Способ получения эритроцитарного диагностикума Советский патент 1985 года по МПК A61K39/02 

СХ) X) Изобретение относится к биологии и медицине, преимущественно к иммунодиагностике и иммунохимии, и может быть использовано в производстве эритроцитарных диагностикумов различной специфичности и в научных исследованиях. Известен способ получения зритроцитарного диагностикума путем стабил зации эритроцитов, обработки их дубильной кислотой с последующей сенсибилизацией СП. Однако известный способ не позволяет получать однородные по качеству серии цнагностикумов. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения эрит. роцитарного диагностикума путем стабилизации эритроцитовj .обработки их дубильной кислотой с последующей сенсибилизацией, стабилизированные эритроциты и нестандартные диагности кумы,сенсибилизируют гомологичным сен ситином, предварительно обработаиньм сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации 0,15-0,80мг на 1 мл сен ситина. Способ выполняется следующим обра зом. Для приготовления эритроцитарных диагностнкумов (дифтерийного, столбнячного, трепонемного) могут быть ис пользованы стабилизированные эритроциты млекопитающих, птиц, не подвергавшихся ранее сенсибилизации белковыми или другими сенситинами, а также представляющие собой производственнЬтй брак (серии, слабые сразу после изготовления или утратившие активность, в результате хранения). :| .,.. . Ста:билизированные эритроциты подвергают последовательно процедуре отмывания (солевые растворы с детер, гентом, например твин-80, в концентрации от 1 : 10000 до 1:100000), затем обрабатьгеают веществами-присоедини теяями, например, дубильн.ой кислотой (от 1:10000 до 1:80000, преимущественно 1:20000), при 20-37°С в течение 20 Нин - 12. ч с последовательным отмыванием . 0,85%-ным раствором хло.рида натрия, рН 5,9-6,4, Подготовленные эритроциты суспенд руют в забуференном 1:100 (1/15 М фосфатного буфера) 0,85%-ном раство ре хлорида натрия при рН 5,9-6,4 до концентрации 2,5-5%. Эту взвесь соединяют с эффективной дозой сенситина, установленной в предварительном опыте, и смесь инкубируют при 37-45°С в течение 3-5 ч. По .истечении этого срока к каждой смеси добавляют формальдегид (до 1%-ной концентрации в объеме). Последующее отмывание сенсибилизированных эритроцитов и хранение готового препарата производят в присутствии 1%-ного формальдегида. .Готовые препараты испытьшают в РИГА со стандартной диагностической сывороткой для определения специфической активности. Сопоставление условий сесибилизации показало, что в пределах рН 5,9-6,4 обеспечивается наиболее эффективное присоединение сенситинов, например, дифтерийного, столбнячного ли сониката патогенных бледных трепонем, что проявляется наивысшими титрами соответствующих стандартных сывороток в РИГА. При этом эффективная концентрация сенситина обеспечивает достижение .максимальной активности полученного диагностикума как из 2,5%-ной так, из взвеси подготовленных эритроцитов, а получение трепонемного эритроцитарного диагностикума возможно при использовании полученного известным способом в экспериментальных условиях ультразвукового антигена в дозе 0,2 мг белка на 1 мл взвеси эритроцитов. Повышение дозы сенситина от 0,2 До 2 мг белка на 1 мл взвеси эритроцитов способствует повьшенйю активности днагнос икума на 2-3 разведения (1:2п), дальнейшее; же повк щение дозы белка снижает активность, полученной серии диагностикума. Кроме того, обработка веществами-присоединителями (например, дубильной КИСЛОТОЙ) может производиться с равным успехом в течение 30 мин 16(18) ч при 20-37°С, причем сенситин перед присоединением к подготовленным эритроцитам обрабатывают сульфосалициловой кислотой в дозе, обеспечивакядей стойкую опалесцендию конкретного белкового коллоида. li р им е р 1. Для приготоапения дифтерийного или столбнячного зритроцитарных диагностикумов формалинизированные эритроциты бара1на не подвергавшиеся ранее сенсибилизации, п следовательно отмывают 0,85%-ным ра вором хлорида натрия, затем - раств ром детергента (например, твина-80) и снова 0,85%-ным раствором хлорида натрия. Полученный осадок ресуспенд руют и соединяют с раствором глютар вого альдегида. После контакта осад ресуспендируют, осаждают дентрифуги рова:нием, осадок снова ресуспендиру ют, отмывают 0,85%-ным раствором хл рида натрия, вновь ресуспендируют в изотоническом растворе хлорида натрия, в котором содержится дубиль ная кислота. После взаимодействия эритроциты осаждают, осадок промывают 0,85%-ным раствором хлорида натрия с детергентом (твином-80), затем - без детергента. Сенситин прогревают при 65°С в течение 1 ч и быстро охлаждают при О С (вода со льдом) . Затем к нему по каплям постепе но добавляют l/J-ный раствор сульфосалициловой кислоты до появления стойкой опалесценции. Ресуспендированные эритроциты, подготовленные, как описано ранее, соединяют с обработанным гомологичным сенситином и помещают на 5 ч в водяную баню при 45°С. По истечении этого срока к каждой смеси добавляют формальдегид до 1%-ной концентрации в объеме. Последующее отмывание сенсибилизированных эритроцитов и хранение готового препарата производится в присутствии 1%-ного формальдегида. Пример 2. Для приготовления дифтерийного или столбнячного эрйтроцитарных диагностикумов формалинизированные эритроциты барана, paHeie подвергавшиеся сенсибилизации .дифтерийным или столбнячным анатокси нами, последовательно обрабатывают аналогично примеру 1 с использованием одноименного сенситина - дифтерийного или столбнячного. Прим ер 3. Для приготовления трепонемного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана, ранее не подвергавшиеся сенсибилизации, последовательно обрабатывают аналогично примерам 1 и 2 до этапа сенсибилизации. Полученный известным способом в зкспериментальных условиях -соникат патогенных бледных: трепонем стандарт j зируют по содержанию белка (метод 7884 Лоури) и применяют в качестве сенситина в концентрации, соответствующей 0,2 мг/мл на 1 мл 2,5%-ной взвеси подготовленных эритроцитов, взаимодействие с которым происходит в присутствии забуференного 1:100 (1/15 М фосфатного буфера) 0,85%ного раствора хлорида натрия (рН , 5,9) в течение 40 мин при 38°С. Пример 4. Для приготовления трепонемного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана, ранее не подвергавшиеся сенсибилизации, последовательно об- рабатывают, как в примерах 1 и 3, но для сенсибилизации используют сенситин с концентрацией белка 2 мг/мл на 1 мл 2,5%-нсй взвеси подготовленных эритроцитов (рН 6,4) в течение 45 мин при 38°С. Пример 5. Для приготовления трепонемного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана, ранее не подвергавшиеся сенсибилизации, последовательно обрабатывают как в примере 1 и 3, но для сенсибилизации Используют сенситин с концентрацией белка 0,2 мг/мл на 1 мл 5%-ной взвеси подготовленных эритроцитов (рН 6,4) в течение 40 мин при 37°С. Пример 6. Для приготовления трепонемного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана, ранее не подвергавшиеся сенсибилизации, последовательно обрабатывают, как в примере 1и 3, но для сенсибилизации используют сенситин с концентрацией белка 2мг/мл на 1 мл 5%-ной взвеси подготовленных эритроцитов (рН 5,9) в течение 30 мин при 38°С. По предлагаемому способу были подвергнуты повторной обработке 4 л 720 мл взвесей эритроцитов активностью 0,006-0,0015 АЕ/мл, 9Т% которых сохранили этот показатель в течение 12-18 месяцев. При сравнении 15 серий столбнячного анатоксина ранее можно было расчитывать на пригодность из них 2-3, а по новой технологии было получено 10 серий препарата с активностью 0,006 (2); 0,003 (3);0,0013 2); 0,008 (3) АЕ/мл. При сравнении 6 серий дифтерийных анатоксинов азного производства 25 оказались ригодными для получения высоко чувствительных цнагностикумов активностью 0,006-0,0002 АЕ/мл. Кроме того, 6 л 170 мл (650 серий) дифтерийного диагностикума и 5 л 950 мл (720 серий) столбнячного диагностикума бьшо получено с помощью воздей,ствия сульфосалициловой кислотой, причем активность препарата значительно превысила обычные показатели: 0.0008-0.0002 АЕ/мл (дифтерийный), 0,003-0,0008 АЕ/мл(столбнячный) Сроки сохранения активности для 89% ; серий превысили 12 месяцев. Эти коли чества препарата в условиях постановки РПГА микрометодом обеспечивают обследование более 300 тыс.человек. Применение сульфосалициловой кислоты позволило присоединить к стабилизированным эритроцитам через танин или глютаровый альдегид и танин ранее не присоединявшийся антиген - соникат патогенных бледных трепонем и приготовить 19 серий нового диагностического препарата. Титры антител в РПГА с. трепонемным эритроцитарным диагностикумом колеблются от 1:64 до 1:1024 при ранних формах сифилиса и от 1:2000 до 1:32000 при поздних формах этого заболевания. Диагностикум сохранял свою активност в течение 3 мес (срок наблюдения).

Пример 7. Для приготовления дифтерийного или столбнячного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана или нестандартные серии эритроцитарных диагноСтикумов последовательно обрабатывают, как в примере 1, с использованием одноименного .сенситина, предварительно обработанного сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации 0,15 мг на 1 мл сенситина.

И р и м е р 8. Для приготовления дифтерийного шш столбнячного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана или нестандартные серии эритроцитарных диагностикумов последовательно обрабатывают,, как в примере 1, с использованием Одноименного :сенситина,. предварительно обработанного сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации 0,2 мг на 1 мл сенситина.

П р им е р 9. Для приготовления дифтерийного или стоблнячного -эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана или нестандартные серии эритроцитарных диагностикумов последовательно обрабатывают, как в примере 1, с использованием одноименного сенситина, предварительно обработанного сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации 08 мг 1 мл сенситина.

Пример 10. Для приготовления дифтерийного или столбнячного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана или нестандартные серии эритроцитарных диагностикумов последовательно обрабатывают, как в примере 1, с использованием одноименного сенситина, предварительно обработанного сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации 0,85 мг на 1 мл сенситина.

По предлагаемому способу были сенсибилизированы формалинизированные эритроциты и нестандартные диагностикумы дифтерийным или столбнячным анатоксином, предварительно обработаннь1м сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации 0,15,85 мг на 1 мл анатоксина. Сопоставление полученных результатов дано в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ производства или экспериментального приготовления эритроцитарных диагностикумов повьшает возможности использования формалинизированных эритроцитов из числа отбракованных серий за счет повторной обработки, а также позволяет использовать в качестве сенситинов дополнительные серии коммерче.ских полуфабрикатов вакцин, сывороток для изготовления эритроцитарных диагностикумов высо кой специфичности и чувствительности..

Предлагаемый способ приготовления эритроцитарных диагностикумов обеспечивает по сравнению с известным способом возможность повторного использования формалинизированных эритроцитов (утилизации производственного брака и серий, вьтедших из срока годности) путем повторной их обработки веществрм-присоединителем и одноименным сенситином, использования в 6-8 раз большего чиса производственных образцов полуфабгрикатов сенситинов (например, анатоксинов) для получения эритроцитарных диагностикумов высокой специфичности и чувствительности за счет обработки белковых коллоидов сульфосалициловой кислотой, а также возможность присоединения к эритроцитам ряда веществ белковой природы, в том числе полученных в экспериментальных условиях, не сенсибилизирующих эритроциты известным способом, например сониката патогенных бледных трепонем, при изготовлении эритроцитарного диагностикума этой специфичности.

1. СПОСОБ ПОЛУг1ЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО даЛГНОСТИКУМА путем стабилизации эритроцитов, обработки их дубильной кислотой с последующей сенсибилизацией, от л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повьшения выхода целевого продукта, стабилизированные эритроциты и нестандартные диагностикумы сенсибилизируют гомологичным сенситином, предварительно обработанным сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации О,15-. , 0,8 мг на 1 мл сенситина.

формалинизированный 1080

эритроцитарный 225

нестандарт720ный 340

68,5 70,3 65,6 43,1

59,0 72,3 75,6 68,4 53,4