СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИГЕННОГО ДИАГНОСТИКУМА Российский патент 2003 года по МПК G01N33/556 G01N33/531 

Изобретение относится к медицине, а именно к производству эритроцитарных диагностикумов для реакции пассивной гемагглютинации применительно к индикации антител к различным бактериям.

Известны способы сенсибилизации эритроцитов путем обработки их растворами танина с последующей конъюгацией с антигеном [1].

Наиболее близким и принятым нами за прототип является способ сенсибилизации 20-50% взвеси эритроцитов 5-ю объемами сыворотки сенситина с применением в качестве связующего агента двух объемов 0,3-0,5% раствора СrСl₃ в течение 5 мин при 18-20^oС и рН 6,5-7,0 [2,3].

Недостатком известных способов является низкая чувствительность диагностикумов.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение чувствительности эритроцитарного диагностикума.

Технический результат достигается путем сенсибилизации эритроцитов водным раствором слабых полимерных кислот концентрации 0,2-0,8 мг/мл при объемном соотношении взвеси эритроцитов и раствора полимерной кислоты 1:1.

Авторами в качестве полимерных кислот были использованы образцы полиакриловой кислоты (75, 750 и 2000 кД), полиметакриловой кислоты (1000 кД), поли-5-винилтетразола (40 и 500 кД). Для сенсибилизации эритроцитов применяли дифтерийный микробный антиген (поверхностный белок 64 кД), лактобактерин (L. fermentum 90TC4) и бифидобактерин (В. bifidum 1, 791).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Приготовление эритроцитарных диагностикумов для определения антител к коринебактериям дифтерии, лактобактериям и бифидобактериям.

Для приготовления диагностикума используют эритроциты барана. Взятие крови у барана проводят из яремной вены по 300 мл в антикоагулянт (5%-ный раствор цитрата натрия). Эритроциты сразу отмывают охлажденным физиологическим раствором 3 раза на центрифуге при 15000-20000 g. Формалинизацию эритроцитов проводят по методу Weinbach. Из отмытых эритроцитов готовят 8%-ную взвесь клеток на физиологическом растворе. К одному объему взвеси добавляют равный объем фиксирующего раствора (3%-ный раствор формальдегида на физиологическом растворе с рН 7,0-7,2, профильтрованный через бумажный фильтр), смесь помещают в термостат при +37^oС на 20 ч, периодически перемешивая. После этого эритроциты отмывают физиологическим раствором 3 раза при 15000-20000 g и хранят в консерванте (0,03%-ный формальдегид) в виде 20%-ной взвеси клеток.

Перед сенсибилизацией эритроциты отмывают один раз при 15000-20000 g охлажденным физиологическим раствором и определяют агглютинацию клеток. Для этого в лунки пластины микротитратора "Такачи" вносят по 0,1 мл 0,2%-ной взвеси отмытых эритроцитов в 0,9%-ном растворе хлорида натрия. В случае отсутствия спонтанной агглютинации клетки оседают через 1-1,5 ч в виде точки с резко очерченными краями. Такие эритроциты используют для приготовления диагностикума.

К одному объему 20%-ной взвеси отмытых от формалина эритроцитов добавляют равный объем раствора полимера или хлорида хрома СrС1₃, перемешивают 2 ч при комнатной температуре и добавляют 0,5 объема раствора антигена. Смесь выдерживают 30 мин на водяной бане при 56^oС и 30 мин при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Далее отмывают эритроциты от несвязанного белка три раза физиологическим раствором при 15000-20000 g в течение 5 мин. Готовят 0,8%-ную взвесь сенсибилизированных эритроцитов на физиологическом растворе с добавлением консерванта (азида натрия), взмучивают и подвергают контролю. Для контроля используют иммунную кроличью сыворотку, содержащую соответствующие антитела. Методика проведения анализа, учета ложноположительных реакций и обработки результатов соответствует общепринятой в методе пассивной гемагглютинации.

Пример 2. Влияние природы полимерной кислоты и ее концентрации на чувствительность диагностикума.

Зависимость чувствительности эритроцитарного диагностикума от концентрации полимерной кислоты определяют на примере полиметакриловой кислоты с молекулярной массой 1000 кД с использованием сывороток больных-носителей дифтерийных антител. Результаты, представленные в табл. 1, указывают на достаточно высокую чувствительность диагностикума при концентрации полимера 0,2-0,8 мг/мл. Повышение или понижение концентрации полимера не увеличивает чувствительность, но повышает вероятность спонтанной агглютинации эритроцитов.

Влияние природы полимера на чувствительность диагностикума изучено при концентрации полимера 0,8 мг/мл. Как показывают результаты табл. 2, диагностикумы на основе всех исследованных полимерных кислот обладают достаточно высокой чувствительностью, которая повышается при увеличении молекулярной массы полимера.

Пример 3. Сравнительная характеристика диагностикумов на основе полимерной кислоты и хлорида хрома при определении бактериальных антител.

Для исследования влияния связывающего агента на чувствительность эритроцитарных диагностикумов готовят диагностикумы на основе дифтерийного микробного антигена (поверхностный белок 64 кД), лактобактерина (L. fermentum 90TC4) и бифидобактерина (В. bifidum 1).

В качестве связывающего агента применяют полиметакриловую кислоту (1000 кД, 0,8 мг/мл) и раствор СrС1₃ с концентрацией 0,3%, обычно применяемой при приготовлении эритроцитарных диагностикумов.

В качестве исследуемых объектов были использованы сыворотки пациентов ожогового центра (100 человек), новорожденных детей (40) и рожениц (40). В табл. 3 представлены данные по сывороткам только с положительной реакцией.

Использование в РПГА диагностикумов, приготовленных с использованием слабой полимерной кислоты, позволяет повысить в 2-8 раз чувствительность к антителам по сравнению с диагностикумами, приготовленными по известной методике с использованием хлорида хрома.

Литература
1. Кондрашина Н.Н., Берестень С.Ф., Шмелева Е.А. // А.с. СССР 1471857, 1988 г.

2. Каральник Б.В. Эритроцитарные реагенты в клинической иммунологии // Иммунология, 1995. 3. С.4-6.

3. Перадзе Т.В. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций. М.: Медицина, 1985. С.100-106.

Изобретение относится к медицине, а именно к производству эритроцитарных диагностикумов для реакции пассивной гемагглютинации для индикации антител к различным бактериям. Сущностью изобретения является проведение сенсибилизации эритроцитов барана в присутствии водных растворов слабых полимерных карбокси- и тетразолсодержащих кислот молекулярной массы 40-2000 кД, при концентрации водных растворов полимеров 0,2-0,8 мг/мл и объемном соотношении со взвесью эритроцитов 1:1. Техническим результатом является повышение чувствительности эритроцитарного диагностикума. 3 табл.

Способ приготовления эритроцитарного антигенного диагностикума путем сенсибилизации антигенами формалинизированных эритроцитов барана, отличающийся тем, что сенсибилизацию проводят в присутствии водных растворов слабых полимерных карбокси- и тетразолсодержащих кислот молекулярной массы 40-2000 кД, при этом концентрация водных растворов полимеров составляет 0,2-0,8 мг/мл при объемном соотношении со взвесью эритроцитов 1:1.