 8 атомов углерода или аралкилгруппу; А представляет -(NНСR⁴R⁵CO)_m- или -NH(CR⁴R⁵)_hCO-; R⁴ и R⁵ каждый независимо представляет атом водорода или алкилгруппу, имеющую от 1 до 8 атомов углерода; -Ph- обозначает группу пара-фенилена; m обозначает целое число от 1 до 6 и h обозначает целое число от 1 до 18.

7) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты согласно любому из указанных выше с 1) по 6), где указанную фотореакционноспособную сшивающую группу вводят в пропорции от 0,05 до 10% на 1 моль составляющего дисахаридного звена.

8) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, который имеет модуль накопления (G') от 50 до 1500 Па, модуль потерь (G") от 10 до 300 Па и тангенс дельта (G"/G') от 0,1 до 0,8 в динамической вязкоупругости, измеренной реометром при следующих условиях,
способ измерения:
осцилляционный метод испытания, контроль нагрузки
температура измерения 37^oС
геометрия измерения 4 см
зазор 800 мкм
частота 10 Гц,
и который является гидрогелем, полученным облучением ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособную сшивающую группу химически связывают с функциональной группой гиалуроновой кислоты, и сшиванием смежных фотореакционноспособных сшивающих групп и затем термообработкой сшитого продукта.

9) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты,
который имеет модуль накопления (G') от 50 до 1500 Па, модуль потерь (G") от 10 до 300 Па и тангенс дельта (G"/G') от 0,1 до 0,8 в динамической вязкоупругости, измеренной реометром при следующих условиях,
способ измерения:
осцилляционный метод испытания, контроль нагрузки
температура измерения 37^oС
геометрия измерения 4 см
зазор 800 мкм
частота 10 Гц,
и который является гидрогелем, полученным путем термообработки фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособную сшивающую группу химически связывают с функциональной группой гиалуроновой кислоты, и затем путем облучения ультрафиолетовыми лучами нагретого фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты и сшивания смежных фотореакционноспособных сшивающих групп.

10) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты,
который имеет модуль накопления (G') от 50 до 1500 Па, модуль потерь (G") от 10 до 300 Па и тангенс дельта (G"/G') от 0,1 до 0,8 в динамической вязкоупругости, измеренной реометром при следующих условиях,
способ измерения:
осцилляционный метод испытания, контроль нагрузки
температура измерения 37^oС
геометрия измерения 4 см
зазор 800 мкм
частота 10 Гц,
и который является гидрогелем, полученным путем термообработки фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособную сшивающую группу химически связывают с функциональной группой гиалуроновой кислоты, и затем путем облучения ультрафиолетовыми лучами нагретого фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты и сшивания смежных фотореакционноспособных сшивающих групп и затем путем термообработки сшитого продукта снова.

11) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты согласно любому из указанных выше с 1) по 10), где содержание эндотоксина в геле составляет 0,25 единицы эндотоксина (ед.Э)/г или менее.

12) Способ получения фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты, содержащий
облучение ультрафиолетовыми лучами раствора водной среды, содержащей от 0,5 до 10% по массе фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособную сшивающую группу химически связывают с функциональной группой гиалуроновой кислоты, и
формирование межмолекулярной и внутримолекулярной сшивки путем димеризации смежных фотореакционноспособных сшивающих групп для обеспечения сетчатой структуры.

13) Способ получения фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты согласно вышеуказанному 12), где термообработку проводят до и/или после облучения ультрафиолетовыми лучами указанного раствора водной среды фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты.

14) Способ получения фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты согласно вышеуказанному 13), где указанную термообработку проводят при температуре от 100 до 125^oС в течение от 5 до 30 минут паром высокого давления.

15) Биомедицинский материал, содержащий фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты согласно любому из вышеуказанных с 1) по 11).

16) Биомедицинский материал согласно вышеуказанному 15), который имеет антиадгезионный эффект.

17) Комплект биомедицинского материала, содержащий гель сшитой гиалуроновой кислоты и контейнер, заключающий в себе указанный гель в таком состоянии, что он может быть извлечен наружу.

18) Комплект биомедицинского материала согласно вышеуказанному 17), где указанный контейнер является контейнером, который может выдавливать указанный гель для инъекции.

19) Комплект биомедицинского материала, содержащий фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, как описано в любом из 1) до 11), и контейнер, заключающий в себе указанный гель в таком состоянии, что он может быть извлечен наружу.

20) Комплект биомедицинского материала согласно вышеуказанному 19), где указанный контейнер является контейнером, который может выдавливать указанный гель для инъекции.

Краткое описание чертежей
Фиг. 1 является графическим изображением общего представления о фотоотвержденной сшивке в растворе фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты.

Фиг. 2 является графическим изображением взаимосвязи между DS (степенью замещения) и степенью абсорбции воды фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты.

Наилучший способ осуществления на практике изобретения
Данное изобретение будет объяснено подробно ниже.

Термин "производное фотоотвержденной сшитой гиалуроновой кислоты", как используется в данном изобретении, предназначается для того, чтобы охватить производное, как общее понятие, полученное облучением ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособная сшивающая группа является химически связанной, и димеризацией смежных фотореакционноспособных сшивающих групп для сшивки производного гиалуроновой кислоты и образования таким образом сетчатой структуры. Термин "фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты", как используется в данном изобретении, обозначает гидрогели, как общее понятие, содержащие водную среду, такую как вода, буфер, физиологический солевой раствор, забуференный физиологический раствор, водный раствор, содержащий растворимый в воде органический растворитель и тому подобное, в качестве дисперсионной среды в сетчатой структуре (трехмерной сетчатой структуре) фотоотвержденной сшитой гиалуроновой кислоты (здесь и далее иногда просто называемый как "гель данного изобретения"). Термин "функциональная группа гиалуроновой кислоты", как используется в данном изобретении, предназначается для включения функциональных групп, которые присутствуют в гиалуроновой кислоте и способны к химическому связыванию с фотореакционноспособными сшивающими группами. Типичными примерами функциональных групп являются карбоксильная группа и гидроксильная группа. Термин "низший алкил" или "низший алкоксил", как используется в данном изобретении, предназначается для того, чтобы включать алкилгруппу или алкоксилгруппу, которая имеет от 1 до 8 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода.

Что касается геля данного изобретения, во-первых, его физические свойства точно определяют с точки зрения вязкоупругости и, во-вторых, сшивающуюся структуру его устанавливают с точки зрения степени сшивания.

Фотореакционноспособная сшивающая группа в фотореакционноспособном производном гиалуроновой кислоты данного изобретения не является какой-то конкретной группой, пока указанная группа имеет виниленовую группу, которая способна димеризоваться под воздействием ультрафиолетового излучения с образованием циклобутанового кольца, и указанная группа является производной из коричной кислоты или ее замещенных производных (например, производные коричной кислоты и тому подобное, где один или два атома водорода в любых положениях бензольного кольца коричной кислоты замещены группой низшим алкилом (например, метилом, этилом, пропилом, изопропилом, бутилом, трет-бутилом и тому подобным), низшей алкоксильной группой (например, метокси, этокси, пропокси, изопропокси, бутокси и тому подобное), аминогруппой, гидроксильной группой и тому подобное), карбокси-низший алкил-тимина (например, 1-(2-карбоксиэтил)тимин и тому подобное), карбокси-низший алкил-замещенного кумарина (например, 7-кумарилоксиуксусная кислота и тому подобное) и тому подобного. Из них особенно предпочтительной является фотореакционноспособная сшивающая группа, в которую введена группа, полученная от коричной кислоты или ее производного. Кроме того, в качестве фотореакционноспособной сшивающей группы также предпочтительна группа, происходящая из соединения, в котором спейсер связан с фотореакционноспособным соединением, таким как коричная кислота и тому подобное. Предпочтительные спейсеры включают такие, которые имеют две или несколько функциональных групп, способных к связыванию как с функциональной группой фотореакционноспособного соединения, такого как коричная кислота и тому подобное, так и с функциональной группой гиалуроновой кислоты. Конкретно, предпочтительны аминокислоты или их производные, пептиды и аминоспирты и тому подобное, в частности наиболее предпочтительными являются аминоспирты. Фотореакционноспособная сшивающая группа может быть введена в какую-либо функциональную группу составляющих сахаридных частей гиалуроновой кислоты, например N-ацетил-D-глюкозамин и D-глюкуроновую кислоту, но особенно предпочтительно вводить указанную сшивающую группу в карбоксильную группу D-глюкуроновой кислоты.

При использовании коричной кислоты в качестве фотореакционноспособной сшивающей группы и аминоспирта в качестве спейсера, например, предпочтительным является фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты с такой структурой, когда карбоксильная группа коричной кислоты является химически связанной с гидроксильной группой аминоспирта посредством сложноэфирной связи, а аминогруппа аминоспирта является химически связанной с карбоксильной группой гиалуроновой кислоты посредством амидной связи. При использовании аминокоричной кислоты в качестве фотореакционноспособной сшивающей группы и аминокислоты или пептида в качестве спейсера предпочтительна фотореакционноспособная гиалуроновая кислота с такой структурой, где карбоксильная группа спейсера химически связана с аминогруппой аминокоричной кислоты посредством амидной связи, и аминогруппа указанной аминокислоты или пептида химически связана с карбоксильной группой гиалуроновой кислоты посредством амидной связи.

Конкретно, из фотореакционноспособных сшивающих групп, с которыми связан спейсер, особенно предпочтительны такие, которые представлены показанной ниже следующей формулой (1) или (2).

-NH(CR¹R²)_nOCOCH=CH-Ph (1)
В формуле (1) R¹ и R² каждый независимо представляют атом водорода или низшую алкилгруппу (предпочтительно имеющую от 1 до 4 атомов углерода); Ph представляет фенилгруппу, которая может быть не только группой, выраженной как -С₆Н₅-, но также группой, включающей замещенное бензольное кольцо, один или два атома которого в любых положениях замещены одним или двумя заместителями, выбранными из групп низший алкил или алкоксил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода, аминогруппы, гидроксильной группы и тому подобного; n представляет целое число от 2 до 18, предпочтительно от 2 до 12.

Фотореакционноспособная сшивающая группа, представленная формулой (1), химически связана, например, с карбоксильной группой гиалуроновой кислоты посредством амидной связи с образованием фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты.

-A-NH-Ph-CH=CHCOOR³ (2)
В формуле (2) R³ представляет низшую алкилгруппу, предпочтительно алкилгруппу, имеющую от 1 до 4 атомов углерода (например, метил, этил или тому подобное) или аралкилгруппу, имеющую от 7 до 20 атомов углерода, предпочтительно бензил или фенетил; А представляет -(NHCR⁴R⁵CO)_m- или -NH(CR⁴R⁵)_hCO-; R⁴ и R⁵ каждый независимо представляет атом водорода или низшую алкилгруппу (предпочтительно имеющую от 1 до 4 атомов углерода); -Ph- обозначает группу пара-фенилена, которая может быть не только группой, выраженной как -С₆Н₄-, но также группой, включающей замещенное бензольное кольцо, где атом водорода в орто- или мета-положении в бензольном кольце замещен низшей алкильной или алкоксильной группой, имеющей от 1 до 4 атомов углерода, аминогруппой, гидроксильной группой или тому подобной; m обозначает целое число от 1 до 6, предпочтительно от 1 до 3; h обозначает целое число от 1 до 18, предпочтительно от 1 до 12.

Гиалуроновая кислота для использования в данном изобретении не имеет конкретных ограничений, однако в качестве исходного материала обычно используют гиалуроновую кислоту, имеющую средневесовую молекулярную массу от 10000 до 5000000. В соответствии с целью применения могут быть выбраны различные молекулярные массы. Предпочтительны средневесовые молекулярные массы от 500000 до 3000000 и более предпочтительны от 800000 до 2500000. В следующем методе синтеза используют предпочтительно растворимую в воде соль гиалуроновой кислоты, такую как соль щелочного металла (например, соль натрия, соль калия или тому подобное), соль щелочноземельного металла (например, соль кальция или тому подобное) или тому подобное, но и другие соли или свободная кислота также могут быть использованы, пока они растворимы в используемом реакционном растворителе и не влияют на реакцию. Термин "гиалуроновая кислота", как используется здесь иногда ниже, включает ее соли.

Фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты для использования в данном изобретении может быть получено растворением гиалуроновой кислоты, например, в одной воде или в водном растворе, содержащем смешивающийся с водой органический растворитель (например, диоксан, диметилформамид, N-метилпирролидон, ацетамид, спирт (например, метанол, этанол), пиридин и тому подобное) и введением фотореакционноспособной сшивающей группы, например, карбодиимидным методом в присутствии растворимого в воде карбодиимида (например, гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (сокращенно называемого здесь далее как "EDC•HCl"), метиодида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, гидрохлорида 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимида) и способствующего конденсации агента (например, N-гидроксисукцинимида, N-гидроксибензотриазола и тому подобного).

Очистка продукта, полученного после реакции, может быть осуществлена обычным способом, например осаждением этанолом или путем диализа. После очистки и сушки степень замещения (сокращенно называемая здесь далее как "DS", которая является степенью введения фотореакционноспособных сшивающих групп на составляющее дисахаридное звено гиалуроновой кислоты) образующегося фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты может быть измерена с помощью спектрофотометра по поглощению продукта при около 269 нм.

Стерильные и, по существу, без эндотоксина (например, содержание эндотоксина 0,25 ед.Э/г или менее) фотореакционноспособные производные гиалуроновой кислоты и фотоотвержденные гели сшитой гиалуроновой кислоты могут быть получены за счет использования стерильных или, по существу, не содержащих эндотоксина реагентов, воды, контейнеров и тому подобного и повышенного внимания к стерилизации рабочей среды при получении.

Конкретные соединения, использованные для введения фотореакционноспособной сшивающей группы в гиалуроновую кислоту, включают те, что представлены следующей формулой (1-1) или (2-1):
-N₂H(CR¹R²)_nOCOCH=CH-Ph (1-1)
где R¹, R², Ph и n - те же, как определено выше;
H-A-NH-Ph-CH=CHCOOR³ (2-1)
где A, -Ph- и R³ - те же, как определено выше.

Соединения (1-1) и (2-1) предпочтительно используют в форме соли, например соли с присоединенной кислотой, такой как гидрохлорид, гидробромид и тому подобное, гидрохлорид является особенно предпочтительным.

Конкретно, гидрохлорид (1-2) соединения (1-1) может быть синтезирован согласно следующей схеме реакции.

Первая реакция
R⁶HN(CR¹R²)_nOH (3)+XCOCH=CH-Ph (4) --> R⁶HN(CR¹R²)_nOCOСH=CH-Ph (5)
Вторая реакция
(5) + HCl --> HCl•H₂N(CR¹R²)_nOCOСH=CH-Ph (1-2)
где R⁶ представляет аминозащитную группу, которая может быть отщеплена кислотой, например трет-бутоксикарбонильную группу и тому подобное; Х представляет атом галогена, например атом хлора и тому подобное.

Здесь конкретно соединение (1-2) синтезируют следующим образом.

Органический растворитель (например, хлороформ и тому подобное) добавляют к соединению (3) и органическое основание (например, триэтиламин и тому подобное) добавляют туда же при охлаждении льдом. Последовательно добавляют соединение (4) и катализатор основного характера (например, 4-диметиламинопиридин и тому подобное). После перемешивания смеси при комнатной температуре органический растворитель (например, этилацетат и тому подобное) добавляют к реакционной смеси и смесь промывают последовательно несколькими порциями слабокислого водного раствора, водой, несколькими порциями слабощелочного водного раствора, водой, насыщенным водным раствором хлорида натрия и тому подобное. Отделенный слой органического растворителя сушат над безводным сульфатом натрия или тому подобного. Дессикант (осушитель) и тому подобное удаляют фильтрованием и фильтрат сушат при пониженном давлении, чтобы получить соединение (5).

1-5 М раствор хлористого водорода в органическом растворителе (например, диоксан и тому подобное) добавляют к соединению (5) при охлаждении льдом с последующим перемешиванием. Туда же добавляют органический растворитель (например, простой диэтиловый эфир и тому подобное) и осажденные кристаллы собирают путем фильтрования. Кристаллы промывают органическим растворителем и сушат при пониженном давлении, чтобы получить соединение (1-2).

Конкретно, гидрохлорид (2-2) соединения (2-1) может быть синтезирован согласно следующей схеме реакции.

Первая реакция
R⁶-A-OH (6) H₂N-Ph-CH=CHCOOR³ (7) --> R⁶-A-NH-Ph-CH=CHCOOR³ (8)
Вторая реакция
(8) + HCl --> HCl•H-A-HN-Ph-CH=CHCOOR³ (2-2)
где R³ и R⁶ - как определено выше.

Кроме того, соединение (2-2) конкретно синтезируют следующим образом.

Органический растворитель (например, хлороформ или тому подобное) добавляют к соединению (6), туда же добавляют активатор (например, диметилфосфинотиоилхлорид и тому подобное) в присутствии органического основания (например, триэтиламин и тому подобное) при охлаждении льдом, активируя тем самым карбоксильную группу соединения (6). После активации соединения (6) добавляют соединение (7) в присутствии органического основания (например, триэтиламин и тому подобное) при охлаждении льдом с последующим перемешиванием при комнатной температуре. Органический растворитель (например, этилацетат и тому подобное) добавляют к реакционной смеси и смесь промывают последовательно несколькими порциями слабокислого водного раствора, водой, несколькими порциями слабощелочного водного раствора, водой, насыщенным водным раствором хлорида натрия и тому подобное. Слой органического растворителя отделяют и сушат над безводным сульфатом натрия или тому подобного. Дессикант и тому подобное удаляют фильтрованием и фильтрат сушат при пониженном давлении, чтобы получить соединение (8).

1-5 М раствор хлористого водорода в органическом растворителе (например, диоксан и тому подобное) добавляют к соединению (8) при охлаждении льдом с последующим перемешиванием. Туда же добавляют органический растворитель (например, простой диэтиловый эфир и тому подобное) и осажденные кристаллы собирают путем фильтрования, промывают органическим растворителем и сушат при пониженном давлении, чтобы получить соединение (2-2).

Присутствие спейсера, включенного в фотореакционноспособную сшивающую группу в значительной мере способствует фотореакционноспособности фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, а то же время это усовершенствование зависит от степени свободы спейсера и его способностей к гидрофобному связыванию. Усовершенствованная чувствительность в фотореакционноспособности, привнесенная спейсером, делает возможным достигнуть фотоотвержденной сшивки при такой малой степени введения фотореакционноспособной сшивающей группы, при которой фотоотвержденная сшивка прежде была затруднена при таких условиях.

Согласно обычной технологии, когда описанное выше фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты сшивают облучением светом, водный раствор фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты вначале высушивают поверх контейнера или тому подобного в пленку или тому подобное и затем облучают ультрафиолетовыми лучами, чтобы получить фотоотвержденную пленку сшитой гиалуроновой кислоты. Это делают не только из-за того, что пленка легко пропускает ультрафиолетовые лучи, но также и потому, что фотореакционноспособные сшивающие группы ориентируются до более тесного прилегания друг к другу благодаря их гидрофобному характеру, в то время как пленка дегидратируется или вода испаряется во время пленкообразования. Считается, что созданная таким образом ситуация служит на благо фотореакции. Например, в случае, когда фотореакционноспособная сшивающая группа является остатком коричной кислоты, когда расстояние между смежными остатками коричной кислоты составляет 4 ангстрема, молекулы могут быть димеризованы, например сшиты, путем облучения ультрафиолетовыми лучами конкретной длины волны, но не при другом межмолекулярном расстоянии. Поэтому пленкообразование, которое делает фотореакционноспособные сшивающие группы более тесно расположенными друг к другу, считается важным шагом для достижения фотореакции. Более того, транс-коричная кислота может быть димеризована облучением ультрафиолетовыми лучами при вышеописанных условиях, в то время как ее геометрический изомер (т.е. цис-коричная кислота) является неактивной для димеризации. Когда водный раствор обычного фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты облучают ультрафиолетовыми лучами, предполагается, что сшивание может быть затруднено, потому что молекулы воды, по-видимому, препятствуют более тесному прилеганию фотореакционноспособных сшивающих групп, и преимущественно перед димеризацией имеет место транс- в цис- изомеризация.

Авторы данного изобретения обнаружили, что фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты может быть сформирован путем приготовления водного раствора фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты высокой концентрации, чтобы сделать более тесно расположенные смежные фотореакционноспособные сшивающие группы более частыми, путем придания слою раствора формы, позволяющей ультрафиолетовым лучам проходить через этот слой с легкостью, и последующим облучением его ультрафиолетовыми лучами.

Согласно данному изобретению, когда фотореакционноспособную гиалуроновую кислоту облучают ультрафиолетовыми лучами, фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, имеющий желательные физические свойства, такие как вязкоупругость и тому подобное, может быть получен путем соответствующего выбора условий фотореакции, таких как концентрация раствора фотореакции, время облучения ультрафиолетовыми лучами и тому подобное, или DS.

Предпочтительная концентрация раствора фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты в водной среде, которая должна быть облучена светом (на которую здесь и далее иногда ссылаются как на "концентрацию фотореакции") составляет от 0,5 до 10% по массе. При использовании фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, имеющего молекулярную массу около 1000000, более предпочтительна концентрация от 1 до 4% по массе. При более низких концентрациях изомеризация превалирует над димеризацией, как упомянуто здесь выше. Напротив, при более высоких концентрациях трудно получить однородный гель.

Когда более разбавленный водный раствор по концентрации, чем указанная определенная концентрация, облучают ультрафиолетовыми лучами, имеется тенденция к преимущественному образованию изомеров, как описано выше. При продолжающемся облучении ультрафиолетовыми лучами сама сахаридная цепь гиалуроновой кислоты будет расщепляться под влиянием ультрафиолетовых лучей, результатом чего является уменьшение молекулярной массы. С этих точек зрения, важно создать ситуацию реакции, в которой реакция фотоотвержденного сшивания происходит эффективно без вредных влияний на сахаридную цепь гиалуроновой кислоты. Поэтому важно готовить водный раствор с концентрациями, определенными выше. Фиг. 1 графически дает общее представление о фотоотвержденном сшивании в водной среде, где (а) показывает изменение фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты в разбавленном растворе при облучении ультрафиолетовыми лучами. Молекулы воды препятствуют смежным фотореакционноспособным сшивающим группам выстроиться в молекулярном порядке, готовом для сшивания, и в результате преобладает измеризация. В (b) показано изменение фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты в растворе при точно определенной концентрации при облучении ультрафиолетовыми лучами. Гидрофобные фотореакционноспособные сшивающие группы, будучи менее подвержены вмешательству молекул воды, чем в разбавленном растворе, очевидно, притягивают друг друга за счет силы гидрофобного связывания, принимая молекулярный порядок, готовый для сшивания. Поэтому фотореакционноспособные сшивающие группы димеризуются под облучением, что сопровождается включением водной среды, завершая таким образом сшивание. Чтобы закрепить усовершенствованную фотореакционноспособность при сшивании в растворе при точно определенной концентрации, особенно предпочтительно использовать фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты, включающее фотореакционноспособную сшивающую группу, содержащую вышеописанный спейсер, и имеющее высокую гибкость.

Упомянутая выше концентрация фотореакции зависит от степени замещения (DS) фотореакционноспособной сшивающей группы, включенной в гиалуроновую кислоту. DS может быть рассчитана на основе степени (%) введения фотореакционноспособной сшивающей группы на составляющее дисахаридное звено гиалуроновой кислоты. Например, DS фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, имеющего одну фотореакционноспособную сшивающую группу на составляющее дисахаридное звено или на 200 составляющих сахаридных звеньев, равна 100% или 1% соответственно. При тех же условиях облучения светом чем ниже DS, тем ниже степень сшивания.

В данном изобретении DS фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты для достижения сшивания при точно определенной концентрации фотореакции, упомянутой выше, может быть около от 0,05 до 10%, предпочтительно около от 0,3 до 5% и более предпочтительно около от 0,5 до 3%, в случае гиалуроновой кислоты, имеющей молекулярную массу 500000 или более, изменяясь в зависимости от молекулярной массы исходной гиалуроновой кислоты.

Водная среда, как растворитель раствора фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, которое должно быть облучено светом, включает воду, буфер, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор и тому подобное. Для использования в биомедицинском материале особенно предпочтительны буфер, физиологический раствор и забуференный физиологический раствор (например, забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) и тому подобное). Когда используют водную среду, иную, чем вода, вид среды и концентрация растворенного вещества могут быть использованы для точного регулирования физических свойств получающегося геля данного изобретения и их соответственно выбирают в зависимости от цели применения.

Раствор фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты обычно готовят путем растворения в водной среде фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, только что выделенного и очищенного из реакционной системы синтеза. В качестве раствора фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты возможно в некоторых случаях использовать фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты в реакционной системе его синтеза как таковой или в ее концентрированном состоянии.

Когда DS фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты фиксируется, относительная доля образования циклобутанового кольца, т.е. степень сшивания, подвергается изменению с изменением в пределах концентрации фотореакции, упомянутой выше, и соответственно изменяются физические свойства получающегося геля. С увеличением концентрации фотореакции степень сшивания, по-видимому, увеличивается, и упругий характер геля усиливается, что подтверждается измерением вязкоупругости фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты. С увеличением степени сшивания сетчатая структура становится плотнее. Относительная доля циклобутанового кольца в фотоотвержденном геле сшитой гиалуроновой кислоты может быть определена как плотность полимерной сетки, которая является произведением DS и степени сшивания и выражена в виде молярного отношения (%) димеров на составляющее дисахаридное звено гиалуроновой кислоты. Предпочтительная плотность полимерной сетки находится в пределах от 0,01 до 0,5% на 1 моль составляющего дисахаридного звена гиалуроновой кислоты.

Абсорбция воды сухим фотоотвержденным гелем сшитой гиалуроновой кислоты (упоминаемый здесь далее просто как "сухой гель") зависит от степени сшивания и поэтому становится мерой степени сшивания. Абсорбцию воды выражают следующей формулой:
Абсорбция воды (%) = масса абсорбированной воды/масса сухого геля • 100
С увеличением степени сшивания, т.е. относительного сшивания, сетчатая структура становится плотнее, и поглощение воды снижается, результатом чего является уменьшенная абсорбция воды сухим гелем. Абсорбция воды сухим гелем данного изобретения обычно составляет около от 20 (•100%) до 150 (•100%), предпочтительно от 30 (•100%) до 120 (•100%), более предпочтительно от 40 (•100%) до 100 (•100%), когда ее измеряют после погружения сухого геля на 24 часа в физиологический раствор (0,9%-ный водный раствор хлорида натрия) в качестве водной среды.

Гель данного изобретения может быть гелем, содержащим от 0,5 до 10% по массе, в расчете на содержание гиалуроновой кислоты, фотоотвержденного производного гиалуроновой кислоты. В частности, фотоотвержденный гель гиалуроновой кислоты, полученный из фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, имеющего молекулярную массу около 1000000, предпочтительно имеет содержание гиалуроновой кислоты от 1 до 4% по массе в геле.

Физические свойства геля за счет вязкоупругости могут быть выражены характеристиками динамической вязкоупругости, такими как модуль накопления (G'), модуль потерь (G") и тангенс дельта (tgδ; G"/G') и тому подобное. Высокий модуль накопления и низкий модуль потерь указывают на высокую упругость, обозначая твердый гель. И, наоборот, высокий модуль потерь и низкий модуль накопления обозначают гель с высокой вязкостью.

Гель данного изобретения обнаруживает физические свойства с пределами модуля накопления (G') от 50 до 1500 Па, предпочтительно от 100 до 500 Па, модуля потерь (G") от 10 до 300 Па, предпочтительно от 50 до 150 Па, и тангенса дельта (tgδ; G"/G') от 0,1 до 0,8, предпочтительно от 0,2 до 0,5, в динамической вязкоупругости при частоте 10 Гц.

При облучении светом, например ультрафиолетовыми лучами, вид ультрафиолетовых лучей особенным образом не лимитируется. Облучение светом или ультрафиолетовыми лучами обычно проводят от нескольких секунд до нескольких минут с использованием источника света, дающего свет, содержащий длины волн, необходимые для фотореакции, т.е. от 200 до 450 нм (например, ртутной лампы высокого давления, металлгалогенидной лампы или тому подобного), в то время как короткие длины волн, нежелательные для димеризации, отсекают фильтром ультрафиолетовых лучей или тому подобным (например, стекло пирекс, Pyrex glass (торговое наименование) или тому подобное). Способ облучения особенно не лимитируется и выбирают различные способы, подходящие для этой цели. Например, раствор фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты загружают в контейнер для поставки в качестве конечного коммерческого продукта геля данного изобретения и облучают, как описано здесь далее; указанный раствор удерживают между парой ленточных конвейеров, изготовленных из листов пропускающего ультрафиолетовые лучи материала и облучают во время движения, или раствор фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты подают внутрь трубы, изготовленной из пропускающего ультрафиолетовые лучи материала и облучают ультрафиолетовыми лучами во время его прохождения через нее.

В процессе получения геля данного изобретения гель, который удовлетворяет описанным выше требованиям вязкоупругости, может быть получен даже, когда раствор фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты подвергают термообработке паром высокого давления при температуре от 100 до 125^oС в течение от 5 до 30 минут (обработка в автоклаве)
до и/или после облучения ультрафиолетовыми лучами. Такие термообработки могут соответствовать процессу стерилизации, необходимому для медицинских устройств и лекарственных средств.

Состояния раствора фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, который должен быть облучен ультрафиолетовыми лучами, и материала и формы контейнера для приема его для фотореакции и воспринимающей ультрафиолетовые лучи части особенным образом не лимитируются при условии, что ультрафиолетовые лучи могут проходить сквозь них. Например, они могут быть подобны слою, подобны тюбику, подобны шприцу, подобны ампуле или тому подобному. Принимая во внимание однородность сшивающей реакции, форма должна быть такой, чтобы ультрафиолетовые лучи проходили равномерно и, по существу, насквозь. Облучение ультрафиолетовыми лучами слоя раствора, оформленного как тонкий слой, особенно подходит для получения равномерно сшитого геля. Контейнер для фотореакции может иметь такую форму, чтобы он мог удерживать раствор фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты и образующийся гель данного изобретения в системе фотореакции, и не всегда необходимо, чтобы он был закрытым контейнером. Например, контейнер может быть в форме простой пластины.

Когда гель данного изобретения используют в качестве биомедицинского материала, такого как антиадгезионный материал, контейнер для предохранения от порчи геля данного изобретения предпочтительно может иметь форму, с которой образующийся гель данного изобретения может сохраняться стерильно до его использования и из которой гель может быть извлечен подходящим образом при его использовании. Примеры такого контейнера, в котором гель может сохраняться стерильно до его использования и из которого гель легко может быть нанесен на назначенный объект или место (когда гель используют в качестве антиадгезионного материала, объект или место являются пораженной частью, которая должна быть защищена от спаек), включают контейнеры, такие как шприц, тюбик и тому подобное. Кроме того, примеры такого контейнера, из которого гель легко может быть извлечен и нанесен, включают контейнеры, такие как ампула и тому подобное.

Когда фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты загружают в контейнер и загруженное фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты облучают ультрафиолетовыми лучами, чтобы подвергнуть фотореакции, как упомянуто выше, материал контейнера должен быть выбран из таких материалов, которые пропускают ультрафиолетовые лучи и не подвергаются разрушению ультрафиолетовыми лучами. Далее, в случае когда гель данного изобретения предназначается для нанесения на тело человека в качестве биомедицинского материала, гель после фотореакции может быть предпочтительно стерилизован, например, паром высокого давления (обработка в автоклаве). Когда фотоотвержденный сшитый гель, загруженный в контейнер, стерилизуют путем стерилизации в автоклаве, материал контейнера может быть предпочтительно изготовлен из стекла, пластиков или тому подобного, имеющего термостойкость до некоторой степени. Количество геля, загружаемого в контейнер особым образом не лимитируется; однако, исходя из эксплуатационных и экономических соображений и тому подобного, оно составляет, например, около от 0,5 до 500 мл.

Возможно, чтобы гидрогель, полученный облучением светом, как описано выше, мог быть дегидратирован, например, путем сушки или тому подобного и затем переведен в набухшее состояние путем добавления желательного количества водной среды, чтобы обеспечить гель данного изобретения, имеющий вышеописанные физические свойства. В этом случае сушку предпочтительно проводят способом, который не оказывает вредного влияния на сахаридную цепь гиалуроновой кислоты и сшитую структуру.

Возможно также хранить или транспортировать фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты в форме такого сухого твердого геля, как упомянуто выше, и использовать его как повторно насыщенный подходящей водной средой до разбухания непосредственно перед использованием.

Гель данного изобретения используют в основном в качестве биомедицинского материала. Высокая присущая ей биосовместимость гиалуроновой кислоты в сочетании с вновь добавленными за счет сшивания свойствами, такими как пролонгированное действие в живом организме (усовершенствование в способности оставаться на месте), и усовершенствованными физико-химическими свойствами, такими как вязкоупругость и тому подобное, подходящими для использования в качестве биомедицинского материала, делают гель данного изобретения очень пригодным для использования в медицинской области.

Так как гель данного изобретения по большей части содержит безвредную и нетоксичную водную среду, он не обнаруживает токсичности для живых организмов и имеет высокую безопасность для живых организмов.

Более конкретно, введение одноразовой дозы 100 мл/кг (соответствует 2000 мг гиалуроновой кислоты на 1 кг) геля данного изобретения интраперитонеально крысам не вызывает ни смерти и ни серьезного расстройства, приписываемого гелю.

Кроме того, было проведено испытание антигенности для выявления активной анафилаксии, при котором морских свинок интраперитонеально сенсибилизировали 20 мг или 2 мг геля данного изобретения и затем снова вводили интраперитонеально 40 мг геля. В результате анафилактическая реакция не индуцировалась.

Когда гель данного изобретения используют в качестве биомедицинского материала, такого как антиадгезионный материал, подразумевается, что повышенная упругость геля приводит к усовершенствованию в барьерном эффекте между тканями и способности оставаться в организме, в то время как повышенная вязкость приводит к усовершенствованию в липкости к ткани и в пригодности для впрыскивания в пораженную часть. Поэтому желательно, чтобы гель для такого применения имел хорошо сбалансированные упругость и вязкость. Если G' превышает 1500 или тангенс дельта менее 0,1, гель становится высокоупругим гелем, так называемым жестким и ломким гелем, и становится трудно впрыскивать гель в пораженную часть. С другой стороны, если G' меньше чем 50 или тангенс дельта превышает 0,8, гель становится высоковязким гелем, напоминающим раствор, испытывая недостаток в обеспечения желательной жесткости, и барьерный эффект, необходимый для антиадгезивного действия утрачивается. То есть, гель данного изобретения рассматривается как имеющий наиболее подходящие физико-химические свойства как антиадгезионный материал.

Спайка органов, например, которая часто случается после операции, является нежелательной с клинической точки зрения, и с этих позиций желательна разработка эффективного антиадгезионного материала. Желательными характеристиками для антиадгезионного материала являются следующие: материал должен (1) создавать барьерный эффект между органами, которые могут пострадать от спайки, (2) иметь укрывающие свойства поверх раненой части, (3) не замедлять заживление раны, (4) оставаться в организме во время периода заживления и предпочтительно разлагаться и абсорбироваться внутри организма после заживления, (5) быть безвредным, нетоксичным, биосовместимым и тому подобное.

Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты данного изобретения, который получают фотоотвержденным сшиванием и который имеет превосходную биосовместимость и безопасность, удовлетворяет всем этим требованиям, описанным выше. Барьерный эффект, который является особенно важным, обеспечивается физико-химическими свойствами сшитого геля, а способность оставаться в организме достигается за счет формирования фотоотвержденной сшитой сетчатой структуры.

Аморфность геля, например, позволяет гелю быть инъецированным через инъекционный наконечник или иглу, то-есть когда его загружают в шприц и впрыскивают в небольшую пораженную часть (например, раненую часть и тому подобное). В связи с этим, гель данного изобретения характеризуется тем, что имеет значительно более высокую упругость, чем упругость раствора гиалуроновой кислоты, но его плотность такова, что он сохраняет достаточную мягкость, чтобы проходить через иглу шприца. Гель также может быть впрыснут на пораженную часть через трубку малого диаметра (инъекционный наконечник) и предполагается для применения в лапароскопической микрохирургии и тому подобное.

Вкратце, антиадгезионный материал, содержащий гель данного изобретения, как описано выше, характеризуется как следующий:
(1) имеющий превосходный антиадгезионный эффект;
(2) являющийся гидрогелем, имеющим физические свойства, позволяющие инъецировать его в пораженную часть;
(3) обнаруживающий высокую липкость к тканям и также высокую липкость к тканям, когда его впрыскивают или наносят, за счет чего он остается на пораженной части на период, необходимый для предотвращения спаек;
(4) не имеющий необходимости удаления, а также являющийся абсорбируемым из конкретного места нанесения, такого как брюшная полость и тому подобное, метаболизируемым и экскретируемым и
(5) имеющий безопасность: отсутствие проблем с безопасностью наблюдалось в таких испытаниях на животных, как испытание токсичности разовой дозы, испытание токсичности повторяющихся доз и испытание антигенности.

В качестве примеров приводятся следующие области применения, когда гель данного изобретения используют в качестве антиадгезионного материала.

(1) Область акушерства и гинекологии
Средства против спаек, сопровождающих внутритазовую операцию для лечения бесплодия, операцию на матке, операцию на трубах, операцию на яичниках, операцию по поводу эндометриоза, кесарево сечение, внутритазовое разделение спаек или тому подобное.

(2) Область желудочно-кишечных операций
Средства против спаек, сопровождающих кишечную адгезию после брюшной операции или тому подобное.

(3) Ортопедическая область
Средства против спаек, сопровождающих операцию на ахилловом (пяточном) сухожилии, операцию на мышцах-сгибателях и связках, артропластику, ламинэктомию или тому подобное.

Применения геля данного изобретения в медицинской области в качестве биомедицинского материала иного, чем антиадгезионный материал, описанный выше, показаны ниже.

(1) Вспомогательные вещества при офтальмологической операции. Например, гель инъецируют в переднюю камеру при операциях, таких как вставка внутриглазных линз, тотальная роговичная трансплантация или тому подобное, или гель используют для обеспечения внутриглазного давления при отслойке сетчатки и тому подобное или для пополнения стекловидного тела.

(2) Средства, улучшающие функцию суставов. Например, гель впрыскивают в суставную полость с целью смягчения боли, усовершенствования предела подвижности сустава, нормализации патологической синовиальной жидкости и тому подобное при лечении артрита, такого как деформирующий артрит коленного сустава, периартрит плечевого сустава или тому подобное.

(4) Протезы дефектов в области пластической хирургии.

(5) Повязки на пролежни или ожоги.

(6) Материалы или препараты для замедленного выделения лекарства.

Для использования в качестве антиадгезионного материала геля данного изобретения количество геля, которое должно быть нанесено на пораженную часть, не может быть точно определено, потому что оно варьируется в зависимости от типа (например, вида органа и тому подобное), размера или условий места нанесения и цели нанесения. Обычно это около от 0,5 до 500 мл/место, предпочтительно около от 1 до 100 мл/место, более предпочтительно около от 2 до 50 мл/место.

Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты данного изобретения имеет трехмерную сетчатую структуру. Включение лекарства в сетку будет обеспечивать полезный препарат для замедленного выделения лекарства. Введение лекарства в гель может быть осуществлено путем погружения сухого геля в раствор, содержащий лекарство. А также, так как фотоотвержденный сшитый гель не требует очистки после сшивания, лекарство может быть предварительно добавлено к раствору фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, которое должно быть облучено. Могут быть использваны любые методы, описанные выше.

Кроме того, лекарство может быть химически связано с фотореакционноспособным производным гиалуроновой кислоты посредством химического связывания (ковалентное связывание, ионное связывание и тому подобное) и затем может быть подвергнуто фотореакции для сшивания. Например, когда лекарство вводят ковалентным связыванием, лекарство и карбоксильная или гидроксильная группа фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты могут быть объединены посредством амидной или сложноэфирной связи и затем подвергнуты облучению ультрафиолетовыми лучами. А также, когда лекарство вводят ионным связыванием, катионное лекарство, способное к связыванию с карбоксильной группой гиалуроновой кислоты посредством ионного связывания, может быть смешано с фотореакционноспособной гиалуроновой кислотой и затем подвергнуто облучению ультрафиолетовыми лучами. Кроме того, фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты, содержащее фотореакционноспособную сшивающую группу, с которой связывается лекарство, может быть подвергнуто фотореакции для сшивания.

Данное изобретение теперь будет иллюстрировано более подробно со ссылкой на Примеры приготовления, Примеры и Примеры испытания, но должно быть понятно, что данное изобретение не следует считать ограниченным этим.

ПРИМЕР ПРИГОТОВЛЕНИЯ 1
Приготовление фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты (DS 0,53%).

В 1,5 л воды растворяют 10 г (25 ммоль дисахаридного звена) гиалуроната натрия (продукт Seikagaku Corporation; средневесовая молекулярная масса (Mw) 950000) и к раствору добавляют 750 мл 1,4-диоксана. К раствору последовательно добавляют 50 мл раствора диоксана, содержащего 288 мг (2,5 ммоль) N-гидроксисукцинимида, 50 мл водного раствора, содержащего 1240 мг (1,25 ммоль) EDС•HC1 и 50 мл водного раствора, содержащего 355 мг (1,25 ммоль) НС1•H₂N(СН₂)₆ОСОСН= СНРh при 5-минутных интервалах при охлаждении льдом. После перемешивания смеси при комнатной температуре в течение 8 часов к ней добавляют водный раствор 10 г хлорида натрия с последующим перемешиванием в течение 1 часа. Полученный раствор выливают в 5 л этанола. Полученный таким образом желательный осадок собирают путем центрифугирования (4000 об/мин • 15 мин), промывают последовательно 3 порциями 80%-ного этанола и одной порцией этанола и сушат, чтобы получить 9,73 г фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты в виде белого твердого вещества (DS 0,53%; эндотоксин 0,8 пг/мг).

Эндотоксин в этом Примере приготовления и в последующих Примерах приготовления определяют с использованием набора Toxicolor System LS-20, набора DIA и набора Et-1, все доступны от Seikagaku Corporation (товарный знак; здесь и далее то же самое).

Содержание эндотоксина в фотоотвержденном геле сшитой гиалуроновой кислоты определяют вышеописанным методом, затем фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, описанный в Примерах, солюбилизируют перевариванием ферментом (например, хондроитиназой АВС, продуктом Seikagaku Corporation и тому подобное).

В содержании эндотоксина одна единица эндотоксина (ед.Э) соответствует 345 пг эндотоксина.

ПРИМЕР ПРИГОТОВЛЕНИЯ 2
Приготовление фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты (DS 0,75%).

Его получают таким же способом, как в Примере приготовления 1, с использованием 10 г (25 ммоль дисахаридного звена) гиалуроната натрия (продукт Seikagaku Corporation; Mw 950000), 65 мл 0,05 М раствора N-гидроксисукцинимида (3,25 ммоль) в диоксане, 65 мл 0,025 М водного раствора EDС•HC1 (1,625 ммоль) и 65 мл 0,025 М водного раствора НС1•Н₂N(СН₂)₆ОСОСН=СНРh (1,625 ммоль). Получают 9,74 г фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты в виде белого твердого вещества (DS 0,75%; эндотоксин 2,5 пг/мг).

ПРИМЕР ПРИГОТОВЛЕНИЯ 3
Приготовление фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты (DS 0,90%).

Его получают таким же способом, как в Примере приготовления 1, с использованием 2,0 г (5,0 ммоль дисахаридного звена) гиалуроната натрия (продукт Seikagaku Corporation; Mw 950000), 3 мл водного раствора, содержащего 69 мг (0,6 ммоль) N-гидроксисукцинимида, 3 мл водного раствора, содержащего 58 мг (0,3 ммоль) EDС•HC1 и 3 мл водного раствора, содержащего 85 мг (0,3 ммоль) НС1•H₂N(CH₂)₆ОСОСН=СНРh. Получают 2,1 г фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты в виде белого твердого вещества (DS 0,90%; эндотоксин 2,4 пг/мг).

ПРИМЕР ПРИГОТОВЛЕНИЯ 4
Приготовление фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты (DS 1,06%).

Его получают таким же способом, как в Примере приготовления 1 с использованием 10 г (25 ммоль дисахаридного звена) гиалуроната натрия (продукт Seikagaku Corporation; Mw 950000), 100 мл 0,05 М N-гидроксисукцинимида (5,0 ммоль) в диоксане, 100 мл 0,025 М водного раствора EDС•HC1 (2,5 ммоль) и 100 мл 0,025 М водного раствора НС1•H₂N(CH₂)₆ОCOCH=CHPh (2,5 ммоль). Получают 9,64 г фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты в виде белого твердого вещества (DS 1,06%; эндотоксин 3,2 пг/мг).

ПРИМЕР ПРИГОТОВЛЕНИЯ 5
Приготовление фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты (DS 1,26%).

Его получают таким же способом, как в Примере приготовления 1, с использованием 5 г (12,5 ммоль дисахаридного звена) гиалуроната натрия (продукт Seikagaku Corporation; Mw 950000), 50 мл водного раствора 288 мг (2,5 ммоль) N-гидроксисукцинимида в диоксане, 50 мл водного раствора 240 мг (1,25 ммоль) EDС•HC1 и 50 мл водного раствора 355 мг (1,25 ммоль) НС1•H₂N(CH₂)₆OCOCH= CHPh. Получают 4,9 г фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты в виде белого твердого вещества (DS 1,26%; эндотоксин 1,0 пг/мг).

ПРИМЕР ПРИГОТОВЛЕНИЯ 6
Приготовление фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты (DS 1,29%).

Его получают таким же способом, как в Примере приготовления 1, с использованием 10 г (25 ммоль дисахаридного звена) гиалуроната натрия (продукт Seikagaku Corporation; Mw 950000), 50 мл 0,1 М раствора N-гидроксисукцинимида (5,0 ммоль) в диоксане, 50 мл 0,05 М водного раствора EDC•HCl (2,5 ммоль) и 50 мл 0,05 М водного раствора НС1•H₂N(CH₂)₆ОСОСН=СНРh (2,5 ммоль). Получают 10,0 г фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты в виде белого твердого вещества (DS 1,29%; эндотоксин 2,5 пг/мг).

ПРИМЕР ПРИГОТОВЛЕНИЯ 7
Приготовление фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты (DS 1,55%).

Его получают таким же способом, как в Примере приготовления 1, с использованием 10 г (25 ммоль дисахаридного звена) гиалуроната натрия (продукт Seikagaku Corporation; Mw 950000), 150 мл 0,05 М раствора N-гидроксисукцинимида (7,5 ммоль) в диоксане, 150 мл 0,025 М водного раствора EDC•HC1 (3,75 ммоль) и 150 мл 0,025 М водного раствора НС1•H₂N(CH₂)₆ОСОСН=СНРh (3,75 ммоль). Получают 9,92 г фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты в виде белого твердого вещества (DS 1,55%; эндотоксин 1,2 пг/мг).

ПРИМЕР ПРИГОТОВЛЕНИЯ 8
Приготовление фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты (DS 1,93%).

В 600 мл воды растворяют 4,0 г (10,0 ммоль дисахаридного звена) гиалуроната натрия (продукт Seikagaku Corporation; Mw 950000) и к раствору добавляют 300 мл 1,4-диоксана. К раствору последовательно добавляют 10 мл водного раствора, содержащего 230 мг (2,0 ммоль) N-гидроксисукцинимида, 10 мл водного раствора, содержащего 192 мг (1,0 ммоль) EDС•HC1 и 10 мл водного раствора, содержащего 284 мг (1,0 ммоль) НС1•H₂N(СН₂)₆ОСОСН=СНРh при 5-минутных интервалах при охлаждении льдом. После перемешивания смеси при комнатной температуре в течение 24 часов к ней добавляют водный раствор 2,0 г хлорида натрия с последующим перемешиванием. Полученный раствор выливают в 3,0 л этанола. Полученный таким образом желательный осадок собирают путем центрифугирования (4000 об/мин x 15 мин), промывают последовательно три раза 80%-ным этанолом и один раз этанолом и сушат, чтобы получить 4,1 г фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты в виде белого твердого вещества (DS 1,93%; эндотоксин 2,1 пг/мг).

ПРИМЕР ПРИГОТОВЛЕНИЯ 9
Приготовление фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты (DS 2,87%).

Его получают таким же способом, как в Примере приготовления 1, с использованием 10 г (25 ммоль дисахаридного звена) гиалуроната натрия (продукт Seikagaku Corporation; Mw 950000), 50 мл раствора 864 мг (7,5 ммоль) N-гидроксисукцинимида в диоксане, 50 мл водного раствора 718 мг (3,75 ммоль) EDC•HC1 и 50 мл водного раствора 1,06 г (3,75 ммоль) НС1•H₂N(CH₂)₆ОСОСН=СНРh. Получают 10 г фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты в виде белого твердого вещества (DS 2,87%; эндотоксин 2,8 пг/мг).

ПРИМЕР ПРИГОТОВЛЕНИЯ 10
Приготовление фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты (DS 2,28%).

Его получают таким же способом, как в Примере приготовления 1, с использованием 50 г (125 ммоль дисахаридного звена) гиалуроната натрия (продукт Seikagaku Corporation; Mw 950000), 250 мл водного раствора 3,45 г (30 ммоль) N-гидроксисукцинимида, 250 мл водного раствора 2,88 г (15 ммоль) EDС•HC1 и 250 мл водного раствора 15 ммоль НС1•H₂N(СН₂)₆ОСОСН=СНРh. Получают 49 г фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты в виде белого твердого вещества (DS 2,28%; эндотоксин 3,2 пг/мг).

ПРИМЕР 1
Этот Пример относится к фотоотвержденному гелю сшитой гиалуроновой кислоты, который получают фотоотвержденным сшиванием фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, полученного в Примере приготовления 6, в водном растворе с последующим замещением среды забуференным 1,5 мМ фосфатом физиологическим раствором (рН 7,4).

1,4 мас. %-ный водный раствор фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты (DS 1,29%), полученный в Примере приготовления 6, удерживают между парой пластин из стекла пирекс, каждая из которых имеет толщину 2,5 мм, с промежутком между ними 1,0 мм, облучают ультрафиолетовыми лучами (3 кВт, металлгалогенидная лампа) в течение 4 минут с каждой стороны (8 минут в целом) и затем сушат при 45^oС. К полученному сухому гелю добавляют забуференный 1,5 мМ фосфатом физиологический раствор (рН 7,4), доводя концентрацию до 2 мас.%. Затем сухой гель подвергают набуханию в течение 1 дня, чтобы получить фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты (эндотоксин 0,11 ед.Э/г).

ПРИМЕР 2
Этот Пример относится к фотоотвержденным гелям сшитой гиалуроновой кислоты, которые получают фотоотвержденным сшиванием фотореакционноспособных производных гиалуроновой кислоты, полученных в Примерах приготовления 1, 4 и 7, в 1,4 мас.%-ном растворе в забуференном 1,5 мМ фосфатом физиологическом растворе (рН 7,4).

1,4 мас. %-ный раствор каждого из фотореакционноспособных производных гиалуроновой кислоты, полученных в Примерах приготовления 1, 4 и 7 (DS 0,53%, 1,06% и 1,55% соответственно), в забуференном 1,5 мМ фосфатом физиологическом растворе (рН 7,4) удерживают между парой пластин из стекла пирекс, каждая из которых имеет толщину 2,5 мм, с промежутком между ними 1,0 мм, облучают ультрафиолетовыми лучами (3 кВт, металлгалогенидная лампа) в течение 4 минут с каждой стороны (8 минут в целом), чтобы получить фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты.

Содержание эндотоксина составляет 0,03, 0,12 и 0,05 ед.Э/г в гелях, имеющих DS 0,53%, 1,06% и 1,55% соответственно).

ПРИМЕР 3
Этот Пример относится к фотоотвержденным гелям сшитой гиалуроновой кислоты, которые получают фотоотвержденным сшиванием фотореакционноспособных производных гиалуроновой кислоты, полученных в Примерах приготовления с 1 по 9, в 2,0 мас.%-ном растворе в забуференном 1,5 мМ фосфатом физиологическом растворе (рН 7,4).

2,0 мас. %-ный раствор каждого из фотореакционноспособных производных гиалуроновой кислоты, полученных в Примерах приготовления 1-9 (DS 0,53%, 0,75%, 0,90%, 1,06%, 1,26%, 1,29%, 1,55%, 1,93% и 2,87% соответственно), в забуференном 1,5 мМ фосфатом физиологическом растворе (рН 7,4) удерживают между парой пластин из стекла пирекс, каждая из которых имеет толщину 2,5 мм, с промежутком между ними 1,0 мм, облучают ультрафиолетовыми лучами (3 кВт, металлгалогенидная лампа) в течение 4 минут с каждой стороны (8 минут в целом), чтобы получить фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты.

ПРИМЕР 4
Этот Пример относится к фотоотвержденным гелям сшитой гиалуроновой кислоты, которые получают фотоотвержденным сшиванием фотореакционноспособных производных гиалуроновой кислоты, полученных в Примерах приготовления 1, 4 и 7, в 3,2 мас.%-ном растворе в забуференном 1,5 мМ фосфатом физиологическом растворе (рН 7,4).

3,2 мас. %-ный раствор каждого из фотореакционноспособных производных гиалуроновой кислоты, полученных в Примерах приготовления 1, 4 и 7 (DS 0,53%, 1,06% и 1,55% соответственно), в забуференном 1,5 мМ фосфатом физиологическом растворе (рН 7,4) удерживают между парой пластин из стекла пирекс, каждая из которых имеет толщину 2,5 мм, с промежутком между ними 1,0 мм, облучают ультрафиолетовыми лучами (3 кВт, металлгалогенидная лампа) в течение 4 минут с каждой стороны (8 минут в целом), чтобы получить фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты.

ПРИМЕР 5
Этот Пример относится к фотоотвержденным гелям сшитой гиалуроновой кислоты, которые получают термообработкой фотоотвержденных гелей сшитой гиалуроновой кислоты, имеющих DS 1,55% и 2,87%, в Примере 3.

Фотоотвержденные гели сшитой гиалуроновой кислоты, полученные в Примере 3 из фотореакционноспособных производных гиалуроновой кислоты, имеющих DS 1,55% и 2,87%, каждый загружают в 10 мл ампулу и подвергают термообработке в автоклаве при 121^oС в течение 8 минут.

Измерение физических свойств
Проводят измерения динамической вязкоупругости (модуль накопления G', модуль потерь G" и тангенс дельта tgδ (G"/G')), динамической вязкости (η) и абсорбции воды растворов фотореакционноспособных производных гиалуроновой кислоты, полученных в Примерах приготовления 1, 4, 5 и 7, имеющих концентрацию приготовления (концентрация раствора, как концентрация гиалуроновой кислоты) 1,4 мас.%, 2,0 мас.% или 3,2 мас.%, фотоотвержденных гелей сшитой гиалуроновой кислоты, полученных в Примерах 2-4, имеющих концентрацию приготовления 1,4 мас.%, 2,0 мас.% или 3,2 мас.%, и термообработанных фотоотвержденных гелей сшитой гиалуроновой кислоты, полученных в Примере 5. Физические свойства раствора гиалуроновой кислоты, приготовленного так, что концентрация приготовления становится такой же, что и у вышеупомянутого фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты, измеряют, как описано выше. Измерение динамической вязкоупругости и динамической вязкости осуществляют реометром Модель CSL-50, изготовленным Carri-Med, рабочим элементом которого является конус, представленный на фиг.3, вращающийся с угловой скоростью ω рад/сек.

Для испытания использовался осцилляционный метод при контролируемой нагрузке.

Условия измерения:
Температура измерения 37^oС
Размер конуса 4 см (2R)
Зазор 800 мкм
Частота 10 Гц
Абсорбцию воды рассчитывают по методу определения оптической плотности для ультрафиолетовых лучей с использованием Синего Декстрана (Blue Dextran), сокращенно называемого далее как B.D., описанному в ЕР 0205674 А1, как следует далее. Физиологический раствор (0,9%-ный водный раствор хлорида натрия) используют в качестве водной среды.

Когда сухой гель помещают в раствор B.D., гель абсорбирует только воду, так как B.D. имеет высокую молекулярную массу и не может поступать в гель. Соответственно концентрация раствора B.D., остающегося неабсорбированным, повышается по сравнению с первоначальной в зависимости от поглощенной воды. Эту разницу в концентрации определяют из оптических плотностей (610 нм), и затем абсорбция воды может быть рассчитана согласно уравнению:
Абсорбция воды (• 100%) = (1 - у1/у2)/А • 1000,
где у1 обозначает оптическую плотность при первоначальной концентрации А мг сухого геля на грамм 0,1 мас.%-ного раствора B.D. и у2 обозначает оптическую плотность после 24-часового набухания в растворе B.D.

Далее абсорбцию воды исследуют на сухих образцах фотоотвержденных гелей сшитой гиалуроновой кислоты, полученных в Примере 3 из фотореакционноспособных производных гиалуроновой кислоты, имеющих DS 0,53%, 0,75%, 0,90%, 1,26%, 1,55% и 1,93%.

Некоторые из результатов измерения динамической вязкоупругости и тому подобное показаны в табл. 1 и взаимосвязь между DS и абсорбцией воды показана на фиг.2. В табл. 1 обнаруженные при анализе концентрации образцов получают путем определения содержания компонента гиалуроновой кислоты в геле в соответствии с методом реакции карбазол-серная кислота.

ПРИМЕР 6
Этот Пример относится к фотоотвержденным гелям сшитой гиалуроновой кислоты, которые получают облучением ультрафиолетовыми лучами при различных условиях и термообработкой 2,0 мас.%-ного раствора каждого из фотореакционноспособных производных гиалуроновой кислоты, полученных в Примере приготовления 10, в забуференном 1,5 мМ фосфатом физиологическом растворе (рН 7,4).

Фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты, имеющее DS 2,28%, которое получено в Примере приготовления 10, растворяют в забуференном 1,5 мМ фосфатом физиологическом растворе (рН 7,4) до получения 2,0 мас. %-ного раствора. Полученный раствор облучают ультрафиолетовыми лучами в соответствии со следующими тремя методами. До и/или после облучения ультрафиолетовыми лучами раствор (или гель) подвергают термообработке при следующих условиях. Степень сшивания, плотность полимерной сетки и характеристики вязкоупругости измеряют.

Условия облучения ультрафиолетовыми лучами (УФ-облучения):
(1) Тот же метод, как в Примерах 2-4. Водный раствор фотореакционноспособных производных гиалуроновой кислоты удерживают между парой пластин из стекла пирекс, каждая из которых имеет толщину 2,5 мм, с промежутком между ними 1,0 мм и облучают ультрафиолетовыми лучами (3 кВт) металлгалогенидной лампы в течение 4 минут с каждой стороны (8 минут в целом).

(2) Раствор удерживают между парой полиэтиленовых пленок и облучают ультрафиолетовыми лучами 400 Вт ртутной лампы высокого давления в течение 3 секунд с одной стороны.

(3) Раствор облучают, используя (400 Вт) ртутную лампу высокого давления, при пропускании его через кварцевую трубку диаметром 5 мм.

Условия термообработки (метод стерилизации в автоклаве):
А: После УФ-облучения; 121^oС, 8 мин
В: До УФ-облучения; 121^oС, 8 мин
С: До УФ-облучения; 121^oС, 8 мин и после УФ-облучения; 100^oС, 10 мин
D: После УФ-облучения; 121^oС, 15 мин
Результаты измерений показаны в табл. 2, где степень сшивания рассчитывают по следующему уравнению:
Степень сшивания (%) = Число молей димеризованной коричной кислоты • 2/число молей введенной коричной кислоты • 100
Более конкретно, коричную кислоту или ее димер химически отщепляют и экстрагируют из фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты. Извлекая выгоду из различия в молекулярной массе между коричной кислотой и ее димером, экстракт разделяют на коричную кислоту и ее димер путем гель-проникающей хроматографии (ГПХ) и каждый компонент количественно определяют, чтобы получить соответствующее число молей. Затем степень сшивания рассчитывают на основе вышеуказанного уравнения.

Плотность полимерной сетки получают из следующего уравнения:
Плотность полимерной сетки (%) = DS • степень сшивания/100
Как видно из вышеуказанных уравнений, в то время как степень сшивания является величиной, основанной на введенной коричной кислоте, плотность полимерной сетки (произведение степени сшивания и DS) может быть выражена как молярное отношение (%) димеров на составляющее дисахаридное звено гиалуроновой кислоты.

ПРИМЕР ИСПЫТАНИЯ 1
Антиадгезионный эффект на крысиной модели рога матки
Этот Пример испытания относится к антиадгезионному эффекту гелей, полученных в Примерах 1, 3, 5 и 6, и для сравнения растворов фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты перед облучением ультрафиолетовыми лучами, как полученные в Примерах 1 и 3 (на которые ссылаются здесь далее как на "гель несшитой гиалуроновой кислоты"), коммерчески доступного антиадгезионного материала ТС7 (Interceed (торговое наименование), произведенного Johnson & Johnson), и 3,2 мас.%-ного раствора гиалуроновой кислоты в забуференном 1,5 мМ фосфатом физиологическом растворе на крысиной модели рога матки.

1. Испытуемое животное
Семинедельных самок крыс Crj:SD (SFF.) приобретают и вскармливают в течение 1 недели перед испытанием. Каждая группа состоит из 5 крыс.

2. Метод испытания
2-1. Приготовление крысиной модели спайки рога матки.

Живот крысы бреют под анестезией Нембуталом. По средней линии делают разрез длиной приблизительно 4 см.

(а) Правую стенку брюшной полости вырезают до мышечного слоя трефином (трепаном) для офтальмологической хирургии и мышечный слой отслаивают щипцами.

(б) Рог матки обнажают и делают 4 поперечных надреза около 1 см вниз от яичника по направлению к шейке (матки) с интервалами 2-3 мм. Кровотечение останавливают при каждом разрезе электрическим прижиганием.

(в) Место около 3-4 мм от конца поперечных надрезов на роге матки и место в 3-4 мм от конца дефекта в стенке брюшной полости стягивают вместе единственным швом 8/0, чтобы сблизить травмы, сделанные в (а) и (б), см. выше.

2-2. Введение
Испытуемая группа
Между дефектной частью в стенке брюшной полости и надрезанной частью рога матки впрыскивают или вставляют по 1 мл фотоотвержденных гелей сшитой гиалуроновой кислоты, гелей несшитой гиалуроновой кислоты и раствора гиалуроновой кислоты, описанных выше, и коммерчески доступного ТС7, имеющего площадь 1,5 х1,5 см². Более конкретно, упомянутые выше гели вводят следующим образом. Каждый 1 мл геля, описанного выше, который точно взвешивают, забирают в шприц емкостью 1 мл (Terumo Syringe (торговое наименование) для туберкулина, стерилизованный γ-лучами, внутренний диаметр трубки около 4 мм, внутренний диаметр наконечника около 1 мм) и впрыскивают через наконечник шприца между дефектной частью в стенке брюшной полости и надрезанной частью рога матки.

Контрольная группа
Такую же операцию проводят на стенке брюшной полости и роге матки на левой стороне того же животного, которое используют для испытуемой группы, без введения материалов.

3. Оценка
Через семь дней после имплантации крыс умерщвляют путем обескровливания через сонную артерию под анестезией этиловым эфиром. После вскрытия сторону, пострадавшую от спайки, оценивают в баллах по степени спайки согласно следующей оценочной системе.

0... Нет спайки.

1... Слабая и легко отделяемая спайка.

2... Средняя и отделяемая спайка.

3... Сильная и неразделяемая спайка.

4. Результаты
Результаты испытания показаны в табл. 3 ниже. В табл. 3 условия облучения ультрафиолетовыми лучами и условия термообработки являются такими же, как описано в Примере 6.

Как можно видеть из результатов в табл. 3, в то время как коммерчески доступная пленка ТС7 против спаек является недостаточно эффективной в этой модели спайки, фотоотвержденный гель гиалуроновой кислоты данного изобретения оказывается достаточно эффективным против спаек в этой модели.

Исходя из того факта, что никакого эффекта не появляется от несшитых гелей или 3,2%-ного раствора гиалуроновой кислоты, который имеет вязкоупругость и вязкость, подобно фотосшитым гелям, можно предположить, что антиадгезионный эффект фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты данного изобретения появляется при фотоотвержденном сшивании.

ПРИМЕР ИСПЫТАНИЯ 2
Этот Пример испытания относится к антиадгезионному эффекту геля данного изобретения на той же крысиной модели спайки рога матки, как в Примере испытания 1, без остановки кровотечения дефектной части стенки брюшной полости и надрезанной части рога матки.

Антиадгезионный эффект геля данного изобретения исследуют и оценивают тем же способом, как в Примере испытания 1, за исключением того, что не проводят остановку кровотечения разрезов стенки брюшной полости и рога матки и используют 0,5 мл фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты, имеющего концентрацию 2% и DS 2,5% и подвергнутого термообработке при 105^oС в течение 10 минут перед облучением ультрафиолетовыми лучами и при 121^oС в течение 8 минут после облучения ультрафиолетовыми лучами (n=10). В качестве контроля обследуют то же животное, которое используют для испытуемой группы, без введения материалов таким же образом, как в Примере испытания 1.

Полученные результаты показаны в табл. 4.

Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты при дозе 0,5 мл показывает заметный эффект против спайки на модели без остановки кровотечения. Другими словами, результаты в табл. 4 подтверждают превосходство фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты над коммерчески доступным ТС7, который не может быть наложен на пораженную часть без проведения остановки кровотечения.

ПРИМЕР ИСПЫТАНИЯ 3
Антиадгезионный эффект фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты на крысиной модели спайки кишечника
1. Испытуемое вещество.

Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, имеющий концентрацию 2% и DS 2,5%, термообработанный при 105^oС в течение 10 минут перед облучением ультрафиолетовыми лучами и при 121^oС в течение 8 минут после облучения ультрафиолетовыми лучами.

2. Испытуемое животное
Семинедельных самок крыс SD приобретают и вскармливают в течение 1 недели перед испытанием.

3. Приготовление модели спайки
Серозную оболочку от подвздошной кишки до толстой кишки отслаивают полосой длиной 20 см и шириной 3-4 мм. Остановку кровотечения не проводят.

4. Введение и разбивка на группы
Предписанное количество (0,5 мл, 1,0 мл или 2,0 мл) геля впрыскивают из шприца емкостью 1 мл и наносят на пораженное место. После нанесения кишечный канал возвращают в брюшную полость и закрывают брюшную полость. Модель спайки без нанесения геля берут в качестве контрольной группы. Модели с нанесением 0,5 мл, 1,0 мл или 2,0 мл геля берут как группы 0,5 мл, 1,0 мл или 2,0 мл соответственно. Каждая группа состоит из 10 крыс.

5. Оценка и результаты
Через семь дней после имплантации крыс умерщвляют путем обескровливания через сонную артерию под анестезией этиловым эфиром. После вскрытия степень спайки оценивают согласно той же оценочной системе, как в Примере испытания 1. Полученный результаты показаны в табл. 5 .

Все три испытуемые группы показывают заметные антиадгезионные эффекты по сравнению с контрольной группой. Результаты в табл. 5 показывают не только эффективность гелей данного изобретения против образования спаек, но и их превосходство в липкости к ткани и биосовместимости с тканью, принимая во внимание энергичную перистальтику кишечника.

Кроме того, при вскрытии через семь дней после имплантации в испытаниях на животных в Примерах испытания 1 и 2 большинство из введенных фотоотвержденных гелей сшитой гиалуроновой кислоты становятся невидимыми для невооруженного глаза. Таким образом обнаруживается биоразложимость геля данного изобретения.

Как описано и продемонстрировано выше, фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты легко может быть получен путем облучения ультрафиолетовыми лучами высококонцентрированного водного раствора фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты. Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты данного изобретения проявляет физические свойства, такие как подходящая вязкоупругость, аффинность к ткани, биоразложимость и тому подобное, в то же время прекрасно сохраняя свойства, присущие гиалуроновой кислоте, такие как нетоксичность, неантигенность, биосовместимость, биоразложимость и тому подобное. Поэтому предполагается возможность его применения в различных областях в качестве медицинского материала высокой безопасности, например в качестве антиадгезионного материала, носителя для замедленного выделения лекарства или тому подобного. Кроме того, гель может быть инъецирован в тонкие части пораженных мест организма с помощью шприца, канюли или тому подобного, и поэтому он предполагается для применения в микрохирургии и тому подобное.

Описывается фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, который имеет модуль накопления (G') от 50 до 1500 Па, модуль потерь (G'') от 10 до 300 Па и тангенс дельта (G''/G') от 0,1 до 0,8 в динамической вязкоупругости, измеренной реометром при следующих условиях: способ измерения - осцилляционный метод испытания, контроль нагрузки; температура измерения 37^oС; размер конуса 4 см; зазор 800 мкм и частота 10 Гц, который является гидрогелем, имеющим плотность полимерной сетки (частоту поперечных связей или узлов сетки) от 0,01 до 0,5% на 1 моль составляющего дисахаридного звена гиалуроновой кислоты и который является гидрогелем, полученным путем облучения ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособная сшивающая группа химически связана с функциональной группой гиалуроновой кислоты и является производным коричной кислоты, содержащим спейсер, выбранный из ряда, включающего группы, полученные из аминоспирта, аминокислоты или пепетида, указанные смежные фотореакционноспособные сшивающие группы указанного фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты димеризованы путем облучения ультрафиолетовыми лучами с образованием циклобутанового кольца, с образованием таким образом сетчатой структуры, и указанный гель представляет собой гидрогель в таком состоянии, что он может быть извлечен для инъекции из контейнера при выдавливании. Описывается также способ получения фотоотвержденного геля. 4 с. и 11 з.п.ф-лы, 5 табл., 3 ил.

1. Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, который имеет модуль накопления (G') от 50 до 1500 Па, модуль потерь (G'') от 10 до 300 Па и тангенс дельта (G''/G') от 0,1 до 0,8 в динамической вязкоупругости, измеренной реометром, при следующих условиях: способ измерения - осцилляционный методом испытания, контроль нагрузки; температура измерения 37^oС; размер конуса 4 см; зазор 800 мкм и частота 10 Гц, который является гидрогелем, имеющим плотность полимерной сетки от 0,01 до 0,5% на 1 моль составляющего дисахаридного звена гиалуроновой кислоты и который является гидрогелем, полученным путем облучения ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособная сшивающая группа химически связана с функциональной группой гиалуроновой кислоты и является производным коричной кислоты, содержащим спейсер, выбранный из ряда, включающего группы, полученные из аминоспирта, аминокислоты или пептида, указанные смежные фотореакционноспособные сшивающие группы указанного фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты димеризованы путем облучения ультрафиолетовыми лучами с образованием циклобутанового кольца, с образованием таким образом сетчатой структуры, и указанный гель представляет собой гидрогель в таком состоянии, что он может быть извлечен для инъекции из контейнера при выдавливании. 2. Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты по п. 1, который имеет абсорбцию воды от 2000 до 15000%, как определено следующим: абсорбция воды (%) = масса абсорбированной воды/масса высушенного геля х 100%. 3. Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты по пп. 1 и 2, где указанная фотореакционноспособная сшивающая группа представлена следующими формулами 1 или 2
-NH(CR¹R²)_nOCOCH= CH-Ph (1)
где R¹ и R² каждый независимо представляют атом водорода или алкилгруппу, имеющую от 1 до 8 атомов углерода;
Рh представляет фенилгруппу;
n представляет целое число от 2 до 18;
-A-NH-Ph-CH= CHCOOR³ (2)
где R³ представляет алкилгруппу, имеющую от 1 до 8 атомов углерода, или аралкилгруппу;
А представляет - (NHCR⁴R⁵CO)_m - или -NH(CR⁴R⁵)_hCO-; R⁴ и R⁵ каждый независимо представляет атом водорода или алкилгруппу, имеющую от 1 до 8 атомов углерода;
-Ph- обозначает группу парафенилена;
m обозначает целое число от 1 до 6;
h обозначает целое число от 1 до 18. 4. Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-3, где указанную фотореакционноспособную сшивающую группу вводят в пропорции от 0,05 до 10% на 1 моль составляющего дисахаридного звена. 5. Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4, где указанный гидрогель получают облучением ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты в водной среде и затем термообработкой сшитого продукта. 6. Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4, где указанный гидрогель получают путем термообработки указанного фотореакционнноспособного производного гиалуроновой кислоты и затем путем облучения ультрафиолетовым светом в водной среде. 7. Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты по п. 6, где после указанного облучения проводят дальнейшую термообработку. 8. Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-7, где содержание эндотоксина в геле составляет 0,25 единицы эндотоксина (ед. Э)/г или менее. 9. Способ получения фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты по п. 1, включающий облучение ультрафиолетовыми лучами раствора водной среды, содержащей от 0,5 до 10 мас. % фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособная сшивающая группа химически связана с функциональной группой гиалуроновой кислоты и является производным коричной кислоты, содержащим спейсер, выбранный из ряда, включающего группы, полученные из аминоспирта, аминокислоты или пептида; формирование межмолекулярной и/или внутримолекулярной сшивки путем димеризации смежных фотореакционноспособных сшивающих групп для обеспечения сетчатой структуры. 10. Способ получения фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты по п. 9, где до и/или после облучения ультрафиолетовыми лучами указанного раствора в водной среде фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты проводят термообработку. 11. Способ получения фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты по п. 10, где указанную термообработку проводят при температуре 100 - 125^oС в течение 5 - 30 мин паром высокого давления. 12. Биомедицинский материал, содержащий фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-8. 13. Биомедицинский материал по п. 12, который имеет антиадгезионный эффект. 14. Комплект биомедицинского материала, содержащий фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-8 и контейнер, заключающий в себе указанный гель в таком состоянии, что он может быть извлечен из него. 15. Комплект биомедицинского материала по п. 14, где указанный контейнер является контейнером, который может выдавливать указанный гель для инъекции.