КОМПЛЕКС ПРИРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, АКТИВНЫЙ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАВАЕМЫХ ПОЛОВЫМ ПУТЕМ Российский патент 2003 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к области медицины, а именно к разработке и поиску новых лекарственных средств на основе природных соединений растительного происхождения, активных в отношении вируса иммунодефицита, гепатита, а также других возбудителей инфекций, передаваемых половым путем.

Проблема борьбы с все возрастающей угрозой распространения инфекций, передаваемых половым путем, в настоящее время весьма актуальна. Природные источники всегда представляли значительный интерес для создания лекарственных средств, в том числе для лечения различных инфекций, как наиболее доступные и эффективные.

К таким соединениям относятся алпизарин, флакозид, хелепин, хелепин Д, эвкалимин.

Алпизарин разрешен для медицинского применения у взрослых и детей для лечения острых и рецидивирующих форм простого герпеса генитальной и экстрагенитальной локализации, цитомегаловирусов, опоясывающего лишая и др. Алпизарин обладает противовирусными свойствами в отношении ВИЧ-инфекции, вирусов герпеса I и II типа, Varicella zoster. Алпизарин получают из травы копеечника альпийского и копеечника желтеющего. По химической структуре алпизарин является 2-с-β-Д-(глюкопиранозид)-1,3,6,7-тетраокси-ксантоном. (Машковский М. Д. "Лекарственные средств", т. 2, 1986 г, Гос. Реестр лекарственных средств, 2001 г., т.1). Алпизарин является малотоксичным веществом: LD₅₀ при внутрибрюшинном введении мышам составляет 13000-15900 мг/кг, не влияет на гематологические показатели, свертываемость крови, белковый и липидный обмен и антитоксическую функцию печени, не оказывает кардио- и нефротоксического действия.

Противовирусные свойства алпизарина подтверждены патентами за рубежом (пат. Японии 1518445, пат. Великобритании 2108383, пат. ФРГ 31411970).

Флакозид разрешен для медицинского применения у взрослых и детей как противовирусное средство при острых вирусных гепатитах А и В, первичных и рецидивирующих формах простого герпеса экстрагенитальной и генитальной локализации, опоясывающем лишае и других инфекций. Флакозид - это производное флавонов, получают из листьев бархата амурского (Машковский М.Д. "Лекарственные средства", т.2, 2000 г., Гос. Реестр лекарственных средств, 2001 г., т.1). Применение флакозида для лечения герпеса описано в авт. свид. СССР 491387.

Хелепин и хелепин Д оказывают ингибирующий эффект на вирусы герпеса I и II типа, разрешены для применения у взрослых и детей при простом герпесе генитальной и экстрагенитальной локализации, опоясывающем герпесе и других вирусных инфекций. Представляют собой очищенные экстракты, содержащие в качестве биологически активных компонентов суммы флавоноидов (изоориентин, витоксин, изовитексин и др. ). Хелепин выделен из надземной части леспедеции копеечковой сем. Бобовых. Хелепин Д выделен из надземной части десмодиума канадского, сем. бобовых (Машковский Д.М. Лекарственные средства т.2, 2000 г. Новые лекарственные средства, М., 2000 г., Гос. Реестр, т.1, 2001 г.). Известно лекарственное средство на основе хелепина Д для лечения герпесвирусных и аденовирусных заболеваний глаз (пат. РФ 2120294).

Эвкалимин разрешен для медицинского применения у взрослых и детей в качестве антибактериального и противовоспалительного средства, в том числе в гинекологии и урологии. Эвкалимин активен в отношениикандиды, бактерий, в том числе грамположительных. Эвкалимин сумма терпеноидных фенолальдегидов и тритерпеноидов, получаемая из листьев и побегов эвкалипта прутовидного. (Машковский М.Д. "Лекарственные средства", т.2, 2000 г., Гос. Реестр лекарственных средств, 2001 г., т.1, пат. РФ 2102977).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому объекту является средство на основе алпизарина, обладающего действием против инфекционных агентов, передаваемых половым путем, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекция), цитомегаловирус (пат. РФ 2092177).

Цель данного изобретения - создание комплекса на основе природных соединений растительного происхождения, обладающего противовирусным и противоинфекционным действием, в том числе в отношении инфекций, передаваемых половым путем.

Поставленная цель достигается за счет использования комплекса природных соединений растительного происхождения, включающего алпизарин, и дополнительно содержащего флакозид, хелепин или хелепин Д, эвкалимин, взятых соответственно в соотношении 1:1:(2,0-3,0):(0,4-0,5).

Экспериментально установлено, что комплекс природных соединений на основе алпизарина, флакозида, хелепина или хелепина Д и эвкалимина, взятых соответственно в соотношении 1:1:(2,0-3,0):(0,4-0,5), наряду с известными свойствами противовирусным и противомикробным действиями активен в отношении вирусов гепатита, ВИЧ-инфекции, а также других возбудителей инфекций, включая трепонему и хламидию, передаваемых половым путем.

Все соединения, входящие в комплекс в заявляемых соотношениях, не вступают в химическое взаимодействие друг с другом, не образуют новых веществ, обладающих новыми биологически активными свойствами или токсическим действием. Полное сохранение химических структур компонентов, входящих в данный комплекс, подтверждено аналитическими методами контроля, а именно алпизарин, флакозид, эвкалинин, хелепин и хелепин Д определяли спектрофотометрическим методом с использованием стандарта. Все указанные методы контроля вошли в нормативные документы, включая фармацевтический стандарт предприятия (ФСП).

Сохранение в данном комплексе неизмененных химических структур компонентов приводит и к сохранению их биологической активности, указанной выше, присущей каждому компоненту, а именно противовирусной активности алпизарина (в отношении ВИЧ-инфекции, вируса герпеса и других вирусов) и флакозида (в отношении вируса гепатита А и В и других вирусов), хелепина и хелепина Д в отношении генитального герпеса и других вирусов, эвкалимина в отношении кандиды, хламидий, наличие противовосполительных свойств.

Проведены также новые биологические исследования, подтверждающие сохранение в комплексе противоинфекционной активности, присущей одному или нескольким компонентам, а именно исследован трепонемоцидный эффект заявляемого комплекса и входящих в него компонентов в отношении Treponema pallidum (возбудитель сифилиса). Проведенные исследования также показали, что эффект, установленный хотя бы для одного из компонентов (или для нескольких компонентов) полностью сохраняется для всего комплекса.

Пример 1. Изучение активности в отношении Treponema pallidum.

Проведены исследования влияния комплекса природных соединений растительного происхождения, состоящего из алпизарина, флакозида, хелепина или хелепина Д, и эвкалимина, взятых в соотношении 1:1:(2,0-3,0):(0,4-0,5), на бледную трепонему - возбудителя сифилиса. Наряду с комплексом испытывали каждый компонент в отдельности: алпизарин, флакозид, хелепин и хелепин Д, эвкалимин.

Взвесь бледных трепонем получали из орхитов кролика на 7-й день после заражения кроликов сифилисом. Трепонемы наблюдали в темнопольном микроскопе окуляр 40, объектив х7. Взвесь бледных трепонем сохранялась в стерильном физиологическом растворе. Для опытов использовали взвесь с содержанием около 100 бледных трепонем в поле зрения. Растворы данных соединений готовили из расчета 20 мг вещества в одном мл жидкости: для водорастворимых соединений (хелепин, хелепин Д) 1 мл дистиллированной воды, для водонерастворимых (эвкалимин, флакозид, алпизарин) 5%-ный раствор этилового спирта + 0,9 мл дистиллированной воды.

Трепономоцидный эффект изучали методом прямого контакта в капле. Одну каплю (0,05 мл) каждого раствора помещали на предметное стекло, смешивали с равным объемом взвеси трепонем в изотоническом растворе хлористого натрия, накрывали покровным стеклом и тотчас просматривали под микроскопом.

Результаты сведены в таблицу 1.

Таким образом, комплекс проявил трепонемоцидный эффект и может быть рекомендован для создания лекарственных средств профилактического и лечебного действия.

Пример 2. Изучение активности в отношении вируса гепатита в опытах in vitro.

В эксперименте использовали культуру клеток AGMK (линия BS-С-1) и адаптированный к ней штамм вируса гепатита А НМ-175. Проведены серии экспериментов с учетом времени внесения объекта исследования (флакозид) по отношению к моменту заражения культуры клеток вирусом гепатита: до заражения, одновременно с заражением, после заражения вирусом. Во всех сериях опытов выявлено, что объект исследования подавлял размножение вируса гепатита А в культурах по сравнению с контролем. При учете результатов методом непрямой иммунофлюоресценции объект в концентрации 0,1 мг/мл вызывал ингибирование размножения ВГА на 30-35% при внесении в культуру клеток одновременно с заражением вирусом. При учете результатов иммуноферментным методом также установлено, что ингибирование размножения ВГА в концентрациях 1, 0,5 и 0,1 мг/мл происходило в тех же условиях опыта. Ни в одной из примененных концентраций токсического действия объекта исследования на клетки не наблюдали. Таким образом, показано противовирусное действие объекта исследования в отношении вируса гепатита человека.

Пример 3. Изучение активности в отношении хламидий
Исследования проведены у 8 пациентов в возрасте 8-14 лет, находящихся на стационарном лечении. У всех пациентов был установлен диагноз дифференцированный серологически и культурально, "урогенитальный хламидиоз". Объект исследования суппозиторий с эвкалимином 0,03. Пациентам назначали в качестве монотерапии в лекарственной форме "Суппозиторий с эвкалимином 0,03" per rectum по 2 суппозитория 2 раза в сутки. Продолжительность лечения 10-11 суток. Отмечена хорошая переносимость объекта исследования, ни в одном случае не наблюдали общих токсических или местнораздражающих явлений. У всех пациентов наступило клиническое выздоровление, подтвержденное лабораторным анализом.

Пример 4. Изучение активности в отношении ВИЧ-инфекции
В опытах использовали: вирус иммунодефицита человека 1 типа; штамм HTLV-III, продуцируемый клеточной линией Н9/IIIB; первично-трипсинизированную культуру Т-лимфоцитов человека Н9 и H9/IIIB, первичные культуры спленоцитов мышей линии C₅₇ BL/6; нелинейные белые мыши обоего пола; сыворотки больных СПИД (B.F. Vestergaard, Государственный институт сыворотки, Копенгаген, Дания).

Клетки Н9 заражали ВИЧ-1, подсевая живые клетки культуры Н9/IIIB. Объект исследования (алпизарин) вносили в культуру Н9 + Н9/IIIB непосредственно после заражения. Опыты сопровождали контролем культуры без объекта исследования и контролем токсичности доз объекта исследования для клеток Н9.

Уровень продукции ВИЧ-1 заражеными культурами оценивали:
- по количеству клеток (%), экспрессирующих вирусные антигены на мембранах, определяемому методом непрямой иммунофлуоресценции;
- по активности обратной транскриптазы ВИЧ-1 в супернатанте.

Влияние объекта исследования на экспрессию СД4-рецептора оценивали после 24-часовой инкубации объекта исследования с клетками Н9 методом проточной флуоцитометрии на лазерном сортере с использованием моноклональных антител, меченых ФНТЦ-ОКТ4 (в качестве контроля ОКТ8).

Исследование эффективности объекта исследования проводили в опытах in vitro в смешанной культуре клеток Н9/IIIB и Н9. Смесь (1:1) клеток готовили непосредственно перед опытом и разливали по 2 мл в каждую лунку в 24-луночных планшетах фирмы "Coster". В лунки вносили объект исследования из расчета получить в лунках конечные концентрации 50 мкг/мл. Планшеты инкубировали при температуре 37 град. И 5% СО₂ в течение 7 суток. Жизнеспособность клеточных культур оценивали ежедневно с помощью инвертированного микроскопа. Результаты опыта учитывали на 7 сутки методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием сыворотки больного СПИД в разведении 1:40.

В результате исследования установлено, что объект исследования в концентрации 50 мкг/мл ингибировал почти полностью вирусную продукцию в изученной системе клеток Н9/IIIB и Н9. Полученные данные свидетельствуют о способности предохранения алпизарином неинфицированных вирусов клеток Н9 от заражения их вирусом в условиях совместного культивирования с клетками Н9/IIIB.

Пример 5. Изучение активности в отношении вируса герпеса.

Клинические исследования проведены на пациентах взрослого и детского возраста. Объекты исследования - хелепин и хелепин Д. Анализ полученных результатов представлен в таблице 2. Объекты исследования показали хорошую переносимость, отсутствие побочных явлений и высокую эффективность.

Во всех примерах опыты проводили в нескольких повторностях в заявляемых соотношениях. В примерах приведены усредненные результаты исследования.

Таким образом, заявленный комплекс природных соединений растительного происхождения является перспективным для создания лекарственных средств профилактического и лечебного действия при ВИЧ-инфекции, сифилисе, хламидиозе, герпесе и гепатите.

Изобретение относится к области медицины, в частности к средствам из лекарственных растений, обладающим противовирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека и возбудителей инфекций, передаваемых половым путем. Предложено средство, содержащее алпизарин, флакозид хелепин и хелепин Д, эвкалемин, взятые соответственно в соотношении 1:1:(2,0-3,0):(0,4-0,5). Предложенные ингредиенты обеспечивают многопрофильность и полифункциональность комплекса для борьбы с инфекциями, передаваемыми половым путем. 3 табл.

Комплекс на основе природных соединений растительного происхождения, обладающий противоинфекционным действием в отношении инфекций, передаваемых половым путем, включающий алпизарин, отличающийся тем, что комплекс дополнительно содержит флакозид хелепин или хелепин Д, эвкалимин, взятые соответственно в соотношении 1: 1: (2,0-3,0): (0,4-0,5).