Способ получения эритроцитарного диагностикума для определения ортомиксо-и арбовирусов Советский патент 1993 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к вирусологии, а именно к способам разработки эффективных методов, предназначенных для уско- , ренной диагностики вирусных инфекций и индикации возбудителей в биологических материалах (клещи, комары, кровь больных), собранных в природных очагах особо опасных вирусных инфекций.

Цель изобретения - повышение эффективности сенсибилизации формалинизиро- ванных эритроцитов барана для получения высокочувствительных иммуноглобулино- вых препаратов и расширение возможности применения метода учреждения медицинского и ветеринарного профиля в связи с прекращением промышленного производства амидола.

Поставленная цель достигается путем замены коньюгата, снятого с производства, на доступный и дешевый препарат - метол, выпускаемый Львовским заводом Реактив. Отличительным признаком изобретения является использование в качестве конъюгата ранее не применяемого метола в концентрации 1,0% на дистиллированной воде, обеспечивающей высокую чувствительность и специфичность эритроцитар- ных диагностикумов, применяемых для индикации вирусов в биологических объектах окружающей среды.

Пример 1. Влияние концентрации метола на эффективность получения эрит- роцитарных диагностикумов.

К трем порциям 1,0 мл 5,0%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана добавляют 1,0 мл сенситина (кроличьей гипериммунной сыворотки или иммунной ас- цитной жидкости из расчета 1 мг/мл белка), затем вносят 1,0 мл свежеприготовленного водного раствора метола различной концентрации: 0,5%, 1,0% и 1,5%. Смесь инкубируют в водяной бане при температуре 53°С в течение 40 мин, периодически встряхивая.

00

о

ho ОНагруженные эритроциты дважды отмывают в 2-кратном объеме забуференного физи- ологического раствора рН 7,2 со стабилизатором (бычий сывороточный альбумин 0,1%-ной концентрации), Отмытые эритроциты суспендируют в вышеуказанном pacfeope до 0,5%-ной взвеси. Затем по общепринятой методике ставят РИГА, используя панели микротитратора Такачи. Панели оставляют при комнатной температуре (18-22°С) до оседания эритроцитов в контролях. Показано, что максимальное количество выявляемого антигена вирусов гриппа и арбовирусов в исследуемом ма- териал е достигается с эритроцитарными диагностйкумами, приготовленными при- сенсибилизации в присутствии метола в 1,0%-ной концентрации. Использование 0,5%-ной и 1,5%-ной концентрации приводило к снижению титра выявляемого антигена.

Влияние концентрации метола на способ получения эритроцитарных диагности- кумов отражено в табл. 1.

П р и м е р 2. Влияние концентрации взвеси эритроцитов на эффективность их сенсибилизации при помощи метола.

К трем порциям по 1,0 мл различной взвеси формалинизированных эритроцитов барана: 1,0%, 5.0% и 10,0%, добавляют 1,0 мл сенситина и 1,0 мл свежеприготовленного 1,0%-ного водного раствора метола. Смесь инкубируют в водяной бане при температуре 53°С в течение 40 мин, периодически встряхивая. Затем также как в примере 1.

Результаты, представленные в табл.2, показывают, что наибольшая чувствительность РИГА проявляется с диагностйкумами, приготовленными на основе 5,0%-ной взвеси эритроцитов. Взвесь эритроцитов 1,0 и 10%-ной концентрации приводила к снижению показателей выявляемого вирусного антигена.

Влияние концентрации взвеси эритроцитов на эффективность их сенсибилизации при помощи метола отражено в табл. 2.

П р и м е р 3. Влияние температуры инкубации на эффективность сенсибилизации эритроцитов в присутствии метола.

К трем порциям 1,0 мл 5,0%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана добавляют 1,0 мл сенситина, затем вносят 1,0 мл свежеприготовленного 1,0%-ного раствора метола. Смесь инкубируют в тече ние 40 мин при различных температурах - 45, 53 и 60°С, периодически встряхивая. Далее как в примере 1.

Как свидетельствуют результаты, представленные в табл.3, сенсибилизации эритроцитов иммунными противовирусными

препаратами имела место при всех испытанных режимах, однако наиболее высокие показатели РИГА получены при температуре инкубации 53°С.

Влияние температуры инкубации на эффективность сенсибилизации эритроцитов в присутствии метола отражено в табл. 3.

П р и м е р 4. Влияние продолжительности сенсибилизации на эффективность получения диагностикумов.

К трем порциям 1,0 мл 5,0%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана добавляют 1,0 мл сенситина, затем - 1,0 мл свежеприготовленного 1,0%-ного водного

5 раствора метола. Смесь инкубируют при

температуре 53°С в течение 30, 40 и 50 мин.

Результаты, представленные в табл.4,

свидетельствуют с незначительной разнице

влияния экспозиции на чувствительность

0 полученных диагностикумов, однако визуально наиболее четкое оседание эритроцитов в контролях получены при сенсибилизации в течение 40 мин.

Влияние продолжительности сенсиби5 лизации на эффективность получения диа - гностикумов отражено в табл. 4.

Т) р им е р 5. Проверка специфичности эритроцитарных диагностикумов, полученных по предлагаемому способу,

0 Эритроцитарные диагностикумы для индикации вирусов гриппа и арбовирусов готовили следующим способом: к 1,0 мл 5,0%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана добавляют 1,0 мл сен5 ситина (1 мг/мл белка), затем вносят 1,0 мл свежеприготовленного 1,0%-ного водного раствора метола. Смесь инкубируют в водяной бане при температуре 53°С в течение 40 мин, периодически встряхивая. Нагру0 женные эритроциты дважды отмывают в 2-кратном объеме забуференного физиологического раствора рН 7,2 со стабилизатором (бычий сывороточный альбумин 0,1%-ной концентрации). Отмытые эритро5 циты суспендируют в вышеуказанном растворе до 0,5%-ной взвеси. Затем по общепринятой методике ставят РИГА.

Указанным примером в табл.5 доказана специфичность эритроцитарных диагности0 кумов, приготовленных по предлагаемому способу. Эритроцитарные диагностикумы взаимодействовали только с гомологичными вирусными антигенами и не реагировали с гетерологичными.

5 Специфичность эритроцитарных диагностикумов, приготовленных предлагаемым способом отражена в табл. 5.

П р и м е р 6. Проверка эффективности и преимущества предлагаемого способа получения эритроцитарных диагностикумов.

Эритроцитарные диагностикумы готовили по известному и предложенным методами,

1. Сенсибилизация формалинизирован- ных эритроцитов барана сенситином по известному методу с помощью амидола. Смешивают осадок от 0,4 мл 20%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана с 0,2 мл раствора сенситина и с 0,2 мл свежеприготовленного 0,4%-ного водного раствора амидола. Смесь инкубируют в течение 30 мин при 53°С.с периодическим встряхиванием.

2. Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов барана сенситином по предлагаемому методу. Смешивают 1,0 мл 5%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана с 1,0 мл сенситина и 1,0 мл свежеприготовленного 5,0%-ного водного раствора метола. Смесь инкубируют в течение 40 мин при 53°С периодическим встряхиванием.

Результаты сравнительной индикации вирусного антигена с диагностикумами, приготовленным по известному и предлагаемому методу, показали значительное преимущество в чувствительности предлагаемого способа и возможности широкого применения метода в отличие от известного, ограничение которого связано со снятием с производства амидола.

В табл.6 показана высокая эффективность (в 6-8 раз) эритроцитарных диагностикумов, приготовленных по предлагаемому методу, в сравнении с известным (с помощью амидола).

Сравнительная оценка чувствительности эритроцитарных диагностикумов, приготовленных по известному способу и предлагаемому способу, дана в табл. 6.

Пример. Результаты практического применения эритроцитарных диагностикумов, приготовленных по предлагаемому способу.

Эритроцитарные диагностикумы, приготовленные по предлагаемому способу, были испытаны при исследовании проб клещей доставленных работниками Обл.СЭС

из природных очагов крымской геморрагической лихорадки, расположенных на территории Казахстана.

Результаты обнаружения антигена вируса крымской геморрагической лихорадки

с помощью эритроцитарных диагностикумов, представленные в табл.7, показали явное преимущество применения препаратов, приготовленных по предлагаемому способу.

Выявление вирусного антигена с помощью эритроцитарных диагностикумов, приготовленных различными методами, дано в табл. 7.

По мнению специалистов головных СЭС

предлагаемые Эритроцитарные диагностикумы высоко чувствительны и специфичны. Реакция с указанными препаратами легко воспроизводима и может быть применена в условиях быстрого развертывания лаборатории в полевых условиях.

Таким образом, преимущество предлагаемого способа получения эритроцитарных диагностикумов заключается в высокой их чувствительности при экономичности,

простоте и воспроизводимости методики, что позволяет широко использовать указанный способ в практических учреждениях медицинского и ветеринарного профиля. Формула изобретения

Способ получения эритроцитарного ди- агностикума для определения ортомиксо- и арбовирусов путем сенсибилизации эритроцитов специфическими антителами в присутствии коньюгирующего агента, о т л и ч аю щ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности диагностикума, используют в качестве конъюгата 1,0%-ный водный раствор метола.

Использование: индикация и идентификация штаммов вирусов, принадлежащих к арбовирусам и семейству ортомиксовиру- сов. Цель: повышение чувствительности диагностикума при выявлении вирусных антигенов. Сущность изобретения: при сенсибилизации эритроцитов в качестве нового коньюгирующего агента используют водный раствор метола в 1,0%-ной концентрации. Сенсибилизацию осуществляют при 53°С в течение 40 мин с суспендированием нагруженных антителами эритроцитов в за- ,буференный физиологический раствор (рН 7,2) со стабилизатором (1 %-ный бычий альбумин). Положительный эффект: способ хорошо воспроизводим, экономичен и по чувствительности в 6-8 раз превосходит метод приготовления антительных эритроци- тарных диагностикумов при помощи амидола. 7 табл.

Примечание. Здесь и в табл. 1-6 титры антигенов приведены в обратных величинах среднегеометрических титров.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6

Таблица 7