СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ СУХОЙ ПОЛИВАЛЕНТНОЙ ВИРУСВАКЦИНЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ БОЛЕЗНИ МАРЕКА И СУХАЯ ПОЛИВАЛЕНТНАЯ ВИРУСВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ БОЛЕЗНИ МАРЕКА Российский патент 2008 года по МПК A61K39/255 A61P31/12 

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при производстве сухих поливалентных вирусвакцин против болезни Марека (БМ) птиц.

Болезнь Марека (БМ) - лимфопролиферативное злокачественное заболевание птиц вирусной этиологии. Важным средством борьбы против БМ является вакцинопрофилактика. Для профилактики БМ используют жидкие и лиофилизированные моновалентные вакцины из штамма FC-126 вируса герпеса индеек (ВГИ) - третьего серотипа вируса болезни Марека (ВБМ), которые предохраняют птицу от заболевания (эффективность вакцинации 76-85%) [1], и жидкие культуральные би- и поливалентные вакцины из штаммов FC-126 ВГИ, "42", "50" вируса герпеса кур (ВГК) - второго серотипа ВБМ [2] и/или аттенуированных штаммов ВБМ первого серотипа (эффективность вакцинации 82-100%) [5]. Однако, несмотря на высокую эффективность поливалентных жидких культуральных вакцин против БМ, эти препараты имеют существенные недостатки: при их высокой себестоимости для их хранения и перевозки требуется жидкий азот, кроме того, они не удобны в применении.

Известные сухие моновалентные вакцины на основе ВГИ [1, 3] не обладают нужной степенью защиты птицы против вирулентных и особо вирулентных штаммов вируса болезни Марека.

Известна жидкая культуральная поливалентная вакцина против БМ, содержащая комбинацию вирусов второго и третьего серотипов, в частности штаммы "42", "50" (2 серотип) и штамм FC-126 (3 серотип) "Поливалентная вакцина для профилактики болезни Марека и способ ее изготовления" Лукина В.А., Праксин Ф.Г., Белый Д.И., Шевырев Н.С., Безгин В.М., Гусев А.А., Баррос Палома Е.В., Смоленский В.И., Панов B.C. - Патент РФ 2059414, А61К 39/255, 1996. Способ изготовления известной вакцины заключается в том, что предварительно выращенные культуры клеток раздельно инфицируют ВГК 2-го серотипа и ВГИ 3-го серотипа, выращивают инфицированные клетки, собирают в стабилизирующую среду, хранят при -196°С, перед применением вакцину размораживают, разводят в разбавителе из расчета, что одна доза (0,2 см³) содержит 2000 ФОБ ВГИ и 300 ФОЕ ВГК. Однако и для этой вакцины требуется жидкий азот.

В задачу заявленной группы изобретений входило создание сухой поливалентной вирусвакцины против БМ, обладающей стабильностью, высокой иммуногенной активностью, не требующей при хранении и транспортировке жидкого азота, хранящейся при температуре 4-25°С в течение не менее 2-х лет (срок наблюдения), удобной и экономичной в применении, а также обладающей более низкой себестоимостью препарата и способа ее изготовления.

Заявляемая вакцина имеет неоспоримое преимущество перед известными препаратами.

Технический результат заявляемого изобретения состоит в том, что предлагаемая вакцина содержит в качестве основного (базового) компонента лиофилизированный штамм 3-го серотипа FC-126 ВГИ, а в качестве усиливающего и пролонгирующего действие ВГИ - штаммы 2-го серотипа вируса герпеса кур "SB-1", "42", "50" или любые другие штаммы ВГК также в лиофилизированном виде в эффективном количестве. Поставленная задача решена тем, что заявляемая сухая вирусвакцина поливалентная и лиофилизированная и разработан способ культивирования вируса герпеса кур, получение его в свободном от клеток состоянии с последующей лиофилизацией. Сухая поливалентная вирусвакцина и способ ее изготовления составляют единый изобретательский замысел: одно из изобретений предназначено для получения другого.

Заявляемая вакцина содержит свободный от клеток ВГИ, выращенный в культуре клеток эмбрионов птиц (базовый компонент), и вирусы герпеса кур (второй серотип ВБМ), выращенные в течение 12-25 суток в организме инфицированных цыплят в суточном возрасте и выделенные из эпителия перьевых фолликулов (усиливающий компонент), взятые в эффективном количестве и помещенные в защитную среду, например 7-12%-ный раствор сахарозы в фосфатно-солевом буфере при рН 7,2-7,4 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Клеточно-свободный штамм FC-126 вируса герпеса индеек30,0-50,0Клеточно-свободный штамм "42"10,0-20,0Клеточно-свободный штамм "50"10,0-20,0Клеточно-свободный штамм "SB-1"10,0-20,0Защитная средаОстальное

Вакцину готовят следующим образом.

Пример 1.

Для приготовления базового компонента вакцинный ВГИ культивируют на культуре клеток эмбрионов птиц, затем производят съем инфицированных клеток в защитную среду и после ультразвуковой дезинтеграции вышедший из инфицированных клеток ВГИ подвергают высушиванию (Временная инструкция по изготовлению и контролю сухой культуральной вирус-вакцины против болезни Марека из штамма ФС-126 вируса герпеса индеек, утвержденная ГУВ МСХ СССР 01.06.1984) [4].

Усиливающий иммуногенность второй компонент вакцины -свободный от клеток вирус герпеса кур готовят следующим образом. Для культивирования ВГК используют свободных от патогенной микрофлоры цыплят (СПФ-цыплята) суточного возраста, которых инокулируют вирусом маточной расплодки 2-го серотипа из штамма "42", "50", "SB-1" или любого другого штамма ВГК в дозе 10000-50000 фокусообразующих единиц (ФОЕ) на цыпленка. Цыплят содержат в стерильных условиях в течение 12-25 суток. Затем цыплят тотально обескровливают декапитацией, отделяют крылья от туловища и в асептических условиях собирают перьевые фолликулы [от 10 цыплят в 30 мл защитной среды (7-12%-ной сахарозы в фосфатно-солевом буфере при рН 7,2-7,4)]. Полученные фолликулы обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе в диапазоне частот от 12 до 35 кГц и плотности звука в дезинтегрируемом субстрате в пределах от 0,6 до 0,9 ватт/см³ для высвобождения ВГК из клеток. Перьевые фолликулы удаляют. После этого в обработанную ультразвуком защитную среду, содержащую высвобожденный ВГК, добавляют равный объем обработанной ультразвуком неинфицированной культуры клеток эмбрионов птиц, выращенной в течение 24-72 час. Полученную смесь расфасовывают во флаконы по 1-2 см³, замораживают и высушивают при тех же условиях, что и ВГИ, после чего флаконы закрывают пробками, покрывают металлическими колпачками и обкатывают.

Приготовленный основной компонент на основе ВГИ и усиливающий иммуногенность второй компонент вакцины - свободный от клеток вирус герпеса кур контролируют на стерильность, безвредность и инфекционную активность путем титрования на 24-часовой культуре клеток куриных эмбрионов, выращенных во флаконах с растовой поверхностью 20-25 см². Инфекционность должна быть не ниже 5×10⁵ ФОЕ/см³ для ВГИ и не ниже 5×10⁴ ФОЕ/см³ для ВГК соответственно.

Би- или поливалентный препарат составляют непосредственно перед вакцинацией. Для этого 1 см³ базового компонента на основе ВГИ объединяют в растворителе для вакцин с усиливающим иммуногенность вторым компонентом вакцины на основе ВГК в объеме 0,5 см³, в соотношении 2000 ФОЕ/гол ВГИ и 100-500 ФОЕ/гол ВГК соответственно.

Вакцина стабильна в течение 24 месяцев (срок наблюдения) при температуре 4-25°С.

Пример 2. Испытание инфекционной активности заявляемой вакцины проводили следующим образом.

Каждый компонент заявляемой вакцины разводили SFGA последовательными 10-кратными разведениями от 10^-1 до 10^-5 и вносили во флаконы емкостью 50 мл с 24-часовым монослоем культуры клеток куриных эмбрионов от SPF-кур (предварительно слив с них ростовую среду) по 0,1 см³ разведений от 10^-1 до 10^-5, используя на каждое разведение по 4 флакона. Через 1 час вносили поддерживающую среду.

Флаконы инкубировали в условиях термостата в течение 5 суток для ВГИ и 6-10 суток для ВГК. После инкубации вируса монослой во флаконах окрашивали раствором амидового черного и подсчитывали фокусы по утвержденной методике (ТУ 4621-157-80). Данные испытаний приведены в таблице 1.

Таблица 1Инфекционная активность входящих в заявляемую вакцину лиофилизированных штаммов в культуре клеток куриных эмбрионовШтаммВремя культивирования, суткиИнфекционная активность, ФОЕ/см³FC-126 ВГИ55×10⁵42 ВГК85,4×10⁴42 ВГК101,2×10⁵50 ВГК85,1×10⁴50 ВГК107,0×10⁴SB-185,5×10⁴SB-1107,8×10⁴

Из таблицы 1 следует, что инфекционная активность лиофилизированных штаммов ВГИ и ВГК в культуре клеток куриных эмбрионов соответствует заявленной.

Пример 3. Испытание иммуногенной активности заявляемой вакцины в лабораторных условиях на суточных цыплятах проводили в сравнении с известной сухой вакциной (ВГИ), представляющей собой базовый компонент (1), известной жидкой поливалентной вакциной (2) и плацебо (контрольная группа - цыплята без вакцинации).

Суточным цыплятам вводили внутримышечно известные и предлагаемую вакцины. Через 7 дней после вакцинации цыплят опытных и контрольной групп заражали вирулентным ВБМ штаммом Jm путем внутрибрюшинного введения.

Учет результатов проводили через 90 дней после заражения.

Результаты испытаний представлены в таблице 2.

Таблица 2Испытание иммуногенной активности вакцин против БМ№ группыВид вакциныКол-во зараженных цыплят (гол.)Падеж (гол.) от БМКол-во вскрытых на 90 день цыплятСохранность цыплят к моменту вскрытия, %Патолого-анатомическая картина БМ при вскрытии на 90 день1ВГИ + ВГК (заявляемая вакцина)96096100Нет2ВГИ (сухой препарат) ГЩБК9678992,7Нет3ВГИ + ВГК (известная поливалентная жидкая вакцина)96096100Нет4Контрольные не вакцинированные96514546,8720 случаев БМ

Из данных таблицы 2 следует, что заявляемая сухая поливалентная вакцина не отличается по протективной активности от известной жидкой поливалентной вакцины.

Пример 4. Испытание иммуногенной активности вакцин в полевых условиях проводили на суточных цыплятах в сравнении с известной сухой жидкой поливалентной вакциной и контрольной группой (цыплята без вакцинации).

Суточным цыплятам вводили известные вакцины и заявляемую.

Наблюдения за цыплятами вели в течение 230 дней после вакцинации.

Результаты испытаний вакцины в полевых условиях представлены в таблице 3.

Таблица 3Эффективность вакцин против болезни Марека в полевых условияхВакцинаКоличество цыплятКоличество случаев БМ, % от числа павших цыплятЭффективность вакцинации, %Заявляемая250000100Известная (моновалентная сухая ВГИ)8330010,1583,57Известная (поливалентная жидкая)645000,5599,8Контрольная группа2500030,86-

Из таблицы 3 следует, что в полевых условиях только заявляемая вакцина обладала 100%-ной эффективностью.

Таким образом, заявляемая сухая поливалентная вирусвакцина для профилактики болезни Марека высоко технологична, проста в применении и транспортировке, обладает 100%-ной эффективностью, стабильна не менее чем в течение двух лет (срок наблюдения) и может храниться при температуре 4-25°С.

Источники информации

1. Авторское свидетельство СССР № 792643, А61К 39/252, С12К 7/00 - прототип.

2. Патент РФ № 2059414, А61К 39/255.

3. Патент РФ № 2144376, А61К 39/255, С12N 7/00.

4. Временная инструкция по изготовлению и контролю сухой культуральной вирусвакцины против болезни Марека из штамма ФС-126 вируса герпеса индеек, утвержденная ГУВ МСХ СССР 01.06.1984.

5. Sarma G. Field trial and immunogenesity studies on the polyvalent Marek′s disease vaccines in chickens. // In: 19-th World′s Poultry Congress, V.1. World Poultry Science Association. Amsterdam. - 1992. - P.310-314.

Группа изобретений относится к вирусологии и биотехнологии. Способ изготовления сухой поливалентной вирусвакцины включает раздельное инфицирование культур клеток штаммом PC-126 вируса герпеса индеек (вирус болезни Марека третьего серотипа) и инфицирование цыплят суточного возраста вирусом герпеса кур (вирус болезни Марека второго серотипа), инкубирование, сбор клеточной массы, содержащей вирус герпеса индеек, и сбор перьевых фолликулов маховых перьев инфицированных цыплят, содержащих вирус герпеса кур, добавление защитной среды, раздельную обработку вируссодержащей клеточной массы и массы перьевых фолликулов ультразвуком, замораживание и высушивание целевого продукта с последующим их объединением. При этом из штаммов вируса герпеса кур (ВБМ второго серотипа) используют штаммы "42", "50", "SB-1", инокулируют их в дозе 10000-50000 ФОЕ на цыпленка и выращивают в организме в течение 12-25 суток. После обработки фолликулов ультразвуком фолликулы удаляют, и в обработанную ультразвуком защитную среду, содержащую высвобожденный вирус герпеса кур, добавляют равный объем обработанной ультразвуком неинфицированной культуры клеток эмбрионов птиц, выращенной в течение 24-72 часов. Сухая поливалентная вирусвакцина содержит клеточно-свободный лиофилизированный штамм FC-126 вируса герпеса индеек - третьего серотипа вируса болезни Марека в защитной среде. Дополнительно вирусвакцина содержит клеточно-свободные лиофилизированные штаммы вируса герпеса кур - второго серотипа вируса болезни Марека, полученные по любому из пп.1-5, в защитной среде при соотношении 2000 ФОЕ/гол : 100-500 ФОЕ/гол соответственно. Способ позволяет получить вакцину, обладающую высокой иммуногенной активностью и стабильностью при хранении. 2 с. и 8 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ изготовления сухой поливалентной вирусвакцины для профилактики болезни Марека, включающий раздельное инфицирование культур клеток штаммом PC-126 вируса герпеса индеек (вирус болезни Марека третьего серотипа) и инфицирование цыплят суточного возраста вирусом герпеса кур (вирус болезни Марека второго серотипа), инкубирование, сбор клеточной массы, содержащей вирус герпеса индеек, и сбор перьевых фолликулов маховых перьев инфицированных цыплят, содержащих вирус герпеса кур, добавление защитной среды, раздельную обработку вируссодержащей клеточной массы и массы перьевых фолликулов ультразвуком, замораживание и высушивание целевого продукта с последующим их объединением, отличающийся тем, что из штаммов вируса герпеса кур (ВБМ второго серотипа) используют штаммы "42", "50", "SB-I", инокулируют их в дозе 10000-50000 ФОЕ на цыпленка и выращивают в организме в течение 12-25 суток, а после обработки фолликулов ультразвуком фолликулы удаляют и в обработанную ультразвуком защитную среду, содержащую высвобожденный вирус герпеса кур, добавляют равный объем обработанной ультразвуком неинфицированной культуры клеток эмбрионов птиц, выращенной в течение 24-72 ч.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что инфицируют культуры клеток фибробластов СПФ-эмбрионов перепелов и СПФ-эмбрионов кур.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что получают целевой продукт путем объединения 1 см³ штамма вируса герпеса индеек и 0,5 см³ штамма вируса герпеса кур при соотношении 2000 ФОЕ/гол : 100-500 ФОЕ/гол соответственно.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что инфекционная активность вакцины составляет не ниже 5×10⁵ ФОЕ/см³ для вируса герпеса индеек и не ниже 5×10⁴ ФОЕ/см³ для вируса герпеса кур соответственно.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве защитной среды берут 7-12%-ный раствор сахарозы в фосфатно-солевом буфере при рН 7,2-7,4.6. Сухая поливалентная вирусвакцина для профилактики болезни Марека, содержащая клеточно-свободный лиофилизированный штамм FC-126 вируса герпеса индеек - третьего серотипа вируса болезни Марека в защитной среде, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит клеточно-свободные лиофилизированные штаммы вируса герпеса кур - второго серотипа вируса болезни Марека, полученные по любому из пп.1-5, в защитной среде при соотношении 2000 ФОЕ/гол : 100-500 ФОЕ/гол соответственно.7. Сухая поливалентная вирусвакцина по п.6, отличающаяся тем, что в качестве клеточно-свободных штаммов вируса герпеса кур (вирус болезни Марека второго серотипа) она содержит лиофилизированные штаммы "42", "50", "SB-1", полученные по любому из пп.1-6.8. Сухая поливалентная вирусвакцина по любому из пп.6 и 7, отличающаяся тем, что клеточно-свободный штамм FC-126 вируса герпеса индеек и защитная среда взяты в соотношении, мас%:

Клеточно-свободный штамм FC-126 вируса герпеса индеек30,0-50,0Защитная средаостальное

клеточно-свободный штамм "42"10,0-20,0клеточно-свободный штамм "50"10,0-20,0клеточно-свободный штамм "SB-1"10,0-20,0защитная средаостальное