Область техники
Настоящее изобретение относится к способу диагностики метаболических костных заболеваний, особенно остеопороза и заболеваний суставов. Кроме того, настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, используемым в диагностике, и наборам для диагностики, использующим моноклональные антитела. Настоящее изобретение может использоваться в качестве способа диагностики метаболических костных заболеваний, особенно остеопороза и заболеваний суставов, или в качестве реагентов количественного определения для их использования в научных исследованиях.
Предшествующий уровень техники
Костный метаболизм зависит от общей активности остеобластов, которые образуют кость, и остеокластов, которые вызывают резорбцию кости. У здорового взрослого человека удерживается баланс образования кости и резорбции кости и поддерживается постоянная костная масса. Считается, что метаболические костные заболевания развиваются при утрате этого баланса. В качестве метаболических костных заболеваний известны остеопороз, гиперкальцемия, болезнь Педжета, почечная остеодистрофия, ревматоидный артрит, остеоартрит и т.д. Остеопороз представляет собой типичный пример метаболического костного заболевания. Считается, что остеопороз является заболеванием, сопровождающимся снижением костной массы и проявляющимся такими симптомами, как перелом костей или костная боль (люмбаго и/или боль в спине), вызванными уменьшением костной массы.
Уменьшение костной массы вызвано различными причинами, такими как старение после периода роста, метастазами в кости или гипертиреозом. В качестве способа диагностики остеопороза минеральная костная масса и/или плотность костей определяются с помощью прибора для измерения физической костной массы, такого как рентгеновская дифракция (метод MD), DPA (двойная фотонная абсорпциометрия), DEXA (двух-энергетическая рентгеновская абсорпциометрия), CXD (компьютерная рентгеновская денситометрия) и низкочастотные ультразвуковые волны. В зависимости от технического уровня критерий остеопороза при использовании этих диагностических методов постоянно корригируется.
Риск перелома костей в будущем может надежно прогнозироваться с помощью уменьшения костной минеральной массы и/или плотности кости. Однако уменьшение костной минеральной массы и/или плотности кости является не единственным фактором риска перелома костей, и считается, что риск перелома костей увеличивается под влиянием феноменов, сопровождающих старение, таких как снижение эластичности коллагеновых волокон, качественное ухудшение костной структуры, сниженная мышечная сила. В настоящее время, за исключением сниженной мышечной силы, факторы риска не могут определяться неинвазивно, а неинвазивное измерение представляет собой важную задачу, решение которой предстоит в будущем. Кроме того, уменьшение костной минеральной массы и/или плотности кости как раз является результатом утраты баланса костного метаболизма и не является причиной заболевания и ее диагностическим показателем.
В качестве дополнения, перекрывающего эти дефекты измерения плотности костей, для диагностики заболевания испытывалось применение измерения уровня сыворотки крови и/или выделения с мочой факторов, регулирующих костный метаболизм (паратгормон (РТН), активной формы витамина D3, кальцитотина и т.д. ), различных видов факторов, высвобождаемых из костной ткани, сопутствующих костной перестройке (костные щелочные фосфотазы, кислая фосфотаза, пиридинолин, дезоксипиридинолин, пептид проколлагена 1 типа, остеокальцин и т.д.). Эти факторы должны были бы отражать состояние костного метаболизма во время измерения и, как ожидается, являются ранним показателем остеопороза и его степени. Однако что касается этих маркеров костного метаболизма, еще имеются проблемы, например они не выражают местные изменения костного метаболизма, на них могут воздействовать пищевой рацион или циркадный ритм так, что изменения уровня указанных выше факторов необязательно отражают специфические изменения костного метаболизма. На основании этих ситуаций, ожидается разработка высоко специфичного и точного измерения уровня нового маркера, участвующего в костном метаболизме, для установления способов подходящей диагностики, профилактики и лечения различных видов метаболических костных заболеваний, таких как остеопороз.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что в культуральной среде легочных фибробластов плода человека IMR-90 (АТСС CCL186) присутствовал фактор, ингибирующий остеокластогенез (OCTF), и успешно выделили его. Кроме того, авторы изобретения также успешно провели клонирование цДНК, кодирующей этот белок, и подтвердили возможность ее использования в качестве средства улучшения костного метаболизма с помощью оценки фармакологического эффекта рекомбинантного OCIF (rOCIF) in vitro и in vivo (WО 96/26217). Кроме того, авторы настоящего изобретения в различных видах экспериментальных моделей метаболических костных заболеваний подтвердили, что введение rOCTF значительно улучшало плотность кости и прочность кости, и что введение большого количества rOCIF также значительно увеличивало костную массу и костный объем у здоровых животных без каких-либо побочных эффектов при исследовании различных органов, кроме костной ткани, гаматологических и клинических биохимических показателей и гемолитических клеток. На основании результатов экспериментов in vivo было установлено, что OCIF представляет собой цитокин с высокой тканевой специфичностью, оказывающий действие только на костную ткань. Кроме того, авторы настоящего изобретения подтвердили, что в клетках животных OCIF секретирсзался в гомодимерной форме OCIF с молекулярным весом приблизительно 120 кДа, и гомодимерный тип OCIF под воздействием протеазы превращался в мономерную форму OCIF с молекулярным весом приблизительно 60 кДа. И поскольку было подтверждено присутствие обоих типов OCIF в культуральной среде линии клеток человека (Tsuda et ai.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 234, 137-142) (1997), ожидается, что в биологической жидкости млекопитающих, включая человека, присутствуют оба типа OCIF.
Соответственно для выяснения того, может ли OCIF быть новым маркером костного метаболизма или нет, необходимо точно изучить корреляцию между различными видами метаболических костных заболеваний и уровнем каждого типа OCIF или общей концентрацией обоих типов OCIF у одного из пациентов с метаболическими костными заболеваниями. Поэтому для указанной выше цели требуются антитело, одинаково распознающее оба типа OCIF, и антитело, распознающее только гомодимер. К настоящему времени еще не было получено ни одно моноклональное антитело против OCIF, имеющее такие признаки.
Раскрытие изобретения
Рассматривая эти ситуации, авторы настоящего изобретения тщательно исследовали и обнаружили моноклональные антитела с весьма высоким сродством (их константа диссоциации была менее 10-9 М), одинаково распознающие и мономерный, и гомодимерный типы OCIF, и моноклональные антитела, специфично распознающие гомодимерный тип OCIF. Кроме того, используя эти антитела, авторы изобретения создали высоко чувствительный набор для твердофазного иммуноферментного количественного анализа (сэндвич-ELISA). В результате измерения сывороточной концентрации OCIF с использованием сэндвич-ELISA у взрослых людей молодого возраста, пожилых людей, больных с остеопорозом, гипертиреозом и различными видами заболеваний, включая рак, была обнаружена высокая обратная корреляция между концентрацией OCIF в сыворотке крови и костной плотностью. В результате измерения концентрации OCIF в синовиальной жидкости больных с артрозами, такими как ревматоидный артрит, остеоартрит, травма и подагра и т.д., было обнаружено, что концентрация OCIF в синовиальной жидкости пациентов с прогрессирующей деструкцией суставов была достоверно низкой.
Было обнаружено, что OCIF может использоваться в качестве нового диагностического маркера метаболических костных заболеваний, потому что определение уровня OCIF в сыворотке и синовиальной жидкости с помощью настоящего сэндвич-ELISA обеспечивает возможность точного прогнозирования соответственно динамики изменения костной плотности и прогрессирования деструкции суставов и, таким образом, прогнозирования уменьшения костной массы и деструкции суставов на ранней стадии этих костных заболеваний. Соответственно задачей настоящего изобретения является предоставление способа диагностики метаболических костных заболеваний, в частности остеопороза и деструкции суставов, вызванной ревматическим процессом, отличающегося определением концентрации человеческого фактора, ингибирующего остеокластогенез, и используемых здесь моноклональных антител, и набором для измерения OCIF с использованием антител.
Настоящее изобретение относится к способу диагностики метаболических костных заболеваний с помощью определения концентрации фактора, ингибирующего остеокластогенез (OCIF) в образце биологической жидкости.
Диагностика настоящего изобретения может особенно использоваться для диагностики остеопороза и артроза. В качестве биологической жидкости может использоваться сыворотка крови или синовиальная жидкость. Диагностика остеопороза может проводиться с помощью определения концентрации OCIF в сыворотке крови, а диагностика артроза может проводиться с помощью определения концентрации OCIF в синовиальной жидкости. Диагностика настоящего изобретения может особенно использоваться для диагностики остеопороза. В качестве биологической жидкости может использоваться сыворотка крови или синовиальная жидкость.
Кроме того, настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, используемых при диагностике. В качестве моноклональных антител могут, например, использоваться моноклональное антитело, одинаково распознающее и мономерный, и димерный типы OCIF, и антитело, избирательно распознающее только димерный тип OCIF. Кроме того, моноклональные антитела включают антитела с высокой аффинностью, распознающие другой эпитоп и имеющие константу диссоциации менее 2•10-7 М с антигеном.
Кроме того, настоящее изобретение относится к набору для определения содержания OCIF, включающему эти моноклональные антитела. Способ диагностики настоящего изобретения может осуществляться с помощью взятия биологической жидкости, такой как кровь (сыворотка), синовиальная жидкость, из объекта диагностики и измерения содержания OCIF с помощью набора для определения уровня OCIF с использованием указанных выше моноклональных антител.
Моноклональные антитела могут быть получены с помошью способа, описанного ниже. То есть в качестве антигена для иммунизации, являющейся необходимой для получения моноклонального антитела против OCIF, может также использоваться человеческий OCIF IMR-90, выделенный из культуральной среды легочных фибробластов плода человека в соответствии со способом, описанным в WO 96/26217. Может также использоваться рекомбинантный человеческий OCIF. Рекомбинантный человеческий OCIF может быть получен обычным путем с помощью вставки цДНК человеческого OCIF в вектор экспрессии и экспрессирования его в клетку животного происхождения, такую как клетка СНО, клетка ВНК и клетка Namalwa и т.д. или клетка насекомого с последующей очисткой. В соответствии со способом Tsuda et al. (Biochem. Biophys. Res. Common. 234, 137-142 (1997)) мономерный и димерный типы OCIF могут быть соответственно очищены с помощью хроматографии с обращенной фазой. Далее оба типа OCIF могут быть соответственно очищены с помощью комбинации SP-сефарозы, сульфатированного целлюрофина и колоночной хроматографии с ресурсом S вместо хроматографии с обращенной фазой. Для получения гибридомы клетки селезенки, полученные от млекопитающего, иммунизированного антигеном, или лимфоциты, иммунизированные in vitro, могут сливаться с линией клеток миеломы. С использованием в качестве антигенов высоко очищенных мономерных и гомодимерных типов OCIF и культуральной среды указанной выше гибридсмы может быть установлена клеточная линия с помощью скрининга гибридомы, вырабатывающей антитело, одинаково распознающее оба типа OCIF, или антитело, специфично распознающее только гомодимерный тип OCIF с последующим клонированием гибридомы. Далее с помощью культивирования установленной и устойчивой гибридомы могут быть получены целевые антитела.
Хотя при иммунизации млекопитающего для получения гибридомы нет ограничения вида животного, в целом используются мелкие животные, такие как мыши или крысы. При иммунизации OCIF в качестве антигена может разводиться в физиологическом солевом растворе до подходящей концентрации, и его раствор может вводиться внутривенно или внутрибрюшинно, при необходимости вместе с ним животному может вводиться полный адъювант Фрейнда, в целом 3-4 раза с интервалами в 1-2 нед. Для облегчения получения целевого моноклонального антитела и максимально возможно повысить титр OCIF в крови после получения имеющего высокую аффинность моноклонального антитела против OCIF (константа диссоциации менее 2•10-7 М) может проводиться иммунизация 3 раза с интервалами в 1 нед. и далее еще 4 раза с интервалами в 1 нед. может проводиться иммунизация антигеном вместе с неполным адъювантом Фрейнда. Через 3 дня после последней иммунизации иммунизированных описанным выше образом животных забивают и удаляют селезенку. В качестве иммунизированных клеток могут использоваться спленоциты. В качестве клеток миеломы могут, например, использоваться линии клеток, полученные от мышей для гибридизации с иммунизированными клетками р3/•63-Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2/0, FO, р3•63 Ag8, 653 и S194. Далее в качестве клеточной линии, полученной от крыс, может использоваться, например, R-210.
Для продукции человеческого антитела лимфоциты человека могут иммунизироваться in vitro и может происходить их клеточное слияние с клетками миоломы человека или клеточной линией лимфоцитов человека, трансформированной вирусом Эпштейна-Барра. Слияние иммунизированных клеток с клеточной линией миеломы может проводиться в соответствии с обычным способом, например способом Koehler и Milstein et al. (Koehier et al., Nature, 256, 495-497, 1975), но может также использоваться электрический импульсный способ. Иммунизированные лимфоциты и клеточная линия миеломы могут смешиваться с обычной скоростью по количеству клеток, и для проведения слияний клеток в обычно используемые культуральные среды может добавляться полиэтиленгликоль (не включая сыворотку плода теленка, FCS), и слившиеся клетки (гибридома) могут отбираться с помощью культивирования в селективной среде HAT, содержащей FCS.
Отбор гибридом, продуцирующих моноклональное антитело, одинаково распознающее и мономерный, и гомодимерный типы OCIF, и антитело, избирательно распознающее гомодимерный тип OCIF, может проводиться в соответствии со способом выявления антител, такого как твердофазный иммуноферментный анализ (ELI3A), количественное определение бляшек, способ Ouchterlony или способ агглютинации. Методы ELISA с использованием очищенных мономерных и гомодимерных типов OCIF могут очень легко и точно выявить исследуемое антитело. Было трудно получить антитело с высоким аффинитетом (константа диссоциации была менее 2•10-7 М) с помощью обычного твердофазного ELI3A. То есть когда используется обычная твердая фаза, культуральная среда гибридомы (50-100 мкл) помещается в 96-ячеечные иммунные планшеты, покрытые антигеном (Nunc) для проведения первичной реакции, а затем для проведения вторичной реакции добавляется антитело против мышиного IgG, меченого ферментной меткой, например пероксидазой (POD). Затем для завершения ферментативной реакции в каждую ячейку в иммунном планшете добавляется раствор ферментного субстрата (50-100 мкл), и в каждой ячейке определяется оптическое поглощение. Культуральная среда гибридомы, проявляющая высокую оптическую плотность, может считаться не только продуцирующей большое количество антитела с низкой аффинностью, но также продуцирующей антитело с высокой аффинностью, даже если продуктивность антитела является низкой. Невозможно определить, что происходит в действительности.
Поэтому в настоящем изобретении для распознавания гибридомы, продуцирующей антитело с высокой аффинностью, было проведено усовершенствование обычного твердофазного ELISA, как описано ниже. То есть в каждую из 96 ячеек иммунной планшеты, покрытых антигеном, добавляют человечью или бычью сыворотку с последующим добавлением в каждую ячейку небольшого количества культуральной среды гибридомы для продолжения первичной реакции в условиях присутствия приблизительно 80-90% сыворотки. В таких условиях могут быть исключены гибридомы, продуцирующие антитела с низким сродством к антигену, даже если выработка антител является высокой. Таким образом, модифицированный твердофазный ELISA обеспечил возможность избирательного скрининга с помощью гибридом, продуцирующих антитела с высоким сродством к антигену. С помощью усовершенствованного твердофазного ELISA могут быть отобраны гибридомы, продуцирующие антитела, которые одинаково распознают и мономерный, и гомодимерный типы OCIF в качестве антигенов, и другие гибридомы, продуцирующие антитела, которые специфично распознают гомодимерный тип OCIF, и с помощью клонирования 3-5 раз методом ограниченного разведения может быть установлена гибридома, продуцирующая каждое антитело. Установленная таким образом гибридома может субкультивироваться с помощью обычно используемого способа культивирования и если необходимо сохраняться с помощью замораживания. Гибридома может культивироваться с помощью обычного способа, и антитело может выделяться из культуральной среды. Далее антитело может выделяться из асцитической жидкости, полученной у млекопитающего, которому гибридома имплантирована внутрибрюшинно. Антитело в культуральной среде или в асцитической жидкости может очищаться с помощью обычного метода очистки антител, такого как высаливание, ионообменная или гель-проникающая хроматография, хроматография по сродству с белком А или G.
Полученное антитело представляет собой антитело, одинаково распознающее и мономерный, и гомодимерный типы OCIF, и антитело, избирательно распознающее OCIF гомодимерного типа. Каждое антитело может использоваться для измерения количества OCIF (мономерный тип OCIF + гомодимерный тип OCIF) и колличества гомодимерного типа OCIF. Эти антитела могут метиться радиоактивным изотопом или ферментом и использоваться при радиоиммуноанализе (RIA) или твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA) для определения количества OCIF (количество мономерного типа OCIF + гомодимерного типа OCIF) или количества только гомодимерного типа OCIF. В частности антитело настоящего изобретения, избирательно распознающее гомодимерный тип OCIF, может прояснить, что в мономерном и гомодимерном типах OCIF существует различный эпитоп (эпитопы), и распознать эпитоп, присутствующий только в гомодимерном типе OCIF, и отсутствующий в мономерном типе OCIF.
Количество OCIF и количество гомодимерного типа OCIF может определяться с помощью использования антитела, полученного с помощью настоящего изобретения и одинаково распознающего и мономерный, и гомодимерный типы OCIF, в качестве твердофазного антитела и с помощью использования радиоактивного изотопа или меченого ферментом использования антитела, одинаково распознающего и мономерный, и гомодимерный типы OCIF, и антитела, избирательно распознающего только гомодимерный тип OCIF соответственно с радиоактивным изотопом или ферментом в качестве вторичного антитела.
Далее, если в качестве твердофазного антитела желательно определение только количества гомодимерного типа OCIF, может также использоваться антитело 0I-26, избирательно распознающее гомодимерный тип OCIF, как описано в примере 6 (табл. 1), а в качестве меченого антитела - антитела 0I-19 или 0I-4, одинаково распознающие и мономерный, и гомодимерный типы OCIF. С помощью использования этих систем количественного анализа можно определить количество OCIF или только количество гомодимерного типа OCIF в биологических жидкостях, таких как кровь, моча и синовиальная жидкость и т.д. или в среде клеточной культуры.
Набор настоящего изобретения включает (i) любое из первичного антитела и вторичного антитела, которое представляет собой антитело 0I-19 или антитело 0I-26 и (ii) другое антитело, которое представляет собой антитело 0I-4, и обычную комбинацию реагентов, используемых при обычном сэндвич-методе. То есть набор для иммунологического анализа включает (1) первичное антитело, иммобилизованное на нерастворимом носителе, (2) меченое вторичное антитело, (3) солюбилизатор, (4) средство для промывания и (5) субстрат и реагент, останавливающий реакцию, для определения ферментной активности в случае ферментного мечения. В качестве нерастворимого носителя могут, например, использоваться полистирол, полиэтилен, полипропилен, полиэфир, полиакрилонитрил, фторированная смола, поперечно сшитый декстран, полисахарид, латекс, латексный полимер, содержащий магнитные частицы, покрытые металлом, и т.д., бумага, стекло, металл, агароза и комбинация указанных выше носителей. В качестве формы нерастворимого носителя может использоваться лоток, сфера, волокно, пластинка, контейнер, ячейка, пробирка, пористый фильтр. Далее в качестве материалов метки, применяемых для получения меченого антитела, могут преимущественно использоваться ферменты, флюоресцентные вещества, люминесцентные вещества и радиоактивные вещества. В качестве ферментов могут использоваться пероксидаза, щелочная фосфотаза, β-D-галактозидаза, глюкозо-оксидаза, малатдегидрогеназа, глюкозо-6-фюсфатдегидрогеназа, инвертаза. В качестве флюоресцентных веществ могут использоваться флюоресцеин изотиоцианат и фикобилипротеин. В качестве люминесцентных веществ могут использоваться изолюцинол и люцигенин. И в качестве радиоактивных веществ могут, например, использоваться I125, I131, С14, Н3. Приведенные выше примеры являются только примерами, и могут использоваться любые вещества, используемые при иммунологическом анализе.
Когда материалом метки является фермент, для определения ферментной активности может использоваться субстрат и при необходимости проявитель цвета. Если в качестве фермента используется пероксидаза, в качестве субстрата используется Н2О2, а в качестве проявителя цвета могут использоваться аммониевая соль 2,2'-азиноди[3-этилбензотиазолин сульфоновой кислоты] (ABTS), 5-аминосалициловая кислота, о-фенилендиамин, 4-аминоантипирин, 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, гомоцевадиллиновая кислота и тирамин.
И когда в качестве фермента используется щелочная фосфатаза, в качестве субстрата могут использоваться о-нитрофенилфосфат и 4-метилумбеллиферилфосфат. Когда в качестве фермента используется β-D-галактозидаза, в качестве субстрата могут использоваться флюоресцеин-ди-(β-D-галактопиранозид), 4-метилумбеллиферил-β-D-галактопиранозид.
В качестве солюбилизатора, раскрытого в (3) указанного выше набора для иммунологического анализа, может использоваться любой солюбилизатор, обычно применяемый при иммунологическом анализе, например, фосфатный буферный раствор, буферный раствор трис-НСl, буферный раствор уксусной кислоты с рН 6,0-8,0, которые могут рассматриваться в качестве подходящих примеров. Далее в качестве средства для промывания, раскрытого в (4), может использоваться любое средство, обычно применяемое при иммунологическом анализе. Например, в качестве примера можно привести физиологический солевой раствор, фосфатный буферный раствор, буферный раствор трис-НСl и их смешанный раствор. Далее в указанное выше средство для промывания может добавляться неионный сурфактант, такой как Triton Х-100, Tween 20 или Brij 35, или может добавляться ионный сурфактант, такой как додецилсульфат натрия (SDS) или CHAPS.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана стандартная кривая ELISA при использовании антитела 0I-19 и антитела 0I-4 в примере 7.
[Расшифровка обозначений]
°: гомодимерный тип OCIF
•: мономерный тип OCIF
На фиг. 2 показана калибровка ELISA при использовании антитела 0I-26 и антитела 0I-4 в примере 7.
[Расшифровка обозначений]
°: гомодимерный тип OCIF
•: мономерный тип OCIF
На фиг.3 показана концентрация OCIF в крови у пациентов с остеопорозом и у здоровых лиц в примере 8.
На фиг. 4 показана корреляция между концентрацией пиридинолина в моче и концентрацией OCIF в крови в примере 8.
На фиг. 5 показана корреляция между концентрацией дезоксипиридинолина в моче и концентрацией OCIF в крови в примере 8.
На фиг.6 показана концентрация OCIF в синовиальной жидкости пациентов с артроцеле в примере 9.
[Расшифровка обозначений]
РА - ревматоидный артрит; ОА - остеоартрит; Тр - травма; П - подагра.
Предпочтительный вариант реализации изобретения
Настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью иллюстрации примеров. Однако это просто примеры, и диапазон притязаний настоящего изобретения не будет ограничен этими примерами.
Пример 1 Очистка мономерного типа OCIF или гомодимерного типа OCIF в качестве антигена
Продуцирующие ОСIF клетки СHО, описанные в WO 96/26217, засевают в среду EX-CELL 301 (JRH Bioscience) при плотности клеток 1•105 клеток/мл и культивируют при 37oС в течение 7 дней с использованием сосуда для клеточной культуры (контейнер емкостью 2 л). В полученную культуральную среду добавляют CHAPS (3-[(3-холамидопропил)-диметиламмоний-] -1-пропансульфонат, Sigma) до концентрации 0,1%. После доведения рН среды; до 6,0 с помощью уксусной кислоты среду фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм (милидиск, Milliроrе). Культуральную среду наносят на колонку SP сефарозы
для высокоэффективной хроматографии (2,6•10 см, Pharmacia), уравновешенную 50 мМ буферного раствора бис-трис-HCl, содержащего 0,1% CHAPS. После промывания колонки тем же буферным раствором колонку в течение 100 мин проявляют с линейным градиентом от 0 до 1 М NaCl при скорости потока 4 мл/мин и элюат разделяют на фракции по 8 мл каждая. В соответствии со способом, описанным в WО 96/26217, определяют активность OCIF в каждой фракции так, что получают фракцию OCIF. После 10-кратного разведения фракции OCIF 50 мМ буферным раствором бис-трис-НСl с рН 6,0, содержащим 0,1% CHAPS, ее наносят на сульфатноцеллуролфиновую колонку (2,6•10 см, Seikagaku-koqyo), уравновешенную 50 мМ буферного раствора бис-трис-НСl с рН 6,0. Колонку промывают 50 мМ буферным раствором бис-трис-НСl при рН 6,0, содержащим 0,1% CHAPS, с последующим проявлением в течение 100 мин с линейным градиентом от 0 до 1,5 М NaCI при скорости потока 4 мл/мин и разделяют на фракции по 8 мл каждая. Как описано выше, определяют активность OCIF в каждой фракции.
Часть каждой фракции подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле с SDS в невосстанавливающих условиях и собирают фракции, имеющие активность OCIF и молекулярный вес 60 кДа, и пул OCIF называют 1 фракцией. Кроме того, в невосстанавливающих условиях собирают фракции, имеющие активность OCIF и молекулярный вес 120 кДа, и пул OCIF называют 2 фракцией. После 10-кратного разведения соответственно 1 фракции и 2 фракции 50 мМ буферным раствором в трис-HCl с рН 7,0, содержащим 0,1% CHAPS, каждую фракцию наносят на колонку RESOURCE S (0,64•3 см, Pharmacia), уравновешенную 50 мМ буферным раствором трис-НCl при рН 7,0, содержащего 0,1% CHAPS. После промывания колонки 10 мМ буфером фосфата натрия с рН 7,0, содержащим 0,01% полисорбат, колонку проявляют в течение 15 мин с линейным градиентом от 0 до 0,6 М NaCl при скорости потока 1 мл/мин и разделяют на фракции по 0,5 мл каждая. Как описано выше, определяют активность OCIF в каждой из 1 и 2 фракций, собирают фракции, имеющие активность OCIF так, что получают мономерный тип OCIF из 1 фракции и гомодимерный тип OCIF из 2 фракции.
Пример 2
Иммунизация мышей и получение гибридомы
Мономерный и гомодимерный типы OCIF, очищенные как описано в примере 1, растворяют в физиологическом солевом растворе до концентрации соответственно 100 мкг/мл. В каждую смесь, содержащую одинаковое количество обоих типов OCIF и приготовленную как описано выше, добавляют такой же объем полного адъюванта Фрейнда. Смешанные растворы хорошо эмульсифицируют и для иммунизации мышей линии Balb/c вводят им 3 раза с интервалами в 1 нед. внутрибрюшинно (200 мкл/ мышь). Затем в смесь, содержащую 25 мкг/мл каждого из обоих типов OCIF, добавляют такой же объем неполного адъюванта Фрейнда для приготовления эмульсии, 200 мкл которой вводят каждой из указанных выше мышей линии Balb/c 4 раза с интервалами в 1 нед.
Через 1 нед. после 4-ой бустерной иммунизации мышам линии Ва1Ь/с внутривенно вводят 100 мкл смешанного раствора, содержащего 100 мкг/мл каждого из обоих типов OCIF. Через 3 дня после окончательной иммунизации удаляют селезенку, выделяют клетки селезенки и производят слияние с клетками мышиной миеломы P3•63-AG8. 653 (АТСС CRL-1580) в соответствии с обычным способом (Koehler, G. and Milstein, С., Nature, 256, 495 (1975)). После слияния клеток клеточную суспензию в течение 10 дней культивируют в среде HAT, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. После появления гибридомы вместо клеток миеломы продолжают культивирование клеточной культуры с помощью замены культуральной среды на среду НТ, исключая из среды HAT аминоптерин.
Пример 3
Отбор и клонирование гибридомы
Через 10 дней после слияния клеток появляется гибридома. Проводят скрининг для выявления гибридомы, продуцирующей антитело с высоким сродством, одинаково распознающее и мономерный, и гомодимерный типы OCIF, и гибридомы, продуцирующие антитело, которое избирательно распознает гомодимерный тип OCIF. То есть мономерный и гомодимерный типы OCIF растворяют в 0,1 М растворе бикарбоната натрия (рН 9,6) до концентрации соответственно 5 мкг/мл, и 50 мкл раствора каждого антигена добавляют в каждую ячейку в 96-ячеечных иммунных планшетов (Nunc), и планшеты в течение ночи хранят при 4oС для покрытия каждой ячейки каждым антигеном. Раствор антигена в каждой ячейке удаляют и каждую ячейку промывают солевым раствором с фосфатным буфером, содержащим 0,1% полисорбат 20 (PBS-P), и в каждую ячейку добавляют 40 мкл бычьей плодной сыворотки.
Затем в каждую ячейку добавляют 10 мкл среды, содержащей гибридому, и затем планшеты в течение 2 ч инкубируют в условиях 80% сывороточной концентрации при комнатной температуре. После инкубации планшеты отмывают РВS-Р, в каждую ячейку добавляют 50 мкл раствора антител против мышиного IgG (KPL), меченых пероксидазой, с 5000-кратным разведением физиологическим солевым раствором, содержащим 25% BlockAce, и планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. После промывания планшетов РВS-Р в каждую ячейку для проявления цвета добавляют 50 мкл раствора ферментного субстрата (ТМВ, ScyTek). Затем ферментативную реакцию превращают с помощью добавления 50 мкл реагента, останавливающего реакцию (ScyTek). Проводят скрининг для выявления гибридом, продуцирующих антитела, с помощью определения оптического поглощения каждой ячейки при 450 нм с использованием аппарата для чтения микропланшетов (immunoreader NJ2000, Nihon-intermed). Проводят скрининг с выявлением соответственно гибридом, проявляющих высокое оптическое поглощение, продуцирующих антитело, одинаково распознающее и мономерный, и димерный тип OCIF, и гибридом, проявляющих высокое оптическое поглощение продуцирующих антитело, избирательно распознающее только гомодимерный тип OCIF. Устойчивый клон гибридомы, продуцирующий линию клеток гибридомы, устанавливают с помощью повторного клонирования 3-5 раз из каждой гибридомы с помощью метода ограничивающего разведения. Среди гибридом, продуцирующих антитела, выбирают гибридомы с высокой продуктивностью изучаемых антител.
Таким образом, получают гибридомы 0I-19 и 0I-4, которые продуцируют соответственно антитела 0I-19 и 0I-4, одинаково распознающие и мономерный, и гомодимерный типы OCIF. Кроме того, получают гибридому 0I-26, продуцирующую антитело 0I-26, избирательно распознающее гомодимерный тип OCIF. Эти гибридомы были сданы на хранение в National Institute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology, и 0I-4, 0I-19 и 0I-26 были присвоены депозитные номера соответственно FERM BP-6419, FERM ВР-6420 и FERM ВР-6421.
Пример 4
Выработка и очистка моноклонального антитела
Культивируют соответственно гибридому, продуцирующую обладающее высоким сродством антитело, одинаково распознающее и мономерный, и гомодимерный типы OCIF, и гибридому, продуцирующую антитело, избирательно распознающее гомодимерный тип OCIF, полученные в примере 3, и 1•106 клеток гибридомы на 1 мышь вводят внутрибрюшинно мышам линии Balb/c, которым был введен пристин (Aldrich). Через 2 нед. после введения собирают накопленную асцитическую жидкость, содержащую моноклональное антитело настоящего изобретения. Очищенное антитело получают с помощью хроматографии на колонке с белком A (Pharmacia).
Пример 5
Определение константы диссоциации (величины Кd) моноклонального антитела
Константу диссоциации моноклонального антитела определяют в соответствии со способом Betrand Friguet (Journal of Immunolоgical Methods, 77, 305-319, 1986). То есть очищенное антитело, полученное в примере 4, разводят в 0,2 М трис- HCl с рН 7,4 (первый буфер), содержащем 40% BlockAce (Snow Brand Milk Products) и 0,1% полисорбат 20, до концентрации 5 нг/мл. К указанному выше раствору примешивают такой же объем 6,25 нг/мл - 10 мкг/мл очищенного мономерного типа рекомбинантного OCIF или гомодимерного типа рекомбинантного OCIF, полученного в примере 1 и разведенного в первом буфере, и смесь хранят в течение 15 ч при 4oС с тем, чтобы OCIF связался с моноклональным антителом. Через 15 ч определяют константу диссоциации моноклонального антитела против мономерного типа OCIF или гомодимерного типа OCIF с помощью измерения количества антител, не связанных с OCIF, с использованием твердофазного ELISA, при котором иммобилизуют мономерный тип rOCIF или гомодимерный тип rOCIF (10 мкг/мл, 100 мкл/1 ячейку).
Пример 6
Количественное определение класса и подкласса моноклонального антитела
Количественное определение класса и подкласса моноклонального антитела настоящего изобретения проводят с использованием набора для количественного определения класса и подкласса иммуноглобулина (Amersham). Количественное определение проводят в соответствии с последовательностью операций, указанной в инструкции к набору. Результаты, полученные в примерах 5 и 6, показаны в табл. 1.
На основании этих данных было обнаружено, что антитела 0I-4 и 0I-19 являются антителами, одинаково распознающими и мономерный, и гомодимерный типы OCIF, а антитело 0I-26, как обнаружено, является антителом, избирательно распознающим только гомодимерный тип OCIF. Далее все антитела принадлежат к IgGl и, как обнаружено, являются антителами с крайне высоким сродством, имеющими константу диссоциации менее чем 2•10-7 М для мономерного и гомодимерного типов OCIF.
Пример 7
Определение OCIF с помощью ELISA
Сэндвич-ELISA создают с помощью использования 3 видов антител, полученных как описано выше, то есть антител 0I-4, 0I-26 и 0I-19, в качестве иммобилизованного антитела и меченого антитела. Мечение антител проводят с использованием набора пероксидазы, активированной малеимидом (Pias). Антитело 0I-19 в качестве первичного антитела в случае ELISA, определяющего количество и мономерного, и гомодимерного типов OCIF, или антитело 0I-26 в качестве первичного антитела в случае ELISA, избирательно определяющего количество гомодимерного типа OCIF, растворяют в 0,1 М растворе бикарбоната натрия (рН 9,6) до концентрации соответственно 10 мкг/мл, по 100 мкл которого добавляют в каждую ячейку 96-ячеечных иммунопланшетов (Nunc), и для иммобилизации антитела на каждой ячейке планшеты хранят в течение ночи при 4oС. Раствор из каждой ячейки удаляют и для блокировки в каждую ячейку добавляют 300 мкл 50% BlockAce (Snow Brand Milk Products) при комнатной температуре на 2 ч. После блокировки планшеты промывают солевым раствором с фосфатным буфером (PBS-P), содержащим 0,1% полисорбат 20. Мономерный и гомодимерный типы OCIF растворяют в 0,2 М растворе трис-НСl (рН 7,4), содержащем соответственно 40% BiockAce (Snow Brand Milk Produces) и 0,1% полисорбат 20 (первичный буфер), а затем растворяют для получения растворов каждого типа OCIF с различными концентрациями.
В каждую ячейку добавляют 100 мкл растворов мономерного типа или гомодимерного типа OCIF с различными концентрациями для проведения реакции при комнатной температуре в течение 2 ч. Через 2 ч. планшеты промывают PBS-P и в каждую ячейку в планшетах добавляют меченое POD антитело 0I-4, разведенное в 0,1 М растворе трис-НСl (рH 7,4), содержащем 25% BiockAce и 0,1% полисорбат, в качестве антитела, одинаково распознающего и мономерный, и гомодимерный типы OCIF, и планшеты оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают PBS-P и в каждую ячейку добавляют 100 мкл раствора ферментного субстрата (ТМР, ScyTek). После проявления для остановки ферментативной реакции в каждую ячейку добавляют 100 мкл реагента, останавливающего реакцию (ScyTek). С использованием аппарата для чтения микропланшетов определяют оптическую плотность каждой ячейки при 450 нм. Результаты в случае использования антитела 0I-19, одинаково распознающего и мономерный, и гомодимерный типы OCIF в качестве первичного антитела, показаны на фиг.1, а результаты в случае использования антитела 0I-26, избирательно распознающего гомодимерный тип OCIF в качестве первичного антитела, показаны на фиг.2.
В результате, как показано на фиг.1, было обнаружено, что чувствительность сэндвич-ELISA составляет приблизительно 25 пкг/мл и она способна определить крайне маленькое количество OCIF, когда в качестве иммобилизованного антитела использовалось антитело 0I-19, одинаково распознающее и мономерный, и гомодимерный типы OCIF, и в качестве антитела, меченого POD, использовалось антитело 0I-4, одинаково распознающее оба типа OCIF. Далее, как показано на фиг.2, обнаружено, что чувствительность выявления сэндвич-ELISA составляет 50 пкг/мл и он с высокой чувствительностью способен избирательно выявить гомодимерный тип OCIF при использовании в качестве иммобилизованного антитела антитело 0I-26, избирательно распознающее гомодимерный тип OCIF, а в качестве антитела, меченого POD, антитело 0I-4, одинаково распознающее и мономерный, и гомодимерный типы OCIF.
Пример 8
Определение концентрации OCIF в сыворотке крови здоровых людей и у пациентов с остеопорозом
Концентрацию OCIF в сыворотке крови здоровых людей и у пациентов с остеопорозом (основанную на критерии, установленном Japanese Society for Bone and Mineral Research) определяют с использованием частично усовершенствованной системы ELISA OCIF (мономерный тип OCIF + гомодиморный тип OCIF), описанной в примере 7. То есть для определения концентрации OCIF (мономерный тип OCIF + гомодимерный тип OCIF) антитело 0I-19, одинаково распознающее оба типа OCIF, иммобилизуют на 96-ячеечную планшету, как описано в примере 7, и в каждую ячейку добавляют 50 мкл первого буфера (0,2 М раствор трис-HCl, рН 7,4, содержащий 40% BlockAce и 0,1% полисорбат 20), содержащего 20 мкг/мл очищенного мышиного IgG. Затем в каждую ячейку добавляют 50 мкл человеческой сыворотки, разведенной в 4 раза первым буфером, и планшеты оставляют на 2 ч при комнатной температуре. После 6-кратного промывания планшетов PBS-P в каждую планшету добавляют 100 мкл раствора меченого POD антитела 0I-4, одинаково распознающего оба типа OCIF, разведенного в 3000 раз вторичным буфером (0,1 М раствор трис-HCl, рН 7,4, содержащий 25% BlockAce и 0,1% полисорбат 20), содержащим 10 мкг/мл очищенного мышиного IgG, и планшеты оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Планшеты 6 раз промывают PBS-P и в каждую ячейку добавляют 100 мкл раствора ферментного субстрата (ТМВ, ScyTek). Для продолжения ферментативной реакции планшеты оставляют при комнатной температуре на 20 мин и реакцию останавливают с помощью добавления в каждую ячейку 100 мкл реагента для остановки реакции (ScyTek). С использованием аппарата для чтения микропланшетов определяют оптическую плотность каждой ячейки при 450 нм. Как и для псового буфера, содержащего известное количество OCIF, проводят такую же процедуру, как описано выше, и строят стандартную кривую OCIF, как показано на фиг.1. Сывороточную концентрацию OCIF определяют на основании оптической плотности образца сыворотки.
Результаты определения сывороточной концентрации OCIF (мономерный тип OCIF + гомодимерный тип OCIF) у здоровых людей и у пациентов с остеопорозом показаны на фиг.3. Статистический анализ достоверности различий результатов на фиг. 3-5 проводят с помощью непарного t критерия Стьюдента. В результате выявлено достоверное различие сывороточной концентрации OCIF (мономерный тип OCIF + гомодимерный тип OCIF) у здоровых людей и у пациентов с остеопорозом. Сывороточная концентрация OCIF у пациентов с остеопорозом выше, чем у здоровых людей. Соответственно было обнаружено, что OCIF является новым маркером для диагностики остеопороза, потому что с помощью определения сывороточной концентрации OCIF можно проследить патогенез остеопороза.
Кроме того, на фиг.4 и 5 показано взаимоотношение соответственно между сывороточной концентрацией OCIF (мономерный тип OCIF + гомодимерный тип OCIF) и концентрацией пиридинолина в моче, а также между концентрацией OCIF в сыворотке и концентрацией дезоксипиридинолина в моче у здоровых добровольцев и у пациентов с остеопорозом. Концентрация пиридинолина 42 пкмоль/мкмоль Сr (количество пиридинолина в пкмолях на 1 моль креатинина) и концентрация дезоксипиридинолина 6,2 пкмоль/мкмоль Сr представляют собой верхний предел нормального уровня у жителей Японии.
По полученным данным у пациентов с более высокой концентрацией пиридинолина и/или дезоксипиридинолина сывороточная концентрация OCIF была достоверно выше. Пиридинолин и дезоксипиридинолин представляют собой поперечно сшитые молекулы коллагена, вырабатываемые в костном субстрате после включения коллагена в костный субстрат и высвобождаемые при разрушении кости, которое обусловлено костной резорпцией. Считается, что эти молекулы представляют собой высоко специфичный маркер костной резорпции и широко используются для оценки клинического объекта. Поскольку была признана корреляция между концентрацией OCIF и этими двумя маркерами, было обнаружено, что концентрация OCIF в сыворотке крови может использоваться в качестве маркера костного метаболизма.
Пример 9
Определение концентрации OCIF в синовиальной жидкости пациентов с суставной грыжей
Образцы синовиальной жидкости брали у пациентов с ревматоидным артритом (РА, 43 случая), остеоартритом (ОА, 6 случаев), травмой (Тр, 3 случая) и подагрой (П, 6 случаев), которые посетили больницу для лечения артроза, у которых в результате дифференциальной диагностики был поставлен диагноз суставной грыжи и которые согласились на участие в исследовании на основании информированного согласия. Концентрацию OCIF в синовиальной жидкости определяют с использованием частично усовершенствованной системы ELISA OCIF (мономерный тип OCIF + гомодимерный тип OCIF), описанной в примере 8, то есть после 16-кратного разведения синовиальной жидкости первым буфером, 50 мкл которого добавляют в каждую ячейку 96-ячеечных иммунопланшетов с иммобилизованным антителом 0I-19. Остальные процедуры, кроме описанной выше, были такими же, как в примере 8.
Результаты исследования концентрации OCIF (мономерный тип OCIF + гомодимерный тип OCIF) в синовиальной жидкости пациентов с суставной грыжей показаны на фиг. 6. Для статистического анализа данных, показанных на фиг.6, были проведены исследования Kruskal-Wallis и Mann-Whitney. На основании полученных результатов концентрация OCIF в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом была статистически достоверно ниже, чем у пациентов с подагрой (р= 0,0023). Далее, хотя самая низкая величина концентрации OCIF в синовиальной жидкости пациентов с остеоартритом (6 случаев) составила 4,79 нг/мл, число пациентов с ревматоидным артритом, у которых концентрация OCIF в синовиальной жидкости была ниже 4,0 нг/мл, составило 15 из 43 пациентов.
На основании этих результатов предполагалось, что недостаточность OCIF не могла подавить образование и активность остеокластов у пациентов с ревматоидным артритом, проявляя более низкую концентрацию OCIF в синовиальной жидкости. Было обнаружено, что OCIF-ELISA может использоваться для диагностики и изучения патогенеза ревматоидного артрита (РА), остеоартрита (ОА), травмы (Тр) и подагры (П).
Пример 10
Корреляция между концентрацией OCIF в жидкости коленного сустава пациентов с ревматоидным артритом (РА) и патогенезом
Для изучения корреляции между концентрацией OCIF в синовиальной жидкости и прогрессированием деструктивных процессов в суставе было проведено ретроспективное когортное исследование у 2 пациентов с ревматоидным артритом.
Случай 1, мужчина 66 лет
В возрасте 50 лет в 1982 г. у него были субъективные болевые симптомы во многих суставах. В 1983 г. он посетил больницу, где на основании критерия классификации American College of Rheumatology был поставлен диагноз РА. После этого, поскольку применение антиревматоидного средства (меркаптазы) у него вызвало ремиссию заболевания, применение антиревматоидного средства было прекращено. В 1990 г. вследствие рецидива РА применение антиревматоидного средства было возобновлено. 18 марта 1992 г. наблюдалась припухлость его правого коленного сустава, и с помощью пункции была взята синовиальная жидкость. Концентрация OCIF в синовиальной жидкости составила 23,6 нг/мл, что было высоким уровнем (средняя величина концентрации OCIF 43 пациентов с РА составила 6 нг/мл). Уровень С-реактивного белка в плазме в это время составлял 5,4 мг%, что отчетливо свидетельствовало о наличии у него также воспаления. С-реактивкый белок не стал отрицательным и до 1997 г. оставался на уровне около 3 мг%. С 1983 по 1997 гг. проводились рентгеновские исследования коленного сустава, и основным симптомом был остеоартрит. В суставах пальцев и кисти костная эрозия не наблюдалась.
Случай 2, женщина 60 лет
В возрасте 49 лет в 1987 г. у нее были субъективные болевые симптомы во многих суставах. 17 августа 1993 г. она посетила больницу, где на основании критерия классификации American College of Rheumatology был поставлен диагноз PA. В это время у нее наблюдалась припухлость правого коленного сустава, и с помощью пункции была взята синовиальная жидкость. Концентрация OCIF в синовиальной жидкости составила 3,0 нг/мл, что было низким уровнем, а уровень С-реактивного белка в плазме в составил 13,7/мг%, что свидетельствовало о наличии у нее воспаления. Под влиянием назначения антиревматоидного средства (метотрексата) содержание С-реактивного белка постепенно снизилось до уровня 4,1 мг% 18 марта 1994 г. и до уровня 1,1 мг% 27 июня того же года. Однако в соответствии с классификацией Laresen (Laresen et al., Acta Radiol. Diag. 18, 481-491, 1977) рентгенограммы коленного сустава все более ухудшались, то есть 1 сентября 1993 г. отмечена III степень, 18 марта 1994 г. - IV степень и 27 июня того же года - V степень, что отчетливо свидетельствовало о прогрессировании деструкции сустава. И 4 октября 1994 г. была проведена операция замещения сустава искусственным протезом.
На основании результатов определения концентрации OCIF в синовиальной жидкости в описанных выше 2 случаях, то есть в случае с незначительным прогрессированием деструкции сустава и в другом случае с высокой деструкцией сустава, было обнаружено, что определение концентрации OCIF в синовиальной жидкости может использоваться для оценки частоты риска деструкции сустава ревматическим процессом и для оценки влияния лечения на деструкцию сустава.
Пример 11
Набор количественного анализа для определения мономерного и гомодимерного типов OCIF (80 образцов)
1) 96-ячеечный планшет с иммобилизованным антителом 0I-19 с последующей блокировкой BlockAce в соответствии со способом, описанным в примере 7: один планшет;
2) антитело 0I-4, меченое POD в соответствии со способом примера 7: 10 мкл (1000-кратное разведение);
3) стандартный рекомбинантный OCIF (мономерный тип): 0,5 нг/мл 400 мкл;
4) раствор для разведения образца (0,01% Твин 20 и 0,2 М, буферный раствор трис-HCl, содержащий 40% BlockAce, pH 7,4): 10 мл;
5) раствор для разведения меченого антитела (0,1 М буферный раствор трис-НСl, содержащий 0,01% Твин 20 и 25% BlockAce, pH 7,4): 10 мл;
6) раствор для промывания 96-ячеечного планшета (РВS(-), содержащий 0,1% Твин 20): 1л;
7) раствор субстрата для измерения активности ферментативной метки (раствор ТМВ) и реагент для остановки реакции (реагент для остановки реакции ТМВ): по 10 мл каждого.
Набор количественного анализа для определения димерного и гомодимерного типов ОСIF (80 образцов)
1) 96-ячеечный планшет с иммобилизованным антителом 0I-26 с последующей блокировкой BlockAce в соответствии со способом, описанным в примере 7: один планшет;
2) антитело 0I-4, меченое POD в соответствии со способом примера 7: 10 мкл (1000-кратное разведение);
3) стандартный рекомбинантный OCIF (димерный тип): 0,5 нг/мл 400 мкл;
4) раствор для разведения образца (0,01% Твин 20 и 0,2 М, буферный раствор трис-HCl, содержащий 40% BlockAce, pH 7,4): 10 мл;
5) разведенный раствор меченого антитела (0,1 М буферный pacтвоp трис-HCl, содержащий 0,01% Твин 20 и 25% BlockAce, рН 7,4): 10 мл;
6) раствор для промывания 96-ячеечного планшета (PBS(-), содержащий 0,1% Твин 20): 1 л;
7) раствор субстрата для измерения активности ферментативной метки (раствор ТМВ) и реагент для остановки реакции (реагент для остановки реакции ТМВ): по 10 мл каждого.
Способ количественного анализа (набор 1 и набор 2)
В каждую ячейку в планшете 1 добавляют соответственно 100 мкл образца, разведенного раствором 4, и 100 мкл рекомбинантного человеческого OCIF 3, серийно разведенного раствором 4. После оставления на 2 ч при комнатной температуре каждую ячейку 5-6 раз промывают 300 мкл раствора 6. Для этой процедуры промывания можно использовать автоматический моющий аппарат для планшетов. После промывания в каждую ячейку добавляют 100 мкл раствора антитела 0I-4, меченого POD 2 и разведенного в 1000 раз раствором 5, и планшет оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Каждую ячейку в планшете 5-6 раз промывают раствором 6. Для этой процедуры промывания можно использовать автоматический моющий аппарат для планшетов. В каждую ячейку добавляют 100 мкл раствора ферментного субстрата 7 и планшет оставляют на 20-30 мин при комнатной температуре. Затем ферментативную реакцию останавливают с помощью добавления 100 мкл реагента для остановки реакции 7.
Определяют оптическую плотность каждой ячейки при 450 нм с помощью аппарата для чтения микропланшетов. С использованием оптической плотности при 450 нм в случае добавления в каждую ячейку серийно разведенного стандартного рекомбинантного человеческого OCIF 3 строят стандартную кривую рекомбинантного человеческого OCIF. С использованием этой стандартной кривой можно определить концентрацию OCIF каждого образца.
Промышленная применимость
С помощью определения концентрации человеческого фактора, ингибирующего остескластогенез, в биологической жидкости (крови, синовиальной жидкости и т. д.) в соответствии со способом настоящего изобретения можно легко и точно поставить диагноз метаболических костных заболеваний, особенно остеопороза и артроза. Поскольку для диагностики настоящего изобретения используются указанные выше моноклональные антитела и наборы для количественного анализа OCIF с применением моноклональных антител, как указано выше, можно легко и точно поставить диагноз метаболических костных заболеваний, особенно остеопороза и артроза. Настоящее изобретение может использоваться для способа диагностики метаболических костных заболеваний, особенно остеопороза и артроза, или для реагента количественного анализа для его исследования.
Ссылка на микроорганизм
Название и адрес официального депозитария, куда были переданы на хранение указанные организмы настоящего изобретения
Название: National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology Ministry of International Trade and Industry.
Адрес: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Япония.
Дата передачи их на хранение в официальный депозитарий: 16 октября 1997 г.
Депозитный номер, присвоенный официальным депозитарием, - FERM ВР-6419.
Название и адрес официального депозитария, в который указанные организмы настоящего изобретения были переданы на хранение
Название: National Institute of Bioscience and Human-Technoloqy Agency of Industrial Science and Technology Ministry of International Trade and Industry.
Адрес: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Япония.
Дата передачи их на хранение в официальный депозитарий: 16 октября 1997 г.
Депозитный номер, присвоенный официальным депозитарием, - FERM ВР-6420.
Название и адрес официального депозитария, в который указанные организмы настоящего изобретения были переданы на хранение
Название: National Institute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology Ministry of International Trade and Industry.
Адрес: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Япония.
Дата передачи их на хранение в официальный депозитарий: 16 октября 1997 г.
Депозитный номер, присвоенный официальным депозитарием, - FERM BP-6421.
Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике метаболических костных заболеваний. Способ обеспечивает высокую специфичность и точность измерения уровня нового маркера, который позволяет производит более точную диагностику метаболических костных заболеваний. Проводят исследование биологической жидкости, при этом во взятой биологической жидкости определяют концентрацию мономерного и гомодимерного типов фактора, ингибирующего остеокластогенез (OCIF), с помощью моноклональных антител, одинаково распознающих мономерный и гомодимерный типы OCIF и имеющих константу диссоциации менее 10-9М с антигеном или избирательно распознающих димерный тип OCIF и имеющих константу диссоциации менее 2•10-7 М с антигеном. Для количественного определения концентрации OCIF заявлено также моноклональное антитело, которое способно одинаково распознавать мономерный и гомодимерный типы OCIF, и моноклональное антитело, способное избирательно распознавать димерный тип OCIF, а также набор, содержащий, указанные выше антитела. 4 с. и 11 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 ил.
ЗИЛВА Дж.Ф | |||
и др | |||
Клиническая химия в диагностике и лечении./Пер | |||
с англ | |||
- М.: Медицина, 1988, с | |||
Арматура для железобетонных свай и стоек | 1916 |
|
SU259A1 |
WO 9626217 A, 29.08.1996 | |||
RU 94027326 A1, 20.06.1996 | |||
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТРАВМАТИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ТАЗОБЕДРЕННОГО СУСТАВА | 1992 |
|
RU2046600C1 |
Авторы
Даты
2003-04-27—Публикация
1998-07-31—Подача