1
Предлагается реактив для обнаружеиия и количественного определеипя щелочных и кислотных фосфатаз в биологических жидкостях, например в сыворотке.
Известен реактив для анализа фосфатаз, который включает субстрат - двунатриевую соль л-иитрофеиилфосфориой кислоты, сухой буфер для иоддержания рН 4-И и активатор - соль магния. Эта соль в сухом состоянии нестабильна и иолучение ее затруднено. Кроме того, чувствительность известного реактива недостаточна, особенно при определении щелочных фосфатаз.
С целью повыщения стабильности реактива и чувствительности анализа, предлагается реактив, в который в качестве субстрата введена аминная соль п-нитрофенилфосфорной кислоты.
Желательно в качестве субстрата использовать соль гу5ыс-(оксиметил) аминометана и л-нитрофенилфосфорной кислоты .или соль дицИКлогексиламиНа и л-нитрофенилфосфорной кислоты. Целесообразно также в состав реаътива добавлять маннит.
Сухой порощкообразиый реактив содержит а.минную соль /г-нитрофенилфосфорной кислоты, буфер (карбоиат щелочного металла, например карбонат натрия и бикарбонат натрия), металлсодержащий активатор, предпочтительно глютамат магния или магниевую соль аспаргиновой кислоты, и маннит.
Обычно в зависимости от того, какую фосфатазу определяют, кислую или щелочную, рН
поддерживают в пределах 4-11, соответствующим образом выбирая один нли несколько известиых буферов.
В сухо.м виде этот порошок стабилен и может долго сохраняться. Он может быть разделен на отдельные небольщие порции для образования водного раствора, пригодного для проведения одного анализа сыворотки. Каждую из этих порций можно затем расфасовывать в виде таблеток или капсул.
Указанные субстраты в сухом виде бо.тее стабильны, чем двуиатриевая соль «-нитрофеиилфосфорной кислоты. Маннит также увеличивает стабильность субстрата. Кроме того, он активен в энзиматнческой реакции. Количество
добавляемого манннта можно изменять в щироких пределах, так как положительное влияние маннита приблизительно пропорционально его количеству. Верхним предело.м, по-видимому, является растворимость этого индивидуального вещества в воде при температуре проведения испытания, т. е. около 37°С. Точны.ми экспериментами было установлено, что заметные результаты можно получить при концентрации добавки несколько мнллиграммов на 1 мл растворенного в воде аналитичеСКОРО реактива. Пределы конструкции маннита составляют 25-180 мг на 1 мл разбавленного водой реактива.
Реактив можно растворять в стандартном количестве воды и смешивать затем его с биологической пробой для проведения энзиматической реакции. Количество субстрата, содержащегося в реактиве, должно быть достаточным для того, чтобы реакция происходила с постоянной скоростью. В результате онределяют .количество или величину активности неизвестного фермента.
Аминные соли п-нитрофенилфосфорной кислоты (п-НФФ) могут быть нолучены реакцией соответствующего амина с солью щелочного металла /г-нитрофенилфосфорной «ислоты. Эти соли могут быть осаждены концентрированием или же добавлением органического растворителя. Кроме того, свободную п-нитрофенилфосфорную кислоту можно нейтрализовать соответствующим амином в растворе и осадить соль добавлением органического растворителя или унариванием до начала кристаллизации, затем соль отделяют, промывают и сушат.
Пример 1. Определение активности солей /г-иит рофенилфосфорной кйслоты (п-НФФК).
Компоненты реактива.
Буфер (рН 10,2). Растворяют 8 г Ка2СОз 2 г NaHCOs и 300 мг глютамата магния в 1 л воды.
Анормальная клиническая химическая контрольная сыворотка Хиланда.
0,03 М растворы амииных солей п-НФФК.
0,03 М pacTBOip двунатриевой соли л-НФФК (в качестве контрольного).
Расчет.
Скорость реакции аминнойсоли/г-НФФК, %: ДЛ405/МИН (амин)х100
ДЛоб/МИН (МЗг)
Свободный п-нитрофенол(вес. %) определяют цри 405 MiMK.
Свободный /г-нитрофенол
.Л405 (ДДЯ пробы)
406 (для стандарта)
В табл. 1 нриведена энзиматическая активность аминных солей.
Таблица 1
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Реактив для турбидиметрического определения липазы | 1980 |
|
SU1367867A3 |
| ПАТЕНТНО-- ^ Т>&л1}1ЧЕП;Д^ 5 F::5A^OYcKA | 1972 |
|
SU328604A1 |
| СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХИ | 2007 |
|
RU2331889C1 |
| Способ определения растворенного в воде кислорода | 1980 |
|
SU945063A1 |
| Способ гетерогенного иммуноферментного анализа антигена | 1985 |
|
SU1158933A1 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕПИЯ СОДЕРЖАНИЯ ПОДВИЖНОГО АЗОТА В ПОЧВЕННЫХ ВЫТЯЖКАХ | 1970 |
|
SU268740A1 |
| Способ выделения специфического фактора УШ | 1978 |
|
SU1082338A3 |
| Способ гетерогенного иммуноферментного анализа антигена | 1984 |
|
SU1153669A1 |
| Способ определения активности транскетолазы | 1977 |
|
SU629500A1 |
| Способ определения пирувата в биологических объектах | 1984 |
|
SU1322984A3 |
Перед доВавлением сыворотки.
Определение образования п-нитрофенола из солей п-НФФК нри различных внешних условиях.
Методика. Взвешивают 3 пробы каждой соли по 100 мг. Помещают первую нробу каждой соли п-НФФК в сухой эисикатор, кладут вторую пробу в эксикатор с насыщенным раствором сульфата аммония для выдерживания ее при постоянной влажности, третью пробу выдерживают при комнатных условиях.
Выдерживают все образцы в этих условиях по крайней мере в течение 48 час. Растворяют каждую пробу в 5 мл воды (свободный /г-нитрофенол растворяется в 5 мл воды, если нет
полного растворения, то твердый осадок удаляют).
В кювету отбирают пипеткой 0,05 мл образца и добавляют 2,5 мл буферного раствора (рН 10,2). Определяют светопоглощение при 405 ммк на любом подходящем спектрофотометре,.
Расчет.
Свободный ft-нитрофенол (вес. %) Л405ХО,228.
В табл. 2 приведены результаты определения свободного п-нитрофенола после обработки реагента фосфатазой.
Растворим не полностью.
Пример 2. Методика определения щелочной фосфатазы. Реактивы.
Раствор А. В 100 мл дистиллированной воды растворяют следующие вещества, мг: NaaCOg850
ЫаНСОз250
Магниевая соль аопарагиновой кислоты50
Ди- (циклогексиламмонийная) соль /г-НФФ315
Раствор Б. В 10 мл свежеприготовленного раствора растворяют 1000 мг маннита.
Растворы А и Б смешивают вместе для получения четырех аналитических реагентов, как описано ниже.
Реагент 1 :3 мл дистиллированной воды.
Реагент 2:3 мл раствора А+О мл раствора
Таблица 2
Б (концентрация маинита в реагенте равна О мг/мл).
Реагент 3:2 мл раствора А+1 мл раствора Б (концентрация маннита в реагенте равна 33 мг/мл).
Реагент 4 :0 мл раствора А+З мл раствора Б (концентрация маннита в реагенте равна 100 мг/мл).
Реагенты помещают в кюветы, выдерживают в течение 10 мин при 37°С, после чего определяют п записывают оптиче скую плотность при 415 ммк.
Энзиматическую реакцию инициируют добавлением 20 К анормальной сыворотки Хиланда (серийный номер 368А16).
Показания снимают спустя 10 мин после того, как реагент смешали с сывороткой (Лю) и через 15 мин (Лis). Результаты приведены в табл. 3.
Таблица 3
Таким образом,
Д )0
5 (мин)
) Эту серию сыворотки предварительно калибруют хорошо известными методами для оиределения соответствующего числа Международных единиц (М. Е.) следующим образом. Оптическая плотность раствора «-нитрофенола с концентрацией 1 мкмоль/мл равна 17,7. 415 - оптическая плотность При длине волны 4IP ммк.
М. Е./ сыворотки ДЛ415 ммк X общий объем1000
X
17,7
мл Сыворотки
где Л,, ММК/МИН 415 ммк (при 10 мин)
5 мин
ммк (при 5 мин)
5 мин
Общий объем 3,0 мл.
Количество сыворотки 0,020 мл (20 К).
Расчет.
М.Е./л сыворотки - ММК/МИН X 3,0 1000 17,7 о,020
М. Е./л сыворотки - 8450.
Для изготовления реактива сухие ингредиенты смещивают и смесь таблетируют или капсулируют известными методами. Состав таблетки реактива для 3 мл щелочной фосфатазы:
Ма2СОз, мл Магниевая соль аснарагииовой .кислоты, мг грмс-(Оксиметил) ампиометан л-НФФ, мг
Маииит, мг
Карбовакс 4000, мг
В оптической кювете растворяют одпу таблетку (или кацсулу), содержащую указанные ингредиенты, в 3,0 мл воды, добавляют 20 л анализируемого образца сыворотки. Как только реагент и образец перемещаются, происходит следующая реакция:
рН 8Аминная соль- Щелочная я-НФФ фосфатаза
рН 8-10 (Оуфер)
Нитрофенол -f Соль фосфорной
.. .р
кислоты.
Кювету выдерживают при 37°С и измеряют скорость изменения оптической плотности в течение 10 мин. Так как это - скорость реакции, температура и определяемые интервалы доллсны быть точно соблюдены.
Предмет изобретения
-4. Реактив по п. 1, отличающийся тем, что в его состав вве.ен маииит.
Приоритет 14.11.66 установлен по пп. 1,2иЗ; приоритет 31.03.67-ло п. 4.
