СПОСОБ PCR-ТЕСТИРОВАНИЯ ПРОБ ДОНОРСКОЙ КРОВИ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/50 A61K39/12 A61K48/00 C12Q1/70 C12Q1/68 

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки 08/683784, поданной 16 июля 1996, из которой была выделена заявка 08/419620, поданная 10 апреля 1995, содержание которой вводится в настоящее описание посредством ссылки.

В общих чертах, настоящее изобретение относится к системам и способам получения и анализа проб плазмы, взятых от доноров, для однозначной идентификации доноров, инфицированных вирусом. В частности, настоящее изобретение относится к устройству и способу создания индивидуальных, изолированных друг от друга и соединенных друг с другом контейнеров, содержащих пробы той же самой плазмы, которая содержится в материале, взятом от доноров. Настоящее изобретение также относится к устройству и способу для получения пулов из этих контейнеров в целях предварительного скрининга и тестирования этих пулов на присутствие вируса в соответствии с алгоритмом для идентификации отдельных проб, взятых от инфицированных доноров, с использованием наименьшего числа циклов тестирования.

Программы сбора донорской крови, плазмы и физиологических жидкостей являются первыми важными ступенями в производстве фармацевтических препаратов и препаратов крови, которые способствуют улучшению качества жизни и которые могут спасти жизни людей при различных травмах. Эти препараты используются для лечения иммунологических расстройств, для лечения гемофилии, а также для поддержания и сохранения объема крови при хирургических операциях и других способах лечения. Для терапевтического применения крови, плазмы и биологических жидкостей необходимо, чтобы материалы, полученные от доноров, по возможности, не были инфицированы вирусами. Обычно пробу для серологического теста, взятую от каждого отдельного донора крови, плазмы или другой жидкости, анализируют на различные антитела, которые вырабатываются в ответ на специфические вирусы, такие как гепатит С (HCV) и две формы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2). Кроме того, проба для серологического теста может быть проанализирована на антигены, ассоциированные с конкретными вирусами, такими как вирус гепатита В (HBV), а также на антитела, вырабатываемые в ответ на присутствие этих вирусов. Если данная проба является сероположительной на присутствие либо специфических антител, либо антигенов, то эта донорская кровь не пригодна к дальнейшему использованию.

Тест на антигены некоторых вирусов, таких, как гепатит В, очевидно четко коррелирует с инфекционностью, тогда как тест на антитела такой корреляции не имеет.

Давно известно, что донор плазмы крови может быть в действительности инфицирован вирусом, однако тест на антитела к этому вирусу может оказаться сероотрицательным. Так, например, существует "окно" между временем заражения донора этим вирусом и моментом появления антител, вырабатываемых в ответ на этот вирус в организме донора. Период времени между первым появлением вируса в крови и присутствием обнаруживаемых антител, вырабатываемых в ответ на этот вирус, известен как период "окна". В случае ВИЧ, средний период "окна" составляет приблизительно 22 дня, тогда средний период "окна", оцененный для HCV, составляет приблизительно 98 дней. Поэтому тесты на обнаружение антител могут давать ложные результаты в отношении инфицирования донора в том случае, если они были осуществлены в этот промежуточный период "окна", то есть в период между инфицированным вирусом и продуцированием антител. Более того, даже в том случае, когда стандартный анализ на HBV проводили с помощью тестов как на антитела, так и на антигены, тестирование более чувствительными методами подтверждало присутствие вируса HBV в образцах, которые показали отрицательный результат в тесте на антиген HBV.

Один из методов тестирования донорских проб, которые прошли тесты на соответствующие антитела и антигены для гарантии отсутствия в них зарождающейся вирусной инфекции, предусматривает проведение анализа донорского материала с помощью полимеразной цепной реакции (PCR). Метод с использованием PCR представляет собой в высокой степени чувствительный метод обнаружения присутствия в биологическом материале специфических ДНК- или РНК-последовательностей, родственных рассматриваемому вирусу, путем амплификации вирусного генома. Поскольку PCR-тест направлен на обнаружение присутствия главного компонента самого вируса, то его присутствие у донора может быть обнаружено почти сразу после инфицирования. Поэтому в данном случае теоретически не существует какого-либо промежуточного периода "окна", во время которого тест может давать ложный результат, указывающий на отсутствие инфекции. Соответствующее описание методики и практического применения PCR-аналиэа можно найти в патенте США 5176995, и это описание вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Однако PCR-тест является очень дорогостоящим методом, и поскольку общее число доноров включает в себя относительно небольшое число PCR-положительных доноров, то отдельное тестирование каждого донора не является экономически выгодным или экономически целесообразным. Поэтому необходимо разработать эффективный и экономически выгодный способ анализа большого числа донорской крови или плазмы для исключения необходимости анализа проб от отдельных доноров, имеющих вирусную инфекцию на уровне, превышающем предварительно установленный уровень.

Один из способов тестирования плазмы от большого числа доноров заключается в сборе пула плазмы от ряда отдельных доноров. Затем этот пул (то есть собранный материал) подвергают PCR-анализу, и материал от отдельных доноров, составляющий этот пул, либо сохраняют, либо удаляют в зависимости от результатов PCR-теста. При уменьшении числа PCR-тестов и связанных с ними материальных затрат этот метод приводит к значительной потере существенной части донорского материала, не содержащего вируса. Поскольку причиной, приводящей к получению PCR-положительного пула, может являться лишь один донор, инфицированный вирусом на уровне, превышающем заранее установленный уровень, то все остальные доноры, от которых были получены пробы, содержащиеся в этом пуле, могут быть каждый в отдельности PCR-отрицательными. Этот результат является в высокой степени вероятным, учитывая, что во всей группе доноров присутствует относительно небольшое число PCR-положительных доноров. В стандартном методе сбора кровяного депо, в случае получения PCR-положительного результата, весь донорский материал, составляющий этот пул, выбрасывают, включая и материал, полученный от тех доноров, которые являются PCR-отрицательными.

Кроме того, часто донорскую плазму замораживают сразу после ее получения. Если пробы от отдельных доноров плазмы необходимо объединить в пул, то каждую из таких донорских проб необходимо оттаивать, брать от этой донорской пробы аликвоту крови или плазмы, а затем этот донорский материал должен быть снова заморожен для хранения. Проведение множественных циклов замораживания-оттаивания может неблагоприятно повлиять на выделение нужной РНК или ДНК, а также белков, содержащихся в плазме и, тем самым, негативно отразиться на всем PCR-тесте. Кроме того, каждый раз когда аликвоту плазмы от отдельного донора берут для создания пула, то этот донорский материал подвергают инфекции, вносимой как из окружающего пространства, так и из устройства, используемого для взятия аликвот. Более того, если донорский материал содержит вирус, то он может инфицировать другие донорские материалы. Во избежание внесения вирусной инфекции в донорский материал, который не содержит того или иного вируса, устройство для взятия образцов должно быть либо стерилизовано после каждого отдельного использования, либо оно должно быть использовано для взятия только одной аликвоты от одного отдельного донора, а для взятия аликвоты от другого отдельного донора должно быть использовано другое устройство, которое предназначено для взятия проб. Любой из этих методов является в высокой степени дорогостоящим и занимает исключительно много времени.

В соответствии с этим необходимо разработать способ и систему для получения проб крови и плазмы от множества доноров так, чтобы эти конкретные пробы можно было объединить в пул, не инфицируя при этом остальные пробы. Желательно также, чтобы этот способ и система позволяли быстро и эффективно получать указанные пулы без внесения инфекции лаборантом при клиническом исследовании, или без внесения инфекции из окружающей среды при лабораторных исследованиях.

Кроме того, желательно, чтобы способ и система осуществления такого эффективного и экономически рационального анализа донорской крови или плазмы позволяла однозначно идентифицировать лишь только PCR-положительных доноров с использованием, по возможности, наименьшего числа циклов тестирования.

Поэтому настоящее изобретение относится к экономически рациональному и эффективному способу получения и анализа проб крови или плазмы, взятых от множества доноров в целях однозначной идентификации доноров, инфицированных вирусом, а также к системам и устройствам для практического осуществления этого способа.

Способ настоящего изобретения позволяет получать значительно более безопасные препараты крови и плазмы, поскольку они могут быть легко протестированы на содержание вирусной инфекции непосредственно в исходном материале крови или плазмы. В высокой степени эффективные и экономически рациональные тесты могут быть осуществлены сразу, и инфицированные доноры могут быть выявлены в любое время, даже если это исследование проводится в период "окна инфекционности".

В одном из вариантов настоящего изобретения этот способ включает в себя стадии получения донорской крови или плазмы в контейнере-сборнике. Этот контейнер соединен с гибким сегментом-сборником, который сообщается с внутренней частью контейнера. Этот сегмент-сборник наполняется кровью или плазмой, поступающей из контейнера-сборника, и часть этого сегмента-сборника герметично запаивается с обоих концов. Эта герметично запаянная часть сегмента-сборника отделяется от контейнера, и, либо до, либо после удаления этой герметично запаянной части сегмента-сборника, вдоль длины этого сегмента-сборника, между его двумя запаянными концами, создают множество герметичных перемычек на определенном расстоянии друг от друга. Эти части сегмента в интервалах между соседними герметичными перемычками образуют емкости, где каждая такая емкость содержит пробу плазмы или крови и где каждая такая емкость, находящаяся в промежутках между герметичными перемычками, имеет объем, достаточный для проведения запланированных тестов.

В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения плазму от отдельного донора собирают в сосуд-сборник, который снабжен тест-контейнером, соединенным с этим сосудом посредством сегмента гибкой полой трубки. После заполнения этого сосуда донорской плазмой этот сосуд с плазмой наклоняют так, чтобы плазма поступала в тест-контейнер и в гибкий сегмент трубки, наполняя тем самым этот сегмент трубки. Этот сегмент трубки герметично запаивают вдоль его длины с образованием перемычек на определенном расстоянии друг от друга, при этом части этого сегмента трубки в интервалах между указанными герметичными перемычками образуют пакеты, каждый из которых содержит пробу донорской плазмы. Этот сегмент трубки, который превращается в серию пакетов, затем отсоединяют от сосуда для сбора плазмы и замораживают до проведения анализов.

В другом аспекте осуществления настоящего изобретения этот сегмент полой трубки содержит серию соединенных друг с другом Y-образных элементов, включая элемент для ввода, расположенный на одной ветви Y, где каждая из боковых ветвей конкретного Y-элемента, которая не включает элемент для ввода, соединена с основанием следующего Y-элемента в данной цепи с помощью гибкого пластикового сегмента трубки. Вдоль длины каждого сегмента гибкой пластиковой трубки имеются созданные на определенном расстоянии друг от друга герметичные перемычки, которые разделяют эти Y-элементы.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения устройство для создания множества перемычек, образуемых путем термосварки вдоль длины сегмента трубки, наполненного донорской кровью или плазмой, содержит первую и вторую плиты для сварки, расположенные напротив друг друга. Вдоль длины каждой плиты для сварки имеется множество расположенных на расстоянии друг от друга выступающих частей, чередующихся с впадинами. Выступающие части и впадины на первой плите совпадают с соответствующими выступающими частями и впадинами на второй плите. Расположенные напротив друг друга плиты для сварки движутся вместе по сегменту пластиковой трубки, наполненной донорской кровью или плазмой, и создают герметичные перемычки на участках этого сегмента трубки путем зажатия этого сегмента между выступами указанных плит с образованием камер, ограниченных расположенными напротив друг друга впадинами. Эти полученные путем термосварки перемычки ограничивают множество отдельных и расположенных друг за другом камер, где каждая камера сформирована каждой из таких смыкающихся пар впадин, которые определяют конфигурацию этих камер в виде пакета.

В частности, устройство для формирования путем термосварки множества перемычек, расположенных вдоль длины сегмента трубки, наполненной донорской кровью или плазмой, имеет такую конфигурацию, что оно после модификации может быть установлено в коммерчески доступном устройстве для термосварки.

В еще одном варианте осуществления изобретения система для сбора и получения проб в целях проведения тестов включает в себя контейнер для сбора плазмы и полые пластиковые трубки, соединенные с этим контейнером, каждая из которых состоит из пластика и содержит индексы кода, впечатанные в пластик. Эти индексы кода расположены вдоль главной оси сегмента трубки, и этот код повторяется через определенное расстояние так, что этот сегмент трубки, по всей своей длине, может быть снабжен множеством расположенных на определенном расстоянии друг от друга герметичных перемычек, которые образуют, таким образом, пакеты, ограниченные этими перемычками. Интервалы между индексами кода соответствуют интервалам пакетов так, чтобы каждый пакет содержал по крайней мере один цикл кода.

Для начала процедуры тестирования в соответствии со способом настоящего изобретения от каждой группы сегментов-трубок, соответствующих множеству проб плазмы, взятых от отдельных доноров, удаляют первый пакет. Часть содержимого каждого такого первого пакета удаляют, и из этих частей содержимого образуют пул в контейнере.

В типичном варианте осуществления изобретения первый пул тестируют на присутствие вируса. Если тест этого первого пула дает положительный результат, то от каждого из сегментов трубок, которые были использованы для получения первого пула, удаляют следующий или второй пакет. Вторые пакеты делят на две приблизительно равные подгруппы, и содержимое одного из пулов этой подгруппы тестируют на присутствие конкретного вируса. Если тесты проанализированного пула этой подгруппы дают отрицательный результат на вирус, то из соответствующих сегментов трубки, используемых для формирования не проанализированной подгруппы, удаляют следующий пакет. Эти пакеты делят на две приблизительно одинаковые подгруппы следующей генерации, и содержимое пакетов этой подгруппы объединяют в пулы. Один из пулов подгруппы следующей генерации тестируют на присутствие вируса.

Если тесты пула этой проанализированной подгруппы дают положительный результат на вирус, то этот пакет удаляют из соответствующих сегментов трубок, использованных для формирования этой проанализированной подгруппы. Этот процесс повторяют, причем каждый положительный пул снова подразделяют на соответствующие более мелкие подгруппы, где каждая из этих последующих подгрупп содержит фракцию проб от предшествующей положительной подгруппы, и так до тех пор, пока не будет идентифицирован последний пакет, соответствующий пробе плазмы, взятой от одного донора.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения дополнительный способ тестирования множества проб донорской плазмы, осуществляемый в целях идентификации доноров, являющихся носителями вируса, за один PCR-цикл тестирования, включает в себя стадии определения n-размерной матрицы, которая определяется внутренними элементами, находящимися в точке пересечения каждого из n-измерений матрицы. Пробу от каждого из доноров плазмы отображают в соответствующий элемент массива, причем каждая такая проба определяется матричным представлением Х_rcs, где нижний индекс элемента матричного представления определяет индексы размерности данного массива. От каждой пробы плазмы, взятой от каждого донора, берут аликвоты, и объединяют в подпулы. Каждый подпул включает в себя аликвоту всех проб донорской плазмы, для которых фиксируется один из индексов размерности. Эти подпулы все тестируются одновременно в одном цикле PCR-теста, и индексы размерности для каждого подпула, который дает положительный результат теста, оценивают путем "сокращения" по методу миноров, что позволяет однозначно идентифицировать единственный элемент, определяемый индексом размерности каждого положительного подпула, и тем самым однозначно идентифицировать единственную положительную пробу.

Эти и другие отличительные признаки, аспекты и преимущества настоящего изобретения будут более очевидны из последующего подробного описания, формулы изобретения и чертежей.

Фиг. 1 представляет собой полусхематическое перспективное изображение одного из вариантов сосуда для сбора донорской плазмы и контейнер с пробами, соединенными друг с другом посредством сегмента трубки, используемой при осуществлении настоящего изобретения.

Фиг. 2 представляет собой полусхематическое перспективное изображение сегмента трубки, соединяющего сосуд с донорской плазмой и контейнер с пробами и разделенного на пакеты в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 2а представляет собой полусхематическое перспективное изображение сегмента трубки, соединяющего сосуд с донорской плазмой и контейнер с пробами и включающего в себя серию соединенных друг с другом Y-элементов в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 3а представляет собой увеличенный вид сверху части сегмента трубки, показанного на фиг.2, и иллюстрирует дополнительные детали герметичных перемычек, которые разделяют пакеты.

Фиг.3b представляет собой полусхематическое поперечное сечение перемычек сегмента трубки.

Фиг.4 представляет собой полусхематическое перспективное изображение устройства настоящего изобретения для запаивания трубок с образованием отдельных пакетов.

Фиг. 4а представляет собой полусхематическое перспективное изображение верхней и нижней плит в устройстве для термосварки настоящего изобретения, которое может быть вмонтировано в коммерчески доступный аппарат для термосварки.

Фиг. 5 представляет собой полусхематическое перспективное изображение планшета для сбора проб и планшета-крышки, предназначенных для осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 6 представляет собой полусхематическое поперечное сечение пакета с плазмой, содержащегося в лунке планшета для сбора проб, предназначенного для осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 7 представляет собой полусхематическое перспективное изображение устройства настоящего изобретения для разрушения пакетов с пробами и извлечения жидких проб из контейнера для образования пула.

Фиг. 8 представляет собой полусхематическое поперечное сечение дробильного цилиндра устройства, изображенного на фиг 7.

Фиг. 9а представляет собой полусхематическое поперечное сечение сортировочной плиты, на которой происходит разрушение пакетов, содержащих пробы.

Фиг.9b представляет собой полусхематическое изображение вида сверху сортировочной плиты, иллюстрирующее радиальные и концентрические желобки для сбора жидких проб после разрушения пакетов с пробами.

Фиг. 10 представляет собой полусхематическое поперечное сечение дробильного поршня устройства, изображенного на фиг.7.

Фиг.11 представляет собой блок-схему проведения тестирования по методике настоящего изобретения в целях выявления положительных доноров путем PCR-теста пулов донорских проб.

Фиг. 12 представляет собой блок-схему проведения серии тестов настоящего изобретения для идентификации одной PCR-положительной пробы из пула, созданного из 512 донорских проб.

Фиг. 13 представляет собой блок-схему проведения второго теста по методике настоящего изобретения в целях выявления положительных доноров путем PCR-теста пулов донорских проб; и
Фиг. 14 представляет собой 3-мерную матрицу настоящего изобретения, на которой обозначены индексы r, с и s.

Настоящее изобретение относится к системам, способам и устройствам, используемым для анализа донорской крови или плазмы в целях обнаружения конкретных донорских проб, инфицированных вирусом на уровне, превышающем заранее определенный уровень. Такие инфицированные донорские пробы затем отбрасывают для предотвращения введения их в общий поток исходного материала, используемого для получения фармацевтических продуктов или для переливания крови пациентам. Тестами на обнаружение вируса, используемыми в соответствии с настоящим изобретением, могут быть любые тесты, которые позволяют осуществлять прямое обнаружение вируса, в отличие от тестов на антитела, вырабатываемые против этого вируса. Такими тестами являются тесты, проводимые с помощью полимеразной цепной реакции (PCR-тесты), и другие тесты, которые являются достаточно чувствительными для прямого обнаружения вируса даже после объединения в один пул проб, полученных от множества доноров.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения получают множество проб плазмы или крови, взятых от отдельных доноров. Пробу крови или плазмы, взятую от каждого донора, вводят в соответствующий гибкий полый сегмент трубки. По всей длине этого сегмента трубки через соответствующие интервалы создают множество расположенных на определенном расстоянии друг от друга герметичных перемычек так, чтобы части этого сегмента в интервалах между этими перемычками образовывали пакеты, где этот пакет содержит пробу крови или плазмы. Как более подробно обсуждается ниже, в настоящем изобретении представлена уникальная методика тестирования проб плазмы из этих пакетов после того, как эти пробы были объединены в пулы, которая позволяет осуществлять экономичное и эффективное обнаружение и выделение любой донорской крови или плазмы, которая инфицирована вирусом.

На фиг. 1 проиллюстрирован вариант системы настоящего изобретения, предназначенный для осуществления процесса взятия проб. Эта система включает в себя стандартный контейнер для донорской плазмы 20, сконструированный из нереакционноспособного материала, такого как поливинилхлорид (ПВХ). Этот контейнер для донорской крови 20 включает в себя крышку 22, имеющую два полых коленчатых патрубка 23 и 24, соответственно соединенных с ее верхней поверхностью. Эти два патрубка сообщаются с внутренним пространством сосуда для донорской крови посредством отверстий, имеющихся в крышке 22 для этой цели. Гибкий полый наливной патрубок 26, сконструированный из биологически нейтрального материала, такого как полимер ПВХ, одним своим концом соединен с коленчатым патрубком 23, а другим концом соединен, например, с иглой, которую вводят донору для взятия крови. В проиллюстрированном варианте настоящего изобретения тест-контейнер 28 также предназначен для сбора пробы донорской крови, которую тестируют на серологическую реакцию. Тест-контейнер 28 представляет собой, в основном, тест-сосуд, имеющий форму пробирки, который также сконструирован из биологически нереакционного материала. Тест-контейнер 28 содержит цельный закрывающий элемент 30, который имеет отверстия для сообщения с внутренней частью тест-контейнера.

Гибкий полый сегмент трубки 32, сконструированный из биологически нереакционноспособного пластикового материала, присоединен между закрывающим элементом 30 тест-контейнера 28 и полым коленчатым патрубком 24 крышки контейнера для донорской плазмы. Сегмент трубки 32 соединен с закрывающим элементом 30 так, чтобы жидкость, проходящая через сегмент трубки, поступала в тест-контейнер 28 через отверстие, имеющееся для этой цели в закрывающем элементе 30. Этот сегмент трубки 32 может быть введен в указанное отверстие путем фрикционной посадки, или путем ультразвуковой сварки, либо он может быть как-нибудь иначе соосно соединен с этим отверстием способами, хорошо известными специалистам.

Этот закрывающий элемент 30 может также иметь второе отверстие, к которому подсоединена вытяжная трубка 34 таким же образом, как и к сегменту трубки 32. Вытяжная трубка 34 имеет, в основном, длину не более чем два дюйма, а на своем конце она обычно имеет антибактериальный фильтр, вставленный путем фрикционной посадки.

В типичном варианте осуществления изобретения донорскую кровь или плазму берут у донора и собирают в контейнер для донорской плазмы 20 с последующим ее хранением до тех пор, пока она не потребуется. При взятии донорской плазмы обычно у донора берут кровь и пропускают ее через центрифугу непрерывного действия, где в результате центрифугирования, от окружающей жидкой плазмы отделяются эритроциты, которые возвращают донору. Затем плазму собирают.

После получения плазмы у донора и после наполнения контейнера для донорской крови 20 этот контейнер наклоняют так, чтобы уровень жидкости в этом контейнере был выше коленчатого патрубка 24, соединенного с сегментом трубки 32. Плазма поступает в этот сегмент трубки, проходит через этот сегмент и наполняет тест-контейнер 28. В процессе заполнения воздух, присутствующий в тест-контейнере 28, захватывается и выходит через вытяжную трубу 34, что способствует полному наполнению тест-контейнера. Антибактериальный фильтр 36 удаляет любые бактерии в выходящем воздухе, что предотвращает инфицирование проб из окружающего пространства. После наполнения тест-контейнера плазма, взятая у доноров, наполняет сегмент трубки 32.

Как показано на фиг.2, после поступления проб донорской плазмы в сегмент трубки 32 этот сегмент трубки запаивают путем термосварки 38 или другого подходящего способа запаивания, такого как ультразвуковая сварка, на участке, расположенном возле соединения сегмента трубки с контейнером для донорской плазмы. Затем путем термосварки образуют перемычку 40 в сегменте трубки на участке, расположенном возле соединения сегмента с тест-контейнером 28. Таким образом получают длинную полую трубку, герметично запаянную с обоих концов и содержащую определенное количество донорской плазмы.

Заполненную часть сегмента трубки 32 отделяют от контейнера с донорской плазмой и тест-контейнера путем разрезания сегмента трубки по центру запаянных участков 38 и 40. Затем отделенный контейнер с донорской плазмой удаляют для замораживания и хранения, а отделенный тест-контейнер направляют в лабораторию для серологического анализа. Обычно его содержимое анализируют на различные антитела, которые вырабатываются в ответ на конкретные вирусы, такие как вирус гепатита С (HCV) или ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

По всей длине сегмента трубки через соответствующие промежутки делают также дополнительные герметичные перемычки 42, в результате чего образуются отдельные следующие друг за другом и соединенные друг с другом пакеты, каждый из которых содержит полую часть 44 сегмента трубки. Каждая такая часть 44 содержит определенное количество крови или плазмы, необходимое для образования пула конкретной генерации. Так, например, в изолированных пакетах, сформированных для PCR-теста, может находиться приблизительно 0,02-0,5 мл крови или плазмы, взятой от конкретного донора.

Сегмент трубки запаивают с получением от 5 до 15 отдельных и соединенных друг с другом пакетов. Запаивание с образованием пакетов может быть осуществлено либо после того, как этот сегмент трубки был отделен от контейнера для донорской крови и от контейнера для серологического теста, либо, предпочтительно, в то время, когда сегмент трубки был еще присоединен к контейнеру для донорской плазмы, что позволяет избежать создания гидростатического давления. Запаивание может быть осуществлено любым известным методом, таким как термокомпрессионная сварка (термосварка), ультразвуковая сварка или т. п., при условии, что длина уплотненного и запаянного участка является достаточной для того, чтобы соединенные друг с другом пакеты могли быть отделены друг от друга путем разрезания по центру этого запаянного участка без нарушения целостности этого пакета с любой стороны, как это хорошо показано на фиг.3а и 3b.

Второй вариант сегмента трубки, сконструированного так, чтобы его можно было разделить на участки с аликвотами, содержащими пробы крови или плазмы, показан на фиг. 2а, на котором полусхематически представлено перспективное изображение варианта сегмента трубки-сборника, присоединенного между сосудом с донорской плазмой 20 и контейнером для проб 28 и разделенного на участки, содержащие аликвоты в соответствии с настоящим изобретением.

Сегмент трубки-сборника 50 соединен с закрывающим элементом 30 тест-контейнера 28 и с полым коленчатым патрубком 24 крышки контейнера с донорской плазмой. Этот сегмент трубки 50 обычно включает в себя множество Y-элементов 51, последовательно соединенных друг с другом посредством гибких полых сегментов трубок 52, изготовленных из медицинского пластика. Эти Y-элементы 51 обычно сконструированы так, что они подсоединяются к аппарату для внутривенного вливания и содержат цилиндрический корпус 53, через который проходит поток и который имеет выходное отверстие 54 на одном своем конце и входное отверстие 55 на другом своем конце. На корпусе 53 этого Y-элемента имеется боковой патрубок 56, включающий в себя участок, по которому проходит жидкость и который сообщается с участком прохождения жидкости через корпус 53.

Один Y-элемент соединен путем сварки под флюсом со следующим Y-элементом посредством гибкой полой медицинской пластиковой трубки 52, идущей от выходного порта 54, расположенного в нижней части одного Y-элемента, к боковому патрубку 56 другого последовательно соединенного с ним Y-элемента. Первая гибкая входная трубка 57 соединяется путем сварки под флюсом с боковым патрубком первого Y-элемента в этой серии Y-элементов. Эта первая входная трубка 57, в свою очередь, соединяется путем сварки под флюсом с коленчатым патрубком 24 крышки контейнера с донорской плазмой. Это соединение может быть осуществлено путем введения первой входной трубки 57 в коленчатый патрубок 24 посредством фрикционной посадки или путем ультразвуковой сварки, либо он может быть как-нибудь иначе соосно соединен с этим отверстием способами, хорошо известными специалистам. Кроме того, первая входная трубка 57 может заканчиваться стандартным патрубком люэровского типа 58, позволяющим последовательно соединять Y-элементы, которые являются съемными и соединяются с контейнером для донорской крови, снабженным стыкующим соединителем люэровского типа на конце колена 24.

Аналогичным образом, концевой Y-элемент снабжен гибкой полой концевой выходной трубкой 59, которая соединена путем сварки под флюсом с концевым Y-элементом у его выходного порта. Своим дистальным концом эта трубка может быть также соединена со стандартным патрубком люэровского типа.

Способом, аналогичным описанному выше для первого варианта осуществления изобретения, после взятия донорской плазмы и после наполнения контейнера донорской плазмой этот контейнер наклоняют так, чтобы уровень жидкости в этом контейнере был выше коленчатого патрубка 24, соединенного с сегментом входной трубки 57. Плазма поступает в этот сегмент трубки и проходит через последовательно соединенные Y-элементы, входя в каждый из этих Y-элементов через его боковой патрубок 56 и попадая в следующий Y-элемент из выходного отверстия 54 предыдущего Y-элемента. Плазма течет до тех пор, пока не будет заполнен тест-контейнер 28. После заполнения тест-контейнера донорская плазма продолжает поступать до тех пор, пока не будут также заполнены последовательно соединенные друг с другом Y-элементы, составляющие сегмент трубки 50.

После поступления проб донорской плазмы в сегмент трубки 50 этот сегмент трубки у выходного конца герметично закрывают путем запаивания или термосварки с образованием перемычки 40а или другим подходящим способом герметизации, таким как ультразвуковая сварка, на соответствующем участке, расположенном возле соединения сегмента выходной трубки с тест-контейнером 28.

Заполненную часть сегмента трубки 50 отделяют от тест-контейнера путем отрезания сегмента выходной трубки 59 от тест-контейнера по центру перемычки 40а. Альтернативно, если на конце сегмента трубки 50 находится соединитель люэровского типа, то сегмент трубки 50 отделяют от тест-контейнера 28 путем отсоединения люэровского соединителя. Вторую паяную перемычку 38а создают на начальном входном сегменте трубки 57 на участке возле соединения этого начального сегмента с контейнером для донорского материала 20. Заполненную часть сегмента трубки 50 отделяют от контейнера с донорской плазмой путем отрезания сегмента начальной входной трубки 57 по центру перемычки 38а или путем отсоединения патрубка люэровского типа 58, если он присутствует. Таким образом получают длинную полую состоящую из отдельных звеньев трубку, запаянную с обоих концов и содержащую множество Y-элементов, последовательно соединенных друг с другом. Каждый из таких соединенных вместе Y-элементов содержит аликвоту донорской крови или плазмы.

Как будет более подробно описано ниже, эти сегменты трубок, соединяющие выходное отверстие предшествующего Y-элемента с боковым патрубком последующего Y-элемента, также имеют паяные перемычки 42а, которые образуют отдельные последовательно соединенные друг с другом аликвоты проб, каждая из которых составляет отдельный Y-элемент. Каждый такой Y-элемент содержит конкретное количество крови или плазмы, необходимое для формирования пула конкретной генерации. Запаивание для отделения каждого Y-элемента может быть осуществлено либо после того, как этот сегмент трубки 50 был отделен от контейнера с донорской плазмой, либо оно может быть осуществлено в то время, когда сегмент трубки еще присоединен к этому контейнеру.

Предпочтительно, запаивание для изоляции Y-элементов осуществляют в то время, когда сегмент трубки 50 еще присоединен к контейнеру с донорской плазмой так, чтобы снижение объема, вызываемое сплющиванием части трубки в процессе запаивания, не приводило к созданию внутреннего гидростатического давления пробы. Если сегмент трубки 50 остается соединенным с контейнером с донорской плазмой, то избыточная жидкость, образующаяся при снижении объема в трубке, вызываемом термосваркой, будет поступать обратно в контейнер с донорской плазмой. Избыточное гидростатическое давление, которое может вызвать опасный выброс струей во время взятия пробы, снижает тем самым безопасность устройства.

Запаивание может быть осуществлено любым известным методом, таким как термокомпрессионная сварка (термосварка), ультразвуковая сварка или т.п., при условии, что длина сплющенного и сварного участка является достаточной для того, чтобы соединенные друг с другом Y-элементы могли быть отделены друг от друга путем разрезания по центру этой сварной перемычки без повреждения целостности сегмента трубки с любой стороны перемычки.

На фиг. 3а и 3b в предпочтительном варианте настоящего изобретения сварная перемычка между пакетами 42 (фиг.2) и/или Y-элементами 51 (фиг.2а) представляет собой область сварной подушки 46, включающую узкую центральную часть 47, по которой разрезают или разрывают эту сварную подушку для отделения соединенных друг с другом пакетов. Такие разрезы по центральной части делают для гарантии того, чтобы каждый отделенный пакет после его отделения оставался запаянным у плоской части уплотненной перемычки 48 с обоих концов. Длина сварной подушки может быть больше или меньше, в зависимости от выбранного способа отделения. Отделение может быть проведено с использованием скальпеля, гильотинного ножа или простых ножниц.

На фиг.4 проиллюстрирован вариант устройства для запаивания 60, которое может быть использовано для получения пакетов конкретных нужных размеров и которое включает в себя средство для облегчения отделения пакетов и идентификацию их порядкового номера вдоль сегмента. Устройство для запаивания 60 содержит расположенные напротив друг друга первую и вторую плиты 61 и 62, соответственно каждая из которых содержит множество выступающих частей головок для сварки 63, расположенных на определенном расстоянии друг от друга на противоположных поверхностях плиты. Это устройство для сварки 60 предпочтительно сконструировано так, что выступающие части головок для сварки 63 двигаются вдоль их соответствующих плит, для того, чтобы расстояние от одной выступающей части головки до другой выступающей части головки могло варьироваться. Эти выступающие сварочные головки 63 могут располагаться вдоль плиты так, чтобы расстояние между двумя следующими друг за другом сварочными головками пропорционально снижалось для того, чтобы можно было осуществлять спайку вдоль длины сегмента трубки с монотонно уменьшающимися интервалами. Таким образом, пакеты с пробами, имеющими монотонно уменьшающийся размер, и тем самым с содержимым, имеющим монотонно уменьшающийся объем, могут быть созданы путем перемещения пары расположенных друг против друга сварочных головок вдоль их соответствующих плит до достижения нужного положения.

Для создания множества сварных перемычек вдоль длины сегмента пластиковой трубки, наполненной пробами крови или плазмы, этот сегмент трубки помещают в устройство для сварки 60 между верхней 61 и нижней 62 плитами для сварки соответственно. Эти находящиеся напротив друг друга плиты приводят в непосредственную близость друг к другу, в результате чего сегменты трубки сплющиваются и спаиваются.

Как показано на фиг.4, множество расположенных на определенном расстоянии друг от друга протяженных или выступающих частей головок 63, находящихся вдоль длины каждой плиты, чередуются с углублениями 64. Поскольку расположенные напротив друг друга плиты движутся вместе, образуя сварные перемычки на этих участках сегмента пластиковой трубки, наполненных пробами крови или плазмы и спрессованных между выступающими частями сварочных головок 63, то между расположенными напротив друг друга углублениями 64 образуются камеры. Эти камеры нужны для того, чтобы соответствующие участки сегмента трубки не спрессовывались, а, напротив, образовывали пакеты. Каждая камера, ограниченная такой парой углублений, формирует секцию в виде пакета.

Нагреватель 65 предназначен для нагревания каждой из выступающих частей сварочной головки плиты так, чтобы эти расположенные напротив друг друга выступающие части образовывали сварные перемычки на сегменте трубки при ее помещении в устройство для сварки. Нагревателем 65 может быть нагреватель любого типа, известного специалистам, таким как радиационные нагреватели, индукционные или резистивные нагреватели или т.п.

Нагреватель 65 предпочтительно непосредственно соединен с каждой из выступающих головок 63 для нагревания этих выступающих частей без нежелательного нагревания углублений. Если необходимо, то для снижения теплопереноса между выступающими частями и углублениями может быть обеспечена изоляция. В характерном варианте осуществления изобретения к устройству для сварки 60 может быть также подсоединено охлаждающее устройство 66, такое как устройство с охлаждающим или радиаторным ребрами, поток движущегося воздуха или палец холодильника. Охлаждающее устройство подсоединено непосредственно к каждому из углублений 64 так, чтобы камеры, образующиеся при совместном перемещении двух расположенных напротив друг друга углублений, поддерживались при низкой температуре. Таким образом, пробы крови или плазмы, содержащиеся в пакетах, образованных этими камерами в процессе сварки, не будут повреждены из-за высокой температуры термосварки.

Узкие участки 47 на фиг.3b, находящиеся приблизительно в центре перемычки, образованы структурой типа протяженного гребня 67, снижающегося по направлению к центру протяженной части головки 64 сварочных плит. При сдавливании сегмента трубки между верхними и нижними сварочными головками гребень 67 образует углубление на верхней и нижней поверхностях сварного участка. Углубления уменьшают толщину пластикового материала, образуя центр сварной перемычки, что способствует легкому отделению этого материала.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гребень 67 может быть зазубрен для осуществления перфораций, расположенных в направлении, перпендикулярном главной оси сегментов трубки. Эти перфорации позволяют создавать отдельные и соединенные друг с другом пакеты, которые могут быть отделены друг от друга без риска их разрезания острым предметом с нарушением целостности пакета вследствие неосторожного разрезания на участке, содержащем пробу. Перфорации предпочтительно создавать в процессе сварки посредством сварочных головок с зазубринами. Альтернативно перфорации могут быть сделаны сразу после сварки с использованием зажимного приспособления или чеканочного штампа.

Устройство для сварки 60 может быть также снабжено приспособлением 68 для размыкания и замыкания сварочных плит друг с другом и образования тем самым сварных перемычек вдоль длины сегмента трубки. Такие приспособления хорошо известны специалистам и могут включать в себя неавтоматическое устройство для размыкания и замыкания, такое как рукоятка рычага, которая соединена с одной опорной рамой и которая перемещается по этой раме, например, с помощью шарнира. Другим подходящим приспособлением могут служить вертикальные направляющие устройства, пружины или гидравлические поршневые прессы, или другие общеизвестные механические, электрические или гидравлические прессы.

На фиг.4а представлено полусхематическое изображение конкретного варианта устройства для сварки 70, используемого для проведения термокомпрессионной сварки через равномерные интервалы в целях формирования пакетов нужных конкретных размеров, или для изолирования связанных друг с другом Y-элементов с получением отдельных аликвот, содержащих пробы.

Устройство для сварки 70 обычно содержит верхнюю и нижнюю плиты 71 и 72, соответственно приспособленные для монтирования их вместе с рычагом пресса и уплотнительной шиной соответственно в коммерчески доступном устройстве для импульсной сварки, таком как один из аппаратов импульсной сварки ALINE серии М, изготавливаемых и поставляемых компанией ALINE Santa Fe Springs, California.

Конкретный вариант этого устройства, изображенного на фиг.4а, содержит состоящую из двух частей головку для термосварки, подсоединенную к аппарату для импульсной сварки ALINE MC-15 с промышленной модификацией, и позволяет с помощью МС-15 получать предварительно заполненные плазмой пакеты для их последующей обработки в соответствии с системой и способом настоящего изобретения.

Нижняя плита 72 устройства с головкой 70 для термосварки сконструирована из подходящего жесткого термоустойчивого материала, такого как ламинат Kelvar^®, изготавливаемый и поставляемый корпорацией DuPont Corporation. В проиллюстрированном варианте нижняя плита 72 имеет длину предпочтительно около 15 дюймов так, чтобы она могла быть смонтирована на монтажной поверхности устройства для импульсной термосварки МС-15. Нижняя плита 72 имеет продольную канавку 73, которая расположена по центру и проходит по всей длине нижней плиты 72. Ширина этой продольной канавки 73 составляет приблизительно 0,2 дюйма, что соответствует ширине стандартной медицинской трубки, которая обычно имеет внешний диаметр приблизительно 0,1875 (3/16) дюймов и которая гнездообразно располагается вдоль этой канавки.

Вдоль длины нижней плиты 72 имеется множество расположенных на определенном расстоянии друг от друга поперечных канавок 74, которые расположены в направлении, перпендикулярном по отношению к центральной канавке 73. Эти поперечные канавки 74 имеют ширину приблизительно 0,5 дюймов и расположены друг относительно друга на расстоянии 1,125 (1-1/8) дюймов, считая от их центров. Поэтому каждая поперечная канавка отделена от соседней канавки остальным блоком плиты, пересеченным центральной продольной канавкой 73, которая имеет ширину около 0,625 (5/8) дюймов.

Как продольная канавка, так и поперечные канавки 73 и 74 соответственно, пересекаются лишь частично материалом нижней плиты 72, образуя тем самым в основном плоское основание 75, которое формирует нижнюю поверхность продольных и поперечных канавок. Если это устройство используется для создания сварных перемычек длиной 0,1875 (3/16) дюймов, то стандартную медицинскую трубку помещают в положение вдоль продольной канавки 73 и закрепляют на основании 75 нижней плиты, которая служит в качестве несущей поверхности в процессе термосварки.

Нагревательный элемент 76, такой как никелево-хромовая проволока высокого сопротивления (NiCr), проходит подобно змеевику от канавки к канавке и расположен продольно вдоль каждой поперечной канавки, имеющейся на нижней плите, примерно по центру канавки. Когда нагревательный элемент 76 пересекает центр поперечных канавок 74, то NiCr-проволока защищена от контакта с термочувствительной пластиковой трубкой благодаря покрытию этой проволоки куском, например, тефлоновой ленты. Таким образом, пробы крови, содержащиеся в пакетах, созданных с помощью сварочного устройства в процессе сварки, не подвергаются разрушению под действием высоких температур при термосварке.

Верхняя плита 71 также имеет длину 15 дюймов и подвешивается над нижней плитой 72 с помощью сдавливающего рычага сварочного аппарата МС-15. Верхняя плита 71 сконструирована из термоустойчивого пластикового материала, такого как Lexan^® или измельченный Kelvar^®, и содержит серию расположенных на одинаковом расстоянии друг от друга обычно прямоугольных зубцов, выступающих от нижней поверхности этой плиты и простирающихся в направлении нижней плиты. Зубец 77 имеет длину около 0,5 дюймов и расположен от другого зубца на расстоянии 1,125 (1-1/8) дюймов, считая от их центров. В соответствии с этим можно видеть, что каждый из зубцов 77 имеет такие размеры, которые соответствуют полостям, образованным поперечными канавками 74 нижней плиты 72. Каждый из зубцов 77 верхней плиты 71 расположен так, что он находится над соответствующей линией пересечения поперечной канавки 74 и продольной канавки 73 нижней плиты 72. Таким образом, каждый зубец 77 имеет такую конфигурацию, что он плотно входит в полость, определенную выше, когда плиты для термосварки смыкаются вместе на соответствующей стадии работы устройства МС-15.

После помещения гибкого сегмента трубки в продольную канавку 73 верхнюю плиту 71 приводят в контакт с нижней плитой 72 путем опускания крышки сварочного аппарата МС-15. По мере опускания этой крышки зубец 77 верхней плиты 71 входит в полость, образованную поперечными канавками 74 нижней плиты 72, и контактирует с частью сегмента трубки, который находится на основании 75 в месте пересечения каждой поперечной канавки 74 с центральной продольной канавкой 73.

Через никелево-хромовую нагревательную проволоку высокого сопротивления пропускают ток, который вызывает плавление пластикового материала сегмента трубки. В то же самое время верхнюю плиту 71 смыкают с нижней плитой, прилагая тем самым давление к пластиковому материалу, размягченному под действием нагревательного элемента 76.

После сварки сегмент трубки помечают по крайней мере на одном конце уникальным идентификатором, который соответствует плазме от отдельного донора. Это может быть достигнуто, например, путем наклеивания метки на данный сегмент или путем впечатывания эмблемы штрихового кода непосредственно в материал трубки. Устройство для термосварки 70 снабжено полостью 78, которая позволяет поддерживать и центрировать предварительно впечатываемую идентифицирующую метку штрихового кода. Такую метку формируют из подходящего термоплавкого материала и припаивают в целях идентификации к сегменту трубки возле первой сварной перемычки. После этого сегмент трубки, включающий пакеты, содержащие пробы, замораживают для последующего хранения.

Возвращаясь к фиг. 2. важно отметить, что все различные части системы, которые содержат плазму от отдельных доноров, могут быть однозначно идентифицированы. Таким образом, идентификаторы, такие как коды типа ресок, точечные коды, штриховые коды или другая структура, кодированная уникальным идентификатором, могут быть помещены в физическую структуру системы для сбора плазмы. Так, например, в одном из вариантов осуществления изобретения код в виде ресок 37 формируют в контейнере 20 для донорского материала. Коды в виде ресок 39 формируют по краю крышки сосуда 22, коды в виде ресок 41 формируют вдоль боковой стороны тест-контейнера 28, и коды в виде ресок 43 формируют в сегментах трубки через соответствующие интервалы. Уникальный идентификатор в сегменте трубки проходит по всей длине сегментов трубки, и этот код повторяется, что позволяет тем самым при разделении трубки на сегменты, обеспечить единую идентификацию для каждого полученного таким образом сегмента. Кроме того, каждая часть системы для взятия донорского материала идентифицируется тем же самым кодом так, чтобы идентичность донорского материала сохранялась для всех частей системы.

Возвращаясь снова к фиг.2а, 3b и 4, следует отметить, что может также оказаться желательным, чтобы каждый отдельный пакет, имеющийся на данном сегменте трубки, был идентифицирован буквенным или цифровым кодом, соответствующим положению этого пакета вдоль длины исходного сегмента трубки. Такой код может быть впечатан, например, на спрессованной части сварной подушки, расположенной между соседними пакетами, с использованием штампа для тиснения. Такой штамп для тиснения может составлять интегральную часть устройства для сварки, изображенного на фиг.4 и 4а, так, чтобы сварка, формирование пакетов различных размеров и образование сплющенных или перфорированных участков для легкого разрезания, а также идентификация номеров были осуществлены в одну единственную эффективную стадию. Альтернативно, буквенный или цифровой идентификатор может составлять часть зажимного приспособления или штампа. Штампы для тиснения являются известными устройствами, которые представляют собой приспособления для перемещения буквенного или цифрового знака от одного пакета к следующему пакету, так, чтобы каждый из последующих пакетов, находящихся на сегменте трубки, был идентифицирован соответствующей последовательностью символов, имеющих буквенные (а, b, с,... ) или цифровые (1, 2, 3,...) обозначения.

Поэтому, если первый пул для анализа был получен из пакетов от разных доноров, то контрольная проверка на качество может быть осуществлена путем подтверждения того факта, что все пакеты, которые содержат объединенный пул от каждого сегмента трубок, имеют тот же самый код положения, например, номер 1. Аналогичным образом, при получении второго пула для тестирования проб, взятых от тех же самых доноров, контрольная проверка на качество может быть осуществлена путем подтверждения того, что все пакеты, которые содержат объединенный пул от каждого сегмента трубки, имеют, например, номер 2, впечатанный в определенном месте спрессованной части пакета.

Для осуществления эффективного PCR-анализа донорского материала пробу для серологического теста, взятую от каждого отдельного донора, анализируют в тест-контейнере на различные известные антигены и/или антитела, которые направлены против конкретных вирусов. Если в данном тесте проба является положительной на один или несколько известных антигенов или антител, то этот донорский материал и соответствующий ему сегмент трубки исключается из последующего тестирования, и они могут быть ликвидированы соответствующим образом.

Сегменты трубки, соответствующие остальным сероотрицательным донорским пробам, разделяют на отдельные идентифицированные группы, каждая из которых включает материал от выбранного числа доноров. Как будет описано ниже, число доноров на группу определяется чувствительностью данных специфических высокочувствительных тестов, таких как PCR-тест, ожидаемой концентрацией исследуемой вирусной РНК или ДНК в данном образце плазмы и ожидаемой частотой встречаемости PCR-положительной пробы у всей группы доноров. Так, например, для обнаружения вируса гепатита С, содержащего исследуемую РНК у определенного количества доноров с рецидивирующим плазмаферезом, необходимо брать пробы у 100-700 отдельных доноров. В случае группы лиц, у которых чаще всего наблюдается инфицирование вирусом, может оказаться предпочтительным собирать более мелкие пулы от 50-100 доноров.

Один из вариантов способа получения пула для PCR-теста в соответствии с настоящим изобретением будет описан ниже со ссылками на фиг.5 и 6. Планшет для сбора проб 80, в основном, аналогичен обычному планшету для титрования, за исключением того, что он имеет конфигурацию, адаптированную для целей настоящего изобретения. Планшет для сбора проб сконструирован так, что он содержит, в основном, полуцилиндрические лунки для проб 81, расположенные горизонтально на планшете, в основном, в виде регулярной матрицы. Планшет для проб, подходящий для использования в способе настоящего изобретения, имеет 64 таких лунки, расположенные 8х8 рядах/столбцах в виде прямоугольной матрицы. Этот планшет снабжен также стыковым планшетом-крышкой 82, имеющим примерно такие же внешние размеры, что и планшет для проб 80.

Планшет-крышка 82 сконструирован так, что он плотно покрывает планшет для проб 80. В этом планшете-крышке имеются сквозные отверстия 83, которые образуют такую же матрицу, как и лунки на планшете для проб 80. Когда планшет-крышка 82 покрывает поверхность планшета для проб 80, то сквозные отверстия 83 располагаются строго вертикально над лунками с пробами 81, и благодаря этим сквозным отверстиям обеспечивается доступ к этим лунками для проб. Диаметр сквозных отверстий, в основном, меньше, чем площадь поверхности пакетов с тестируемыми пробами и площадь поверхности соответствующих лунок для проб. Однако диаметр сквозного отверстия является достаточно большим, чтобы через эти отверстия можно было пропускать иглу или другой предмет подобно канюли и вводить их в нижерасположенные лунки.

Как показано на фиг.6, концевой пакет (первой генерации, "номер 1") 84 удаляют из каждого сегмента трубки, который был идентифицирован как принадлежащий конкретной тестируемой PCR-группе. Каждый концевой пакет 84 промывают, но не вскрывают и помещают в соответствующую лунку 81 для проб планшета 80. Планшет-крышку 82 помещают поверх верхней части планшета для проб 80, и этот планшет с пробами, крышку и пакеты размораживают при соответствующей температуре.

Из каждого пакета удаляют одинаковый объем, от около 0,02 до 0,5 мл плазмы, и объединяют в тест-контейнере. Иглу 85 или другое приспособление, подобное канюле, вводят через сквозное отверстие, имеющееся в планшете-крышке, в лунку с пробой планшета для проб, находящуюся непосредственно ниже сквозного отверстия, и таким образом прокалывают боковую стенку пакета из материала трубки, в результате чего получают доступ к пробе плазмы. В типичном варианте осуществления настоящего изобретения эта игла соединена с устройством так, что обеспечивается непрерывный вакуум или отсос для удаления всей крови или плазмы, содержащейся в пакете, и тем самым минимизируется любая утечка жидкости в окружающий поддон. Эта игла может удерживаться специальным приспособлением, которое позволяет этой игле проходить через сквозное отверстие и верхнюю стенку пакета, но которое ограничивает поступательное движение этой иглы далее вниз во избежание соприкосновения этой иглы с нижней стенкой пакета или ее прокалывания, пока этот пакет находится в лунке для проб. При извлечении канюли после взятия пробы материал планшета-крышки 86, окружающий сквозное отверстие, предохраняет от случайного извлечения пакета вместе с канюлей, как показано на фиг.6.

Хотя способ получения пула для PCR-теста описан на примере извлечения пробы вручную путем введения канюли отдельно в каждую лунку с пробой, однако, этот способ может быть также осуществлен с использованием автоматизированного процесса. Планшет для проб, содержащий пакеты в каждой лунке, может содержать массив канюль, расположенных в соответствии со сквозными отверстиями в планшете-крышке так, что все они могут быть сразу введены в планшет для проб, что позволяет прокалывать все пакеты и брать из них пробы одновременно. Альтернативно, одна канюля или устройство, несущее эту канюлю, может быть автоматизировано или запрограммировано так, что оно будет последовательно прокалывать и извлекать жидкость из каждого пакета. В целях предупреждения распространения инфекции для извлечения проб каждого пула используют чистую канюлю.

Кроме того, для каждого специалиста очевидно, что комбинация планшета с пробами, лунок с пробами, сквозных отверстий и канюль, описанных в связи со взятием жидкости из пакета с пробой, может быть с успехом использована для извлечения жидкой пробы из содержащих эти пробы контейнеров типа Y-элементов, проиллюстрированных на фиг.2а. Конфигурация лунок для проб, показанная на фиг.5 и 6, определяется формой жидкостьсодержащего контейнера, и для адаптации их конфигурации для Y-элементов требуются лишь небольшие модификации. Так, например, лунки для проб могут представлять собой вертикально расположенный протяженный цилиндр, в который вводят каждый Y-элемент. В любом соответствующем месте примерно в верхней периферийной части каждой лунки для пробы может быть сделан паз, служащий в качестве фиксатора, в который может быть помещен боковой патрубок Y-элемента. Этот паз должен также служить для ориентации каждого Y-элемента и обеспечивать дополнительную надежную фиксацию его положения. Аналогично описанию для фиг.5 и 6 жидкость может быть извлечена из каждого Y-элемента путем введения канюли через каждое входное отверстие Y-элемента, дающее доступ к пробе. Когда канюлю удаляют из входного отверстия, то материал, из которого изготовлен планшет-крышка и который окружает каждое сквозное отверстие, действует как ограничитель и предотвращает извлечение Y-элемента из лунки для проб.

Кроме того, для каждого специалиста очевидно, что эта конфигурация является подходящей для осуществления настоящего изобретения с использованием автоматического процесса. Массив канюль может быть смонтирован так, чтобы их расположение соответствовало расположению сквозных отверстий в планшете-крышке, что позволило бы прокалывать все Y-элементы и брать из них пробы одновременно. Альтернативно, одна канюля или устройство, несущее эту канюлю, может быть автоматизировано или запрограммировано так, чтобы она последовательно проходила через каждое входное отверстие и извлекала жидкость из каждого Y-элемента.

Ниже, со ссылками на фиг.7, 8, 9а, 9b и 10, будет описан дополнительный вариант устройства и способа, подходящих для получения пула для PCR-теста в соответствии с настоящим изобретением. На фиг.7 пул донорской плазмы, содержащий жидкость от множества проб плазмы, получают из ряда пакетов с пробами донорской плазмы в электрическом гидравлическом прессе 90. Гидравлический пресс 90 содержит дробильный цилиндр 91, в который помещают пакеты с пробами, и гидравлический плунжер 92, который разрушает эти пакеты с пробами. Пробы, содержащиеся в этих пакетах, извлекают из дробильного цилиндра 91 с помощью подходящего сжатого газа, такого как сжатый воздух или азот, и собирают в контейнер-сборник в виде пула.

Сначала сформированный пакет (например, пакет 1) удаляют из каждого сегмента трубок, который был идентифицирован как принадлежащий к конкретной тестируемой PCR-группе. Каждый сформированный пакет промывают, но не вскрывают, и помещают в дробильный цилиндр 91 пресса 90. Загрузку дробильного цилиндра осуществляют под биологически безопасным колпаком класса II и с использованием канала для подачи воздуха в целях обеспечения защиты пакета от случайного попадания инфекции из окружающего пространства при нарушении структурной целостности этого пакета. Способом, который более детально описан ниже, дробильный плунжер 92 плотно вставляют в открытую горловину 91а дробильного цилиндра 91 так, чтобы обеспечивалось сохранение содержимого дробильного цилиндра 91 и чтобы конструкция, состоящая из цилиндра 91 и плунжера 92, полностью заключала в себе пакеты с пробами. Способ, в котором дробильный плунжер 92 соединен с дробильным цилиндром 91, разработан так, чтобы он гарантировал защиту окружающего пространства вокруг цилиндра 91 от инфицирования любыми вредными вирусами, которые могут присутствовать в любой пробе, содержащейся в пакетах с пробами.

Затем дробильный цилиндр 91 устанавливают на цилиндрическую опору 93, которая фиксирует этот цилиндр в правильном положении на гидравлическом прессе 90, после чего шток 94 гидравлического плунжера правильно соединяют с гидравлическим цилиндром 95 для совмещения и соединения с дробильным плунжером 92. Как будет более детально описано ниже, дробильный плунжер 92 свободно соединен с гидравлическим штоком 94 так, чтобы плунжер 92 поднимался и опускался при работе гидравлического цилиндра 95.

После правильной установки цилиндра 91 и плунжера 92 на цилиндрической опоре 93 и соединения с гидравлическим цилиндром 95 посредством штока 94 регулирующий клапан действует так, что он приводит в движение гидравлический цилиндр, который воздействует на шток 94 и плунжер 92, который, в свою очередь, разрушает пакеты с образцами, находящимися в дробильном цилиндре 91. Гидравлический цилиндр 95 работает от электрического мотора АС 97 на 240 В мощностью в четыре лошадиные силы, который приводит в движение гидравлический возвратно-поступательный насос 98, соединенный с резервуаром для жидкости 99 и нагнетающий гидравлическую жидкость, способствуя тем самым работе цилиндра 95 Сила, обеспечивающая точечную нагрузку у гидравлического штока 94, составляет 4000 фунтов (1800 кг), в результате чего давление плунжера 92 на пакеты с пробами составляет от около 800 до 900 фунт/дюйм² (от 56,25 до 63,28 кг/см²).

После разрушения пакетов с пробами эти пробы донорской жидкости, содержащиеся в этих пакетах, извлекаются из дробильного цилиндра 91 с помощью сжатого газа, образуемого, например, пневматическим цилиндром компрессора 100, который соединен посредством регулятора давления 101 с захлопывающимся клапаном 102, которым снабжен дробильный плунжер 92. Для правильной работы захлопывающегося клапана 102 плунжер 92 сначала слегка приподнимают из его положения в режиме полного дробления. Сжатый воздух подают в цилиндр 91 через регулятор давления 101 до тех пор, пока не будет достигнуто пороговое давление отключающего клапана. Затем клапан 102 открывается, впуская сжатый воздух для создания давления внутри цилиндра, который извлекает пул плазмы из дробильного цилиндра 91 через собирающее отверстие 103, имеющееся в нижней части цилиндра. Затем пул плазмы собирают в контейнер для сбора пула, подсоединенный к собирающему отверстию 103 с помощью выводящей линии или трубки путем вытеснения жидкости из цилиндра посредством сжатого воздуха. Этот сжатый воздух, после прохождения через ловушку для хлорной извести, выпускается в колпак для биологической защиты класса II.

На фиг. 8 представлен частично усеченный вид поперечного сечения дробильного цилиндра 91, сконструированного в соответствии с настоящим изобретением. Этот дробильный цилиндр 91, обычно и предпочтительно, содержит круглую опорную плиту 105, имеющую верхнюю и нижнюю поверхности и кольцеобразный фланец 106, простирающийся по направлению вверх от верхней поверхности с нанесенной резьбой на его внутренней стороне. Цилиндрическая стенка цилиндра 107, открытая с обоих концов, имеет резьбу на внешней поверхности ее нижнего конца. На внутренней поверхности нижнего конца цилиндрической стенки 107 имеется прорезь или канавка 108, так, что она ограничивает кольцевую кромку 109, которая расположена параллельно верхней поверхности опорной плиты 105 и представляет противоположную по отношению к ней поверхность. Когда цилиндрическую стенку 107 ввинчивают в опорную плиту 105, то сортировочную плиту 110, располагающуюся на поверхности опорной плиты 105, закрепляют посредством кольцеобразной кромки 109 цилиндрической стенки 107 и зажимают между этой кольцеобразной кромкой 109 и верхней поверхностью опорной плиты.

На фиг.9а и 9b сортировочная плита 110 обычно представляет собой кольцевую дискообразную плиту, на которой находятся пакеты, содержащие пробы и подвергающиеся разрушению под действием дробильного плунжера 92. Как показано на фиг.9b, сортировочная плита 110 имеет канавки для отвода жидкости, содержащие радиальные желобки 111 и концентрические круговые желобки 112, все из которых имеют ширину приблизительно 1/32 дюйма и которые вырезаны в верхней поверхности сортировочной плиты. Радиальные желобки 111 вырезаны под углом, который наклонен по отношению к центру сортировочной плиты 110, где они заканчиваются в аксиально расположенном сливном отверстии или дренажном поддоне, в который жидкость отводится через 1/4-дюймовую дренажную трубку (более наглядно показано на фиг.8), присоединенную к отверстию, просверленному через опорную плиту 105.

Возвращаясь к фиг. 8, следует указать, что изоляция между стенкой цилиндра 107 и сортировочной плитой 110 обеспечивается путем введения и сжатия уплотнительного кольца 115, находящегося в изолирующей канавке 116, вырезанной для этих целей в опорной плите 105. Эта герметизирующая канавка 116 расположена на опорной плите так, что уплотнительное кольцо 115 лежит ниже вертикальной линии пересечения сортировочной плиты 110 и стенки цилиндра 107. В опорной плите 105 вырезана ступень 117, а в сортировочной плите вырезан стыкующий паз 118 так, что позитивный фиксатор способен точно локализовать сортировочную плиту на опорной плите для правильного совмещения с уплотнительным концом так, чтобы стенка цилиндра 107 была правильно установлена на сортировочной плите и линия их пересечения была правильно совмещена с уплотнительным кольцом 115.

На фиг.10 представлен частично усеченный вид поперечного сечения дробильного плунжера 92, соответствующего целям настоящего изобретения. Этот дробильный плунжер обычно содержит днище цилиндрического плунжера 120, имеющее выступающую из него аксиально расположенную по центру манжету 121, которая имеет, в основном, цилиндрические стенки и один открытый конец для введения втулки 123, принимающей, в основном, цилиндрический шток гидравлического цилиндра 94.

По окружности вокруг цилиндрической манжеты 121 расположен концевой фланец 122, который окружает входной патрубок манжеты. Внешняя поверхность фланца является конусообразной, такой, что эта конусообразная поверхность увеличивается в диаметре по направлению к монолитной основе днища плунжера 120. Когда гидравлический шток 94 входит во втулку 123, то пара фиксирующих пружинных зажимов 124 продвигаются по конусообразной поверхности кольцевого фланца 122 до тех пор, пока они не достигнут соответствующего положения и не захватят нижнюю поверхность кольцевого фланца.

Для обеспечения сцепления с втулкой 123 каждый фиксирующий зажим 124 содержит скошенный зубец 125, который ползет вдоль конусообразной поверхности кольцевого фиксирующего фланца 122 днища плунжера раздвигая тем самым захватывающие кулачки пружинных фиксирующих зажимов 124. По мере продвижения гидравлического штока 94 скошенный зубец 125 пружинных зажимов 124 в конечном счете продвигается за конусообразную поверхность кольцевого захватывающего фланца 122. Пружинная нагрузка захватывающих зажимов оказывает давление на скошенный зубец и входит в контакт с внешней поверхностью боковой стенки манжеты. Зубец захватывающих зажимов 124 таким образом входит в сцепление с нижней поверхностью зажимного кольца 122, захватывая тем самым дробильный плунжер 92 и обеспечивая движение плунжера в обоих направлениях.

Кроме того, для каждого специалиста очевидно, что пружинные фиксирующие зажимы 124 могут быть легко отцеплены от захватывающего кольца 122 путем простого сжатия вместе концов зажимов напротив скошенного захватывающего зубца 125. В соответствии с этим, очевидно, что днище плунжера 120, цилиндрическая аксиально расположенная манжета 121, фиксирующее кольцо 122 и фиксирующие зажимы 124, в комбинации друг с другом, обеспечивают быстрое и легкое отцепление гидравлического штока 94 от дробильного плунжера 92. Эта способность быстрого отцепления позволяет легко удалить комбинацию плунжера 92 и цилиндра 91 из гнезда цилиндра 93 гидравлического пресса 110 для очистки, стерилизации, повторной загрузки дополнительных пакетов с пробами, и т.п.

Как показано на фиг.10, дробильный плунжер 92, кроме того, содержит несколько уплотнительных колец 126, расположенных в герметизирующих канавках 178, находящихся на периферии днища плунжера 120. Уплотнительное кольцо присутствует для обеспечения герметичного уплотнения между внешней кольцевой поверхностью днища плунжера 120 и внутренней кольцевой поверхностью цилиндрической стенки 107 дробильного цилиндра 91. Использование множества уплотнительных колец является мерой для обеспечения безопасности и надежности, принимаемой в целях гарантии герметизации возможно инфицированных жидких проб, находящихся в пределах цилиндра 91. Хотя на фиг.10, иллюстрирующей вариант осуществления настоящего изобретения, изображены три уплотнительных кольца 126, однако, очевидно, что в соответствии с настоящим изобретением может быть использовано большее или меньшее число уплотнительных колец. Единственное, что требуется в данном случае, так это обеспечение герметизации между дробильным плунжером 92 и дробильным цилиндром 91, для гарантии полной изоляции возможно инфицированной жидкости, находящейся в цилиндре.

Возвращаясь к фиг. 8, следует отметить, что боковая стенка дробильного цилиндра имеет 0,020-дюймовую ступень 130, которая выступает во внутреннюю поверхность боковой стенки. Таким образом, первая часть (приблизительно 1,0 дюймов от верха) боковой цилиндрической стенки 107 сконструирована так, что она имеет внутренний диаметр (ID) приблизительно на 0,040 дюймов больше, чем ID остальной части боковой цилиндрической стенки 107, которая простирается вниз вплоть до сортировочной плиты 110 и основания 105. Граничная поверхность между этой ступенью и остальной частью боковой стенки скошена так, что она имеет относительно гладкий идущий под утлом переход от верхней части с немного большим ID к нижней части с немного меньшим ID.

Ступень на цилиндрической боковой стенке 107 сделана так, чтобы дробильный плунжер 92 мог быть вручную вставлен в открытую горловину дробильного цилиндра 91 путем лишь небольшого контакта между уплотнительным кольцом 126 на Фиг. 10 и ID-поверхностью цилиндра. После установления вручную комбинации плунжера и цилиндра на цилиндрическую основу 93 (фиг.7) гидравлический шток 94 продвигают для стыковки с втулкой 123 плунжера и продолжают продвигать до тех пор, пока фиксирующие зажимы 124 не будут фиксированы на нижней поверхности фиксирующего кольца 122 днища плунжера. Затем гидравлический шток 94 продвигают дальше так, чтобы протолкнуть плунжер дальше в цилиндр, в результате чего уплотнительное кольцо, находящееся ниже ступеньки 130, давит на ID цилиндрической стенки. При проталкивании ниже этой ступеньки уплотнительное кольцо между ID цилиндрической боковой стенки 107 и герметизирующими канавками 127 плунжера полностью сжимается, образуя тем самым плотную герметизацию.

При работе дробильный плунжер 92 создает давление от около 800 до 900 фунт/см² (56,25 - 63,28 кг/см²) (точечная нагрузка на гидравлический стержень составляет 4000 фунтов), которое является достаточным для разрушения пакетов с образцами, содержащимися в цилиндре. Жидкая кровь или плазма течет вдоль желоба для жидкостей, сделанного в сортировочной плите, и попадает в центральный приемный поддон, где она собирается и направляется из выпускного отверстия в контейнер для сбора пула. После процедуры разрушения пакетов гидравлический цилиндр 95 поднимает дробильный плунжер на небольшое расстояние (приблизительно 1/2-1 дюймов) над массой разрушенных пакетов с пробами, создавая тем самым камеру внутри цилиндра. В эту камеру через захлопывающийся клапан 102 в плунжере 92 накачивается сжатый газ, такой как, сжатый воздух. Давление в камере приводит к вытеснению любых оставшихся жидких проб крови или плазмы из цилиндра через выпускное отверстие 103 в контейнер для сбора пула.

После завершения процедуры дробления и сбора пула выводящая труба, соединенная с выпускным отверстием 103, зажимается для предотвращения выхода какой-либо дополнительной жидкости из цилиндра. Эту выводящую трубку помещают в контейнер с хлорной известью и с помощью гидравлического цилиндра 95 снова поднимают плунжер в цилиндре, создавая тем самым небольшой вакуум, который всасывает хлорную известь из контейнера в цилиндр. Стадии дробления и откачивания хлорной извести повторяют, предпочтительно, еще два раза для гарантии того, что любая "выплеснутая обратно" жидкая проба крови или плазмы будет полностью удалена из дробильного цилиндра 91, и того, что эта хлорная известь будет заполнять, по возможности, весь внутренний объем дробильной камеры и тем самым уменьшать риск какого-либо значительного инфицирования вирусом, который может присутствовать внутри этой камеры.

Затем в действие приводятся быстро освобождающие зажимы, и комбинацию плунжер/цилиндр удаляют из гидравлического пресса 90 и подвергают стерилизующей обработке, например, в автоклаве. Перед автоклавированием этот плунжер и цилиндр могут быть химически очищены путем их погружения на 15 минут в 10% раствор хлорной извести с последующим циклом промывки Н₂О, 1% поверхностно-активным веществом ДСН (додецилсульфатом натрия) и снова H₂О. Если времени для стерилизации в автоклаве оказалось недостаточно, то может быть проведена химическая очистка 70% ЕТОН и стерильными H₂О-раствором. Если такая дополнительная очистка необходима, то ее осуществляют под биозащитным колпаком класса II, который осуществляет вытяжку через фильтр НЕРА. Под этим колпаком дробильный цилиндр загружают следующей группой пакетов с пробами, предназначенных для разрушения, и дробильный плунжер вручную вводят в открытый входной патрубок дробильного цилиндра 91 и продивигают его вниз до тех пор, пока уплотнительные кольца этого плунжера не войдут в контакт со скошенной ступенькой, сформированной в боковой стенке цилиндра. Вновь загруженная комбинация цилиндра/плунжера уже легко устанавливается на цилиндрической опоре 93 дробилки 90. Действие цилиндра 95 приводит в движение гидравлический шток 94, который опускается на плунжер 92 так, что быстро высвобождающие зажимы захватывают фиксирующее кольцо на этом поршне. Затем процесс дробления, экстракции и очистки хлорной известью повторяют.

Исходя из вышеприведенного описания, для любого специалиста очевидно, что электрический гидравлический пресс (дробилка) 90 позволяет собирать пробы крови или плазмы из большого числа пакетов с пробами за минимальное количество времени. Число пакетов с пробами, которые могут быть разрушены с использованием указанного аппарата, ограничено, главным образом, масштабностью этого устройства и давлением, которое может быть приложено дробильным поршнем к массе пакетов с пробами, находящимися в цилиндре. Давление в 800 до 900 фунт/см² (56,25 - 63,28 кг/см²), создаваемое гидравлическим прессом в проиллюстрированном варианте настоящего изобретения, является достаточным для полного разрушения пакетов, содержащих 64 пробы, то есть пакетов типа, проиллюстрированного на фиг.2. В соответствии с этим крупномасштабный сбор пулов, содержащих до 512 проб, может быть осуществлен за 8 оперативных циклов с использованием дробилки настоящего изобретения. Это позволяет значительно сократить время получения пула в способе, в котором пакеты с 512 пробами были отдельно взяты с помощью канюли для сбора содержащихся в них проб.

Кроме того, для каждого специалиста очевидно, что из дробильного аппарата, сделанного достаточно большим для создания большего числа пакетов с пробами, помещаемыми в цилиндр, может быть получен один крупномасштабный пул, содержащий до 512 проб или более. Для получения более высокой мощности дробления в целях преодоления более высокого сопротивления увеличенного числа пакетов может быть также увеличен размер плунжера гидравлического пресса. Как упоминалось выше, размер пула может быть ограничен лишь желаемой масштабностью дробилки.

На фиг. 11 показана блок-схема методики проведения PCR-теста настоящего изобретения, которая позволяет однозначно идентифицировать PCR-положительную пробу, взятую от отдельного донора, с использованием минимального числа отдельных тестов.

Эта схема процесса начинается с блока 200, с определения соответствующего первоначального размера пула, который, в свою очередь, зависит от различных факторов, таких как частота встречаемости исследуемого вируса у всей группы доноров, предполагаемая конечная концентрация вирусной ДНК или РНК после разведения в пуле, и т.п.

Хотя PCR-тест является в высокой степени чувствительным и способен обнаруживать один единственный вирус в инфицированной пробе, однако для получения положительного результата этот вирус должен обязательно присутствовать в данной пробе, подвергаемой PCR-тесту. Так, например, если пробу, взятую от инфицированного донора и имеющую относительно низкую концентрацию вируса объединяют вместе с большим числом неинфицированных проб, то концентрация вируса в полученном пуле может быть настолько низка, что, в данном случае имеется статистическая вероятность того, что в пробе, взятой из пула для PCR-тестирования, этот вирус будет отсутствовать. Фактически, такие пулы могут давать ложноотрицательный результат теста на инфицирование вирусом.

Так, например, если из плазмы донора, инфицированного вирусами в концентрации 500 вирусов на один миллилитр пробы, получают 0,02 мл пробы, то эта 0,02 мл-проба будет содержать, в среднем, 10 вирусов. Если эту 0,02 миллилитровую инфицированную вирусом пробу объединить приблизительно с 500 другими 0,02 мл-пробами от неинфицированных доноров, то полученный 10 мл-пул будет содержать вирусы в концентрации 1 вирус на 1 миллилитр. В соответствии с этим, если из пула для PCR-теста взять 1 мл-пробу, то имеется значимая статистическая вероятность того, что эта PCR-проба не будет содержать вирусов.

Такая низкая концентрация инфицирования вирусом представляет небольшую опасность для продуктов, продуцированных из этой плазмы, поскольку существует несколько методов, подходящих для инактивации вируса, присутствующего в донорском материале с такой низкой концентрацией вируса. Эти методы инактивации вируса предусматривают использование растворителя/детергента или нагревание до температуры свыше 60^oС в течение соответствующего периода времени или т.п. Эти описанные методы, в основном, позволяют уменьшить концентрацию вирусов на определенное число "логарифмических единиц". Так, например, метод с использованием растворителя-детергента позволяет снизить уровень инфицирования вирусом гепатита С по крайней мере на 10⁷ на 1 мл или на "7 логарифмических единиц". Таким образом, после получения отрицательных результатов PCR-тестапродукты плазмы, такие как фактор VIII, фактор IX или протромбиновый комплекс, могут быть получены из плазмы доноров, традиционно обработанной, например, методом с использованием растворителя-детергента.

В случае продуктов крови, обычно предназначенных для прямого вливания пациенту после получения отрицательных результатов PCR-теста для этого донорского материала, остается некоторый незначительный риск инфицирования вирусом в низкой концентрации.

В варианте осуществления настоящего изобретения, проиллюстрированном на фиг. 11, приведена оценка обсуждаемых выше факторов, таких как частота встречаемости целевого вируса в группе доноров и предполагаемая концентрация вируса после разведения. Был оценен соответствующий размер пула для PCR-тестирования первого уровня, который минимизирует статистическую вероятность, допускающую присутствие необнаруженного вируса в низкой концентрации. Этот пул получают в стадии, обозначенной блоком 201, путем объединения содержимого концевых пакетов идентифицированных секций трубок способом, описанным выше. Блок 202 указывает на осуществление PCR-теста PCR-пула на первом уровне.

Блок 203 представляет решающий момент в способе настоящего изобретения, который зависит от результатов PCR-теста, осуществленного в блоке 202. В случае получения отрицательного результата теста предполагается, что весь донорский материал, соответствующий пробам, используемым для создания PCR-пула первого уровня, не содержит вирусной инфекции и извлекается для дальнейшей обработки в целях получения фармацевтических препаратов. Таким образом, эта методика завершается получением отрицательного результата PCR-теста.

Если PCR-тест дает положительный результат, то это означает, что вирусная инфекция присутствует в одном или нескольких пробах, из которых был получен исходный PCR-пул первого уровня. В блоке 204 дополнительный пакет с пробой, т.е. пакет, следующий за первым удаленным пакетом, берут из сегментов трубок, которые соответствуют донорскому материалу, составляющему исходный PCR-пул первого уровня. Эти дополнительные пакеты с пробами делят на две приблизительно равные подгруппы, обозначенные для ясности А и В.

Затем эти подгруппы отдельно объединяют с использованием отдельной чистой канюли, с образованием пула для каждой подгруппы способом, описанным выше, и проводят PCR-тест только для пулов одной подгруппы, как показано в блоке 205. Для целей настоящего изобретения не имеет решающего значения, которая из этих двух подгрупп будет протестирована. В блоке 205 подгруппа А идентифицирована как тестируемая подгруппа, но с таким же успехом может быть протестирована подгруппа В без нарушения методики настоящего изобретения.

В блоке 206 решение принимается в зависимости от результатов PCR-теста пула подгруппы А. В случае, если результат PCR-теста пула подгруппы А на наличие вируса является отрицательным, то дальнейшее тестирование проб от доноров, которые составляют подгруппу А, не проводят. Вместо этого, как показано в блоке 207 из сегментов трубок, которые составляют подгруппу В, берут следующие последовательно расположенные пакеты с пробами, которые затем в свою очередь делят на две приблизительно равные подгруппы А' и В'. Каждая подгруппа в этой стадии содержит приблизительно половину от всего числа проб, составляющих непосредственно предшествующую подгруппу. Содержимое пакетов с пробами этой подгруппы снова отдельно объединяют в пул способом, описанным выше. В случае, если PCR-тестируемая подгруппа А дает положительный результат, на что указывает инфицирование вирусом по крайней мере одного компонента донорского материала, то другую не протестированную подгруппу (подгруппу В на фиг.11) подвергают PCR-тестированию, как указано в блоке 208, для подтверждения того, что она не является также PCR-положительной. Теперь подгруппа А становится объектом для последующего разделения на две приблизительно одинаковые подгруппы (подгруппы А' и В'), как показано в блоке 209.

В блоке 210 PCR-тестирование осуществляют только на пулах одной подгруппы, либо А', либо В', как показано в предшествующих стадиях 207 или 209. Затем цикл повторяют и возвращаются к блоку 206, где выбор следующей стадии зависит от результатов PCR-теста, проведенного в блоке 210. И снова, если PCR-тестируемая подгруппа А дает отрицательный результат, то другую не протестированную подгруппу снова разделяют на две приблизительно равные подгруппы, каждая из которых содержит приблизительно половину от всего числа проб, составляющих предыдущую подгруппу. Если протестированная подгруппа дает PCR-положительный результат, то эту протестированную подгруппу снова разделяют на две приблизительно равные подгруппы, каждая из которых содержит приблизительно половину от всего числа проб, составляющих предыдущую подгруппу. В этом случае непротестированная подгруппа будет снова подвергнута PCR-тестированию для подтверждения того, что она не является также PCR-положительной.

Процесс тестирования продолжается повторением цикла, начиная от блока 206 и кончая блоком 210, до тех пор, пока не будет установлено, что тест необходимо завершить. Решение о завершении теста принимается в том случае, когда разделение на две подгруппы приводит к созданию двух подгрупп, каждая из которых содержит лишь один пакет с пробой, соответствующей одному донору. Одну из проб подвергают PCR-тесту в блоке 210, и если этот тест дает отрицательные результаты, то другую пробу идентифицируют как принадлежащую инфицированному вирусом донору плазмы. Если тестируемая проба дает положительный результат, то оставшуюся пробу затем также подвергают PCR-тесту для подтверждения того, что она не является также PCR-положительной.

После завершения всех тестов способ настоящего изобретения заканчивается блоком 211. Исходя из блок-схемы, представленной на фиг.11, должно быть очевидно, что для осуществления методики тестирования настоящего изобретения, в том случае, когда первоначально протестированный пул является положительным, требуется, чтобы на каждом уровне было осуществлено только два PCR-теста: один первоначальный тест для одной из двух подгрупп и один последующий тест для подтверждения того, что соответствующий первоначально не протестированный пул является действительно отрицательным. Если первоначально протестированный пул является отрицательным, то эта методика тестирования требует проведения только одного PCR-теста на каждом уровне тестирования.

Ниже, со ссылкой на фиг.12, описано применение системы и способа настоящего изобретения для тестирования проб с использованием конкретного размера пула для PCR-теста. На фиг.12 концевые пакеты от 512 отдельных доноров формируют в пул для первоначального PCR-тестирования, обозначенного блоком 212. В целях иллюстрации предположим, что только одна из 512 проб была взята от донора, инфицированного исследуемым вирусом. Сегмент трубки, который изображен на фиг. 12 и который содержит 10 отдельных и связанных друг с другом пакетов, представляет собой сегменты трубки, первоначально соединенные друг с другом и отделенные от контейнера с инфицированной донорской плазмой.

Начальный пул из 512 проб подвергали PCR-тесту, и из-за присутствия в нем инфицированной пробы этот тест давал положительный результат на вирус. В стадии 213 два донорских пула, состоящих из 256 проб (256А и 256В), получали из следующих пакетов, взятых от сегментов, которые составляли предыдущий положительный пул. Пул 256В снова подвергали PCR-тесту и, как показано на фиг. 12, этот пул давал отрицательный результат на вирус, что свидетельствовало о том, что проба, взятая от инфицированного донора, содержится в пуле 256А.

В стадии 214 два пула, содержащих пробы от 128 доноров, получали из следующих последовательно расположенных сегментов трубки, которые составили пул 256А. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, пул 256А был разделен на подгруппы без проведения PCR-теста. В стадии 203 пул 128А подвергали PCR-тесту, и поскольку он давал отрицательный результат на вирус, то можно сделать вывод, что проба от инфицированного донора содержится в пуле 128В. Затем пул 128В подразделяли на два пула из 64 донорских проб (64А и 64В) путем отделения следующего пакета от сегментов трубок, пакеты которых составляли пул 128В.

После этого пул 64В подвергали PCR-тесту, и как показано в примере на фиг. 12, этот пул давал положительный результат на вирус. В этом случае PCR-тест проводили на пуле 64А для того, чтобы подтвердить, что этот пул является действительно отрицательным и что в нем отсутствует какая-либо еще дополнительно инфицированная проба, помимо той инфицированной пробы, которая присутствует в пуле 64В. В стадии 216 пул 64В также подразделяют на два пула, состоящие из 32 донорских проб, 32А и 32В, путем отделения следующего пакета от сегментов трубок, использованных для получения предшествующего пула 64В. Пул 32В подвергают PCR-тесту, а затем, получив отрицательный результат, как показано на фиг.12, пул 32А также делят на два пула, содержащих пробы от 16 доноров 16А и 16В. И снова пулы, содержащие пробы от 16 доноров, получают путем отделения следующего пакета от сегментов трубок, из которых был составлен предшествующий положительный пул 32А.

В стадии 217 пул 16В подвергают PCR-тесту, и этот тест дает положительный результат на вирус. Поэтому пул 16А подвергают PCR-тесту для того, чтобы убедиться, что он является отрицательным и что все инфицированные пробы содержатся в пуле 16В.

В стадии 218 пул 16В делят на два пула от 8 доноров 8А и 8В путем отделения следующего пакета от сегментов трубок, из которых был составлен предшествующий положительный пул 16В. Пул 8В подвергают PCR-тесту, как показано на фиг. 12, и этот тест дает отрицательный результат, что указывает на то, что проба от инфицированного донора содержится в пуле 8А. Затем пул 8А делят на два пула от 4 доноров, 4А и 4В, как показано в стадии 219. Пул 4В подвергают PCR-тесту, который дает отрицательный результат, что свидетельствует о том, что проба от инфицированного донора содержится в пуле 4А. Затем в стадии 220 пул 4А делят на два пула 2А и 2В способом, аналогичным описанному выше. После проведения PCR-теста пул 2А дает отрицательный результат на присутствие вируса, что указывает на то, что одна из двух проб, содержащихся в пуле 2В, была взята из сегмента трубки соответствующего инфицированному донору.

В стадии 221 пробы от отдельных доноров были протестированы путем отделения последнего пакета от сегментов трубок, из которых был составлен пул 2В. Последний материал от отдельных доноров подвергали PCR-тесту для того, чтобы идентифицировать конкретную донорскую пробу, которая затем должна быть удалена из хранения и соответствующим образом уничтожена. В остальных 511 донорских пробах вирус отсутствует, и их оставляют для последующей обработки в целях изготовления фармацевтических продуктов.

В вышеописанном примере одна единственная инфицированная донорская проба была идентифицирована из группы, состоящей из 512 таких донорских проб, путем проведения всего лишь 13 отдельных PCR-тестов, включая первичный PCR-тест пула, состоящего из 512 отдельных исходных проб. Способ настоящего изобретения позволяет не проводить PCR-тест конкретного подпула, при условии, что соответствующий протестированный подпул дает отрицательный результат на присутствие вируса. Благодаря возможности пропускать некоторые PCR-тесты способ настоящего изобретения позволяет уменьшить число PCR-тестов, которые должны быть осуществлены для идентификации конкретных положительных донорских проб, без нарушения эффективности методики PCR-тестов. В соответствии со способом настоящего изобретения все положительные донорские пробы будут идентифицированы без обязательного тестирования всех используемых донорских проб.

Исходя из проиллюстрированного варианта фиг.12, очевидно, что одна из последующих более мелких подгрупп может быть подвергнута PCR-тесту и что произвольно выбранное положение положительной пробы может варьироваться. Так, например, если проба от положительного донора присутствует в каждом из первоначально протестированном подпуле, то для однозначной идентификации положительного донора потребуется проведение 18 тестов (один начальный тест, который дает положительный результат, и один дополнительный тест для подтверждения того, что соответствующий подпул является отрицательным).

Аналогичным образом, если каждый первоначально протестированный подпул дает отрицательный результат, то для идентификации положительного донора потребуется проведение 10 тестов. На практике положительные и отрицательные результаты, полученные после тестирования подпулов, имеют тенденцию к равному распределению, то есть для идентификации однозначно положительной донорской пробы, присутствующей в исходном пуле, полученном от 512 доноров, в среднем потребуется проведение 14 тестов.

Поэтому, как видно из вышеприведенного описания, преимущество системы и способа настоящего изобретения, включая получение сегментов трубки, содержащих отдельные и соединенные друг с другом пакеты, каждый из которых содержат пробу донорской плазмы, заключается в получении множества пулов для PCR-тестирования. В отличие от стандартного способа получения пулов, в которых последовательность исходного и последующих пулов формируется исходя из одной пробы, взятой от каждого донора в одно и то же время, способ настоящего изобретения позволяет создавать тест-пул непосредственно перед тестированием. Этот способ формирования пула "как раз в нужное время" позволяет создавать тест-пулы из отдельных пакетов только, когда это необходимо. Возможность инфицирования вирусом исключается, поскольку эти пулы создаются в различные периоды времени и каждый из герметичных пакетов с пробами. Кроме того, эти пакеты с пробами хранятся замороженными, вплоть до их использования для создания тест-пула. Этот способ позволяет избежать проведения многократных циклов замораживания-оттаивания, которые могут оказывать неблагоприятное воздействие на выделение нужной ДНК или РНК и тем самым гарантирует достоверность PCR-теста.

Хотя вышеуказанный способ эффективен для идентификации вирус-положительной донорской пробы и требует минимального числа относительно дорогостоящих PCR-тестов, однако в соответствии с практикой настоящего изобретения могут быть также разработаны и другие методы идентификации положительных проб от отдельных доноров. В частности, один из таких способов позволяет идентифицировать положительные донорские пробы путем осуществления от двух до трех циклов PCR-тестирования, что значительно сокращает время и накладные расходы, необходимые для поиска большого числа доноров.

Так, например, в вышеуказанном способе после идентификации конкретного подпула, содержащего положительную донорскую пробу, специалист может идентифицировать тот донорский материал, из которого был составлен этот конкретный подпул. Затем эти доноры должны быть снова вызваны, и должен быть снова создан дополнительный пакет с пробами из каждого соответствующего сегмента трубки. После этого должны быть получены два подпула последующей генерации, и PCR-тест должен быть повторен. Такой сбор проб, создание пула для этих подгрупп и процесс PCR-тестирования повторяют для все меньших и меньших создаваемых подпулов до тех пор, пока не будет идентифицирован инфицированный вирусом донор.

Однако каждый цикл PCR-тестирования (взятие проб, создание пула для подгрупп и PCR-тестирование) требует большого количества времени. Так, например, очевидно, что при создании первого генерализованного пула из 512 проб для однозначной идентификации одного инфицированного вирусом донора должно быть проведено по крайней мере 10 циклов PCR-тестирования. Вышеописанный высокоэффективный и экономически рациональный способ может создать определенные трудности для лаборатории, где проводят PCR-тестирование, в том случае, когда время имеет важное значение.

Методика однозначной идентификации вирус-положительной донорской крови или плазмы с проведением минимального числа циклов PCR-тестирования будет описана ниже со ссылками на фиг.13 и 14.

На фиг. 13 представлена блок-схема методики PCR-тестирования в соответствии с настоящим изобретением для эффективного обнаружения PCR-положительной пробы от отдельного донора, содержащейся в пуле, с проведением минимального числа циклов PCR-анализа. Как и в вышеописанном способе PCR-тестирования в способе, проиллюстрированном на фиг.13, предполагается что PCR-тест является достаточно чувствительным для обнаружения присутствия положительной пробы в пуле данного размера. Для получения исходного пула путем объединения проб выбирали, лишь в целях иллюстрации, 512 доноров крови или плазмы. При этом следует отметить, что размер первоначального пула может быть больше или меньше в зависимости от конкретно оцениваемого геномного маркера, чувствительности используемой процедуры PCR-теста, ожидаемого значения концентрации геномного маркера в аликвоте пробы и размера аликвоты пробы.

Способ начинается с блока 301, с определения N-мерной матрицы или массива проб. Эта матрица может быть любого размера и содержать любое число измерений от 2 до N, но предпочтительно использовать 3-мерную регулярную матрицу, организованную в виде квадратной матрицы.

Пример такой матрицы изображен на фиг.14, где представлено графическое изображение квадратной матрицы, характеризующейся 3-мерными параметрами: строка, столбец и слой (r c,s). В матрице, представленной на фиг.14, имеются 3 строки, 3 столбца и 3 слоя, то есть эта матрица определяется 3³ или 27 элементами. В характерном варианте осуществления изобретения строка рассматривается как все элементы, определяемые воображаемым вертикальным сечением по всей квадратной регулярной матрице. В варианте, представленном на фиг.14, элементы, составляющие, например, строку 3 матрицы, обозначены буквой r₃ на гранях, соответствующих строкам.

Аналогичным образом столбец включает все элементы матрицы, определяемые вторым воображаемым вертикальным сечением по всей матрице, перпендикулярным сечению, соответствующему строкам. В иллюстративном варианте, показанном на фиг.14, элементы, которые составляют, например, столбец 1, обозначены буквой c₁ на гранях, соответствующих столбцам. Слой определяют как все элементы, находящиеся в горизонтальном сечении по всей матрице, изображенной на фиг. 14. Аналогично строкам и столбцам элементы, соответствующие слою 1, обозначены буквой s₁ на гранях, соответствующих слоям.

Следовательно, исходя из вышеуказанного, очевидно, что каждый из 27 элементов матрицы, изображенной на фиг.14, однозначно принадлежит 1 из 3 строк, 1 из 3 столбцов и 1 из 3 слоев. Математически это может быть выражено соотношением Х_rcs, где Х означает элемент, a rcs представляет индекс размерности, где каждый из индексов может принимать значения от 1 до 3. Конкретный элемент Х₁₁₃ может быть идентифицирован как элемент, находящийся на пересечении строки 1, столбца 1 и слоя 3.

Исходя из вышеуказанного, очевидно, что хотя матрица, изображенная на фиг.14, представляет собой матрицу 3х3х3, однако принцип определения матрицы и образования элементов сохраняется и для матриц с гораздо большим числом строк столбцов и слоев. В частности матрица с 8 строками, 8 столбцами и 8 слоями может быть математически представлена как X_rcs, где r, с и s могут принимать значения от 1 до 8. Таким образом, 3-мерная 8х8х8-матрица может быть использована в качестве идентификатора для 512 элементов.

Возвращаясь теперь к способу, проиллюстрированному на блок-схеме фиг.13, следует указать, что после определения N-мерной матрицы проб конкретные пробы донорской крови или плазмы могут быть отображены в каждый из элементов, определенных этой матрицей. В характерной 3-мерной 8 х 8 х 8-матрице проба от каждого из 512 отдельных доноров ассоциируется с элементом матрицы, идентифицированным соответствующим однозначным индикатором Х_rcs.

Затем от каждой пробы берут аликвоту и образуют множество минорных пулов подгрупп. Каждый такой минорный пул содержит аликвоты от всех проб (Х_rcs), в которых фиксируется 1 из индексов размерности. Другими словами, согласно вышеописанной иллюстративной матрице, все пробы (Х_rcs), которые имеют r=1, независимо от значения столбца или слоя, формируют в минорный пул, аналогично для r=2, r=3 r=N, аналогично для с=1, независимо от значения строк или слоя, с=2,... c=N и аналогично для s=l независимо от значения строк или слоя s= 2,... s=N. Таким образом, каждый минорный пул представлен каждой строкой, столбцом, слоем или другим индексом размерности, так что N-мерная матрица определена, то число минорных пулов будет равно N-размерности, умноженной на (общее число проб)^1/n. Для рассматриваемой 3-мерной 8 х 8 х 8-матрицы, содержащей 512 проб, имеется 24 минорных пула подгруппы (8 пулов для строк, 8 пулов для столбцов и 8 пулов для слоев). В соответствии с настоящим изобретением создание минорных пулов может быть рассмотрено в соответствии с математическим методом сокращения определителя по методу миноров. Аналогично этому следует отметить, что каждая проба представлена в N-минорных пулах, 1 для каждого измерения матрицы.

Помимо образования минорных пулов, аликвоту каждой пробы или аликвоту каждого минорного пула объединяют в один главный пул, который содержит пробы от всех 512 доноров, составляющих представленное количество доноров. После создания всех пулов любые оставшиеся пробы, минорные пулы и главный пул могут быть снова заморожены и оставлены на хранение до тех пор, пока не потребуется проведения PCR-тестов.

Если желательно проведение PCR-теста, то сначала осуществляют PCR-тестирование главного пула, который представляет аликвоты от каждой пробы, составляющие данную матрицу. Если результат теста главного пула окажется отрицательным, то исходя, по крайней мере, из уровня чувствительности PCR-теста, можно сделать вывод, что в этом пуле, представленном пробами, образующими указанную матрицу, отсутствуют пробы, положительные на вирус. Поэтому доноры крови или плазмы, от которых были получены пробы, составляющие данную матрицу, могут быть взяты для дальнейшего использования. Однако если результат теста главного пула на конкретный геномный маркер окажется положительным, то необходимо провести второй цикл PCR-тестирования в стадии 300, в котором будет протестирован каждый их минорных пулов.

Аналогично описанному выше, размеры главного пула выбирают так, чтобы статистическая вероятность того, что в главном пуле (512 проб) будет присутствовать более одной положительной пробы, была невелика, предпочтительно менее чем 1-2%. Это может быть осуществлено путем оценки частоты встречаемости исследуемого вируса во всей группе доноров с доверительными пределами 98-99%. Так, например, если было определено, что из всей группы, состоящей из 1000 доноров, лишь 1 донор инфицирован данным вирусом с доверительным пределом 98%, то вероятность того, что в следующей группе доноров имеется более чем 1 инфицированный донор, составляет 2%. Это дает основание считать, что этот алгоритм является, в основном, пригодным для идентификации одной реактивной единицы в пуле соответствующих размеров в цикле PCR-тестирования. В соответствии с настоящим изобретением, если в данной матрице имеется одна положительная проба, то 3 минорных пула будут содержать аликвоту этой положительной донорской пробы, по 1 в каждом измерении. В проиллюстрированном варианте осуществления изобретения (матрица из 512 проб) имеется 8 минорных пулов по строкам, 8 минорных пулов по столбцам и 8 минорных пулов по слоям. Если результат тестирования главного пула является положительным, то пул строки 1, столбца 1 и слоя 1 даст положительный результат после второго цикла PCR-тестирования, как показано в 307. Индекс элемента, находящегося на пересечении строки, столбца и слоя, однозначно идентифицирует реактивную донорскую пробу, как показано в 309.

Так, например, если реактивная проба была отображена в элемент матрицы Х₁₁₃, то минорный пул строки 1 будет давать положительный результат PCR-теста, тогда как минорный пул строки 2 и последующих строк будет давать отрицательный результат теста. Далее минорный пул столбца 1 будет давать положительный результат теста тогда, как минорный пул столбца 2 и последующих столбцов будет давать отрицательный результат теста. Аналогичным образом минорные пулы слоя 1 и 2 будут давать отрицательный результат, пул слоя 3 будет положительным, а минорные пулы последующих слоев будут отрицательными. 3 положительных минорных пула (строка 1, столбец 1 и слой 3) имеют только один элемент - общий элемент Х₁₁₃. Таким образом, положительная донорская проба однозначно идентифицируется как проба, отображенная в элемент матрицы Х₁₁₃.

Если в данной матрице имеется более чем одна реактивная проба, то эти реактивные донорские пробы могут быть также однозначно идентифицированы способом настоящего изобретения путем проведения не более чем одного дополнительного цикла PCR-теста. Если положительный результат теста был получен для более чем 1 минорного пула с одним индексом размерности, то в том случае, когда только один минорный пул, представляющий каждый из остальных индексов размерности будет иметь положительный результат теста, может быть однозначно идентифицирована более чем 1 положительная донорская проба путем математической оценки результатов теста, не прибегая к проведению третьего цикла PCR-тестирования.

Так, например, если минорный пул строки 1, но никакой другой дает положительный результат теста, минорный пул столбца 1, но никакой другой дает положительный результат теста, и минорный пул слоя 1, и минорный пул слоя 3 - оба дают положительные результаты теста, то в этой матрице имеются только две положительных донорские пробы, и они могут быть однозначно идентифицированы как Х₁₁₁ и Х₁₁₃. Для достижения этого результата не требуется проведения дополнительного тестирования.

С другой стороны, было установлено, что множество тест-положительных минорных пулов и их индексы указывают на изменение по 2 индексам размерности, как показано в 310, при этом, очевидно, что имеется Z² элементов, идентифицированных как возможно соответствующие положительным донорским пробам, где Z представляет фактическое число положительных донорских проб, составляющих данный массив.

Так, например, если минорный пул строки 1, но никакой другой дает положительный результат теста, минорные пулы столбца 1 и столбца 3 дают положительные результаты теста; и минорные пулы слоя 1 и слоя 3 дают положительные результаты теста, то можно предположить, что элементами потенциально положительных кандидатов являются Х₁₁₁, Х₁₁₃, Х₁₃₁ и X₁₃₃. Поскольку имеется множество в только двух из индексов размерности (столбец и слой) то для элементов-кандидатов, очевидно, имеются только две действительно положительные пробы, составляющие эту матрицу. В этом случае все 4 донорские пробы могут быть условно идентифицированы как положительные и отброшены, либо альтернативно от каждого из этих элементов-кандидатов может взята аликвота и отдельно подвергнута PCR-тесту в третьем цикле PCR-тестирования, как показано в 311, для того, чтобы однозначно определить, которые 2 из 4 проб содержит действительно положительную донорскую пробу.

Аналогичным образом с математической точки зрения очевидно, что если в данной матрице имеется более чем 2 положительные донорские пробы, то их идентификаторы варьируются по более чем 2 измерениям, то есть будет присутствовать самое большее Zⁿ потенциально положительных идентифицированных элементов-кандидатов, где Z означает действительное число положительных донорских проб, а n означает число измерений, которое варьируется. В этом случае от всех подозрительных элементов в матрице берут аликвоты и подвергают прямому анализу.

Таким образом, можно видеть, что способ настоящего изобретения позволяет осуществлять однозначную идентификацию донорского материала, который является реакционноспособным по отношению к конкретному геномному маркеру, с использованием одного цикла PCR-тестирования первоначально положительного главного пула, 2 циклов PCR-тестирования для всех матриц, которые содержат одну реакционноспособную пробу или множество реакционноспособных проб, которые варьируются лишь по одному индексу размерности, и 3 цикла PCR-тестирования в любой другой ситуации.

В соответствии с этим осуществление настоящего изобретения позволяет получить депо донорской крови и приготавливать из этой крови или плазмы продукты, которые являются, в основном, безопасными, так как они, насколько это возможно, не содержат вирусной инфекции. Преимущественное экономически рациональное и в высокой степени чувствительное тестирование может быть легко осуществлено непосредственно на присутствие вируса. В этом случае исключаются ложные результаты анализов на вирусную инфекцию, обычно ассоциируемые с тестами на антитела, проводимыми во время периода "окна инфекционности". Кроме того, настоящее изобретение позволяет осуществлять экономически эффективные и в высокой степени чувствительные тесты, которые способны обнаруживать присутствие одного единственного вируса в тест-пробе, что дает гарантию того, что материал донорской крови не содержит вирусной инфекции, находящейся на ранней стадии своего развития.

При этом, следует отметить, что вышеуказанные примеры и описания различных предпочтительных вариантов настоящего изобретения приводятся просто для иллюстрации его осуществления и что в используемые в нем формы, размеры и число компонентов, а также типы осуществляемых тестов могут быть внесены изменения, не выходящие, однако за рамки объема и существа изобретения. Так, например, для каждого специалиста очевидно, что длина отдельных и соединенных друг с другом пакетов, а значит и объем их содержимого могут быть соответственно увеличены вместе с длиной сегмента трубки. При последовательном тестировании подпулов, образованных из менее объемных проб или из меньшего числа проб, объем плазмы, составляющий данный пул, должен быть уменьшен. Следует отметить, что для поддержания подходящего объема плазмы в каждом последующем подпуле следующие пакеты с пробами могут содержать больший объем для получения нужного объема конечного пула. Для того, чтобы пулы соответствовали размерам в пределах от около 1 мл до около 10 мл, очевидно, что объемы последующих пакетов с пробами должны быть увеличены на около 0,02-0,5 мл последовательными ступенями. В характерном варианте осуществления изобретения объем пакета составляет 0,02 мл в первом пакете, используемом в наиболее крупном пуле, и 0,2 мл - в конечном пакете.

Для каждого специалиста также очевидно, что система настоящего изобретения не ограничивается проиллюстрированным контейнером для сбора плазмы и соединенным с ним сегментом трубок. С тем же успехом могут быть использованы пакеты для крови или контейнеры для других биологических жидкостей и подсоединенные к ним подходящие сегменты трубок как перед сбором жидкостей, так и после завершения сбора жидкости. Единственное, что необходимо для осуществления настоящего изобретения, так это то, чтобы в сегмент трубки, который затем трансформируется в пакеты, поступали определенные количества проб биологических жидкостей.

В соответствии с этим настоящее изобретение не ограничивается конкретными вариантами его осуществления, описанными выше, при условии, что возможные изменения не выходят за рамки объема формулы изобретения.

Изобретение относится к области медицины, в частности, описаны системы и способы, которые могут быть использованы для тестирования донорских материалов крови или плазмы в целях обнаружения конкретных донорских проб, инфицированных вирусом. Описан способ, в котором используются индивидуальные герметизированные и соединенные друг с другом контейнеры для сбора проб. Содержимое этих контейнеров объединяют в пулы, которые затем анализируют на присутствие вирусной инфекции с использованием высокочувствительного теста, такого, как РСR. Эти пулы тестируют с использованием алгоритма, согласно которому пробы от каждого донора отображаются в каждом элементе N-мерной матрицы или массива. Каждый элемент этой матрицы идентифицируется матричным идентификатором Х_rcs, где r, c и s - индексы размерности. От каждой пробы берут аликвоты и образуют подпул; каждый подпул содержит аликвоты проб, у которых один индекс размерности является фиксированным. Все подпулы подвергают одному циклу РСR-тестирования. Индексы размерности каждого положительного подпула оценивают математически в соответствии с "сокращением" по методу миноров, что позволяет однозначно идентифицировать один единственный элемент массива и тем самым однозначно идентифицировать одну единственную вирус-положительную пробу крови или плазмы от одного донора. Технический результат изображения - расширение арсенала средств донорской крови для переливания. 3 с. и 32 з.п. ф-лы, 18 ил.

1. Способ РСR-тестирования проб жидкостей, собранных у человека, путем осуществления наименьшего числа циклов высокочувствительного теста, предусматривающий получение множества проб биологической жидкости, собранных у человека, причем указанные собранные пробы жидкости включают в себя пробы крови, пробы плазмы или пробы сыворотки; определение n-мерной матрицы, где n - целое число, причем указанная матрица, кроме того, включает в себя множество элементов, где каждый элемент определяется точкой пересечения n измерений данной матрицы и идентифицируется соответствующим матричным представлением, где указанное матричное представление включает в себя по меньшей мере один индекс для каждой размерности массива; взятие пробы из каждого из множества образцов собранных биологических жидкостей; картирование каждой пробы в соответствующий конкретный один элемент данной матрицы, причем каждая отдельная проба идентифицируется с соответствующим матричным представлением соответствующего ей элемента; взятие аликвот из каждой пробы, причем число аликвот, взятых из каждой пробы, определяется числом измерений, характеризующих данную матрицу; создание подпулов из аликвот каждой пробы, где каждый подпул содержит аликвоту из всех проб, идентифицированных матричным представлением, в котором фиксируется один индекс размерности, и где каждый соответствующий подпул идентифицирован указанным фиксированным индексом размерности; получение подпулов для облегчения высокочувствительного тестирования, где все подпулы тестируют на присутствие вируса в одном цикле высокочувствительного теста; определение соответствующих фиксированных индексов размерности для подпулов, которые дают положительный результат теста на вирус, и объединение указанных фиксированных индексов размерности в матричное представление, что позволяет однозначно идентифицировать единственный элемент матрицы, определяемый матричным представлением, и тем самым однозначно идентифицировать единственную вирус-положительную пробу. 2. Способ по п. 1, где указанную матрицу создают в виде регулярного массива, где каждое из n измерений этого массива характеризуется равным целым числом элементов. 3. Способ по п. 2, где указанный регулярный массив представляет собой 3-мерный массив, причем этот массив, кроме того, подразделяется на строки, столбцы и слои и каждый элемент этого массива характеризуется матричным представлением Х_rcs, где индексы размерности r, c и s соответственно идентифицируют элементы, составляющие строку, столбец и слой этого массива. 4. Способ по п.3, где стадия создания подпула, кроме того, включает в себя создание подпулов аликвот из проб, идентифицируемых по идентичным индексам r, но различным индексам с и s; создание подпулов аликвот из проб, идентифицируемых по идентичным индексам с, но различным индексам r и s; создание подпулов аликвот из проб, идентифицируемых по идентичным индексам s, но различным индексам r и с, и оценку каждого из r-, с- и s-подпулов на вирус-положительный результат в высокочувствительном тесте. 5. Способ по п.4, который дополнительно включает в себя следующие стадии: определение целого индекса каждого r-подпула, который дает вирус-положительный результат; определение целого индекса каждого c-подпула который дает вирус-положительный результат, и определение целого индекса каждого s-подпула, который дает вирус-положительный результат. 6. Способ по п.5, который дополнительно включает в себя стадию замены целых индексов каждого из подпулов r, с и s, дающих вирус-положительный результат, на индексы размерности r, с и s матричного представления, что позволяет идентифицировать единственный элемент матрицы, определяемый указанным матричным представлением, и тем самым однозначно идентифицировать соответствующую вирус-положительную пробу. 7. Способ по п.6, где 3-мерный массив содержит регулярный 8 х 8 х 8-массив, где каждый из индексов размерности r, с и s принимает целые значения от 1 до 8. 8. Способ по п.7, где из каждой соответствующей пробы собранных биологических жидкостей берут по три аликвоты. 9. Способ по п.8, который дополнительно включает в себя следующие стадии: создание восьми подпулов строк, где каждый подпул строки однозначно идентифицируется целым числом от 1 до 8 и где каждый подпул строки образован 64 аликвотами проб; создание восьми подпулов столбцов, где каждый подпул столбца однозначно идентифицируется целым числом от 1 до 8 и где каждый подпул столбца образован 64 аликвотами проб; создание восьми подпулов слоев, где каждый подпул слоя однозначно идентифицируется целым числом от 1 до 8 и где каждый подпул слоя образован 64 аликвотами проб. 10. Способ однозначной идентификации вирус-положительных проб биологических жидкостей, собранных у человека, путем осуществления наименьшего числа циклов высокочувствительного теста, предусматривающий получение множества проб биологической жидкости, собранных у человека, причем указанные собранные пробы жидкости включают в себя пробы крови, пробы плазмы или пробы сыворотки; определение N-мерной матрицы, где N - целое число, причем матрица, кроме того, включает в себя множество элементов, каждый из которых определяется точкой пересечения N измерений матрицы и идентифицируется в соответствии с матричным представлением х_i...iN, где нижний индекс матричного представления определяет индексы размерности данного массива; взятие N аликвот из каждой пробы каждого из множеств собранных проб биологической жидкости, причем число аликвот, взятых из каждой пробы, определяется числом индексов размерности, составляющих данный массив; создание подпулов из аликвот каждой пробы, причем каждый подпул содержит аликвоту из всех проб, идентифицируемых матричным представлением, в котором фиксируется один индекс размерности; получение подпулов для облегчения высокочувствительного тестирования, при котором все подпулы тестируются на присутствие вируса в первом цикле высокочувствительного теста; оценку индексов размерности каждого подпула, который дает вирус-положительный результат в первом цикле высокочувствительного теста, причем указанная оценка позволяет идентифицировать единственный элемент, определяемый индексами размерности каждого положительного подпула, в том случае, если только один подпул, представленный каждым индексом размерности, дает вирус-положительный результат, позволяя таким образом однозначно идентифицировать вирус-положительную пробу, и размещение пробы биологической жидкости, соответствующей вирус-положительной пробе. 11. Способ по п.10, где матрица представлена в виде регулярного 3-мерного массива, причем этот массив, кроме того, подразделяется на строки, столбцы и слои, и где каждый элемент характеризуется матричным представлением Х_rcs, где индексы размерности r, с и s соответственно идентифицируют элементы, составляющие строку, столбец и слой этого массива. 12. Способ по п.11, где оценка индексов размерности позволяет идентифицировать множество элементов, определяемых индексами размерности каждого положительного подпула, если более, чем один подпул одного индекса размерности дает вирус-положительный результат, в то время как лишь один подпул, представляющий каждый из оставшихся индексов размерности, дает вирус-положительный результат, что, таким образом, позволяет однозначно идентифицировать более чем одну единственную вирус-положительную пробу. 13. Способ по п.12, где оценка индексов размерности позволяет идентифицировать Zⁿ вирус-положительных элементов-кандидатов в том случае, если множество подпулов, представляющих каждый индекс размерности, дает вирус-положительный результат, где Z - действительное число вирус-положительных проб, а n - число размерностей, имеющих множество положительных подпулов. 14. Способ по п.13, который дополнительно включает в себя стадию взятия дополнительной аликвоты из каждой пробы, идентифицированной для каждого из Zⁿ вирус-положительных элементов-кандидатов: взятие аликвот для облегчения высокочувствительного тестирования, где все аликвоты тестируются на присутствие вируса во втором цикле высокочувствительного теста, и однозначную идентификацию всех вирус-положительных проб. 15. Способ по п.11, где стадия создания подпула дополнительно предусматривает создание подпулов аликвот из проб, идентифицируемых по идентичным индексам r, но различным индексам с и s; создание подпулов аликвот, взятых из проб, идентифицируемых по идентичным индексам с, но различным индексам r и s; создание подпулов аликвот, взятых из проб, идентифицируемых по идентичным индексам s, но различным индексам r и c, и оценку каждого из r-, с- и s-подпулов на вирус-положительный результат в высокочувствительном тесте. 16. Способ по п. 15, который дополнительно включает в себя следующие стадии: определение целого индекса каждого вирус-положительного r-подпула; определение целого индекса каждого вирус-положительного с-подпула; определение целого индекса каждого вирус-положительного s-подпула. 17. Способ по п.16, который дополнительно включает в себя стадию замены целых индексов каждого из подпулов r, c и s, дающих вирус-положительный результат, на индексы размерности r, с и s матричного представления, что позволяет идентифицировать единственный элемент матрицы, определяемый указанным матричным представлением, и тем самым однозначно идентифицировать соответствующую вирус-положительную пробу. 18. Способ по п.17, где 3-мерный массив содержит регулярный 8 х 8 х 8-массив, где каждый из индексов размерности r, с и s принимает целые значения от 1 до 8. 19. Способ по п. 18, который дополнительно включает в себя следующие стадии: создание восьми подпулов строк, где каждый подпул строки однозначно идентифицируется целым числом от 1 до 8 и где каждый подпул строки образован 64 аликвотами проб; создание восьми подпулов столбцов, где каждый подпул столбца однозначно идентифицируется целым числом от 1 до 8 и где каждый подпул столбца образован 64 аликвотами проб; создание восьми подпулов слоев, где каждый подпул слоя однозначно идентифицируется целым числом от 1 до 8 и где каждый подпул слоя образован 64 аликвотами проб. 20. Способ по п.1, где высокочувствительный тест представляет собой тест РСR. 21. Способ по п.3, где высокочувствительный тест представляет собой тест РСR. 22. Способ по п.9, где высокочувствительный тест представляет собой тест РСR. 23. Способ по п. 10, где высокочувствительный тест представляет собой тест РСR. 24. Способ по п. 19, где высокочувствительный тест представляет собой тест РСR. 25. Способ создания подпулов для использования в тестировании на присутствие определяемого агента в наборе образцов биологической жидкости, предусматривающий (а) ассоциирование каждого из образцов жидкости с отдельным матричным элементом N-мерной матрицы, причем каждый из элементов матрицы идентифицируется величиной индексов N, где индексы N в точности соответствуют размерности N матрицы; (b) создание N аликвот из каждой из проб жидкости и (с) объединение аликвот с получением подпулов так, чтобы каждый из подпулов содержал в себе по одной аликвоте каждой из проб жидкости, ассоциированных с элементами матрицы, которые имеют одинаковое значение одного из индексов N. 26. Способ по п.25, дополнительно предусматривающий (d) тестирование каждого из подпулов с целью регистрации присутствия определяемого агента и (е) получение положительного результата для одного из подпулов, когда в указанном подпуле регистрируется присутствие определяемого агента. 27. Способ по п.26, дополнительно предусматривающий (f) объединение идентичных подпулов из всего множества подпулов, которые имеют положительный результат, для идентификации по меньшей мере одной соответствующей пробы жидкости с положительным результатом. 28. Способ по п.25, где индексы N имеют одинаковую область значений. 29. Способ по п.25, где N = 3. 30. Способ по п. 26, где стадия (d) представляет собой высокочувствительное тестирование. 31. Способ по п.30, где высокочувствительное тестирование является тестированием методом полимеразной цепной реакции (СРR). 32. Способ по п.27, где N = 3 и существует 3 группы указанных подпулов, соответствующих 3 индексам, причем каждый подпул этих 3 групп подпулов идентифицируется специфическим значением соответствующего одного из индексов N. 33. Способ по п.32, где стадия (f) приводит к идентификации К образцов жидкости с положительным результатом, при этом К является целым числом, большим или равным единице, причем одна из N групп подпулов имеет К подпулов с положительным результатом и каждая из оставшихся N-1 групп подпулов имеет только один подпул с положительным результатом. 34. Способ по п.32, при котором операция (f) приводит к идентификации группы проб-кандидатов на образцы жидкости с положительным результатом, когда более чем одна из N групп подпулов имеет более чем один подпул, имеющий положительный результат. 35. Способ по п.34, дополнительно включающий в себя стадии создания новой аликвоты из каждого из кандидатов на образцы жидкости с положительным результатом; тестирования каждой из новых аликвот с целью регистрации определяемого агента и получения положительного результата по одной из новых аликвот, когда в указанной новой аликвоте регистрируется определяемый агент, при этом указанная новая аликвота идентифицируется с соответствующей пробой, имеющей положительный результат.