СУХАЯ ВИРУСВАКЦИНА ПРОТИВ БОЛЕЗНИ МАРЕКА И СПОСОБ ЕЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ Российский патент 2000 года по МПК A61K39/255 C12N7/00 C12N5/06 C12N7/00 C12R1/93 

Изобретения относятся к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и могут быть использованы при разработке и изготовлении средств специфической профилактики болезни Марека.

Болезнь Марека (БМ) - высококонтагиозное, лимфопролиферативное, злокачественное, вирусное заболевание птиц. БМ регистрируется во всех странах мира, где развито промышленное птицеводство, в том числе и в нашей стране, вызывая большие экономические потери. Болезнь характеризуется образованием единичных (в начальной стадии) и множественных опухолей во внутренних органах, коже, мышцах, а также изменениями центральной и периферической нервной системы. Вирус болезни Марека (ВБМ) повреждает иммунокомпетентные органы (селезенку, тимус, клоакальную сумку) и обладает таким образом иммунодепрессивной активностью, что приводит к снижению общей резистентности птиц и повышению их чувствительности к другим болезням. В связи с этим БМ довольно часто протекает в ассоциации с другими заболеваниями. Важным средством предупреждения БМ и снижения потерь от заболевания является вакцинопрофилактика. Для борьбы с БМ в качестве вакцин используют следующее.

1. Аттенуированный ВБМ серотипа 1 (HPRS-16). Вакцинированные им птицы не рассеивают его во внешней среде.

2. Авирулентный частично аттенуированный ВБМ серотипа 1 (CVI-988, штамм Rispens). Он имеет остаточную патогенность для генетически восприимчивых цыплят, реплицируется in vivo и быстро распространяется.

3. Природные неонкогенные вирусы герпеса кур (ВГК) серотипа 2(SB-1, 30/В). Используются в бивалентных вакцинах.

4. Авирулентный вирус герпеса индеек (ВГИ) серотипа 3. Это единственный вакцинный вирус, который удается отделить от культуральных клеток и подвергнуть лиофилизации.

5. Бивалентные вакцины на ВГИ серотипа 3 и ВГК серотипа 2.

Наиболее широкое распространение во всем мире получила вакцина на основе ВГИ (штамм FC-126), поскольку вирус не требовал аттенуации, не опасен в плане риверсии и подвергается стабилизации во внеклеточном состоянии. На основе ВГИ готовят 2 типа вакцин: клеточно- ассоциированную (нативную) и свободную от клеток (сухую).

Преимущество клеточно-свободной вакцины заключается в том, что ее можно продолжительное время хранить при 4^oC (1).

Известна сухая вирусвакцина против БМ, содержащая клеточно-свободный штамм ВГИ 3 серотипа в защитной среде. В качестве стабилизатора используют SPGA, содержащий сахарозу, фосфат, глютамат калия и альбумин (2).

Известна сухая вирусвакцина против БМ, содержащая клеточно-свободный штамм ВГИ 3 серотипа в защитной среде. В качестве стабилизатора используют гидроксиэтилкрахмал с м.м. 100000-300000 (3).

Известна сухая вирусвакцина против БМ, содержащая клеточно-свободный штамм ВГИ 3 серотипа в защитной среде. В качестве стабилизатора используют (отдельно или в сочетании SPGA, сорбитол, маннитол, сахарозу, декстран, глюкозу, альбумин, казеин и продукты их деградации (4).

Известна сухая вирусвакцина против БМ, содержащая клеточно-свободный штамм ВГИ 3 серотипа в защитной среде (5).

Недостатки указанных вакцин состоят в том, что они не устраняют носительства вирулентного вируса и опасность поражения лимфатических органов птиц от высоковирулентных онкогенных штаммов ВБМ.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является сухая вирусвакцина против БМ, содержащая клеточно-свободный штамм ВГИ 3 серотипа в защитной среде. В качестве защитной среды используют 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере (6).

Недостаток вакцины-прототипа состоит в том, что она также не обладает высокой иммуногенностью в хозяйствах с высоким уровнем заболеваемости БМ.

Известен способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток штаммом ВГИ 3 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление защитной среды, обработку вируссодержащей суспензии ультразвуком, ее замораживание с последующей лиофилизацией целевого продукта (2).

Известен способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток штаммом ВГИ 3 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, очистку вируссодержащей суспензии от клеточного детрита, добавление защитной среды, замораживание препарата с последующей его лиофилизацией (3).

Известен способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток штаммом ВГИ 3 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление защитной среды, обработку вируссодержащей суспензии ультразвуком, ее замораживание с последующей лиофилизацией целевого продукта (4).

Известен способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток штаммом ВГИ 3 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление защитной среды, обработку вируссодержащей суспензии ультразвуком, ее замораживание с последующей лиофилизацией целевого продукта (5).

Недостатки данных способов состоят в том, что полученные в соответствии с ними вакцины не обеспечивают достаточную защиту птиц от заболеваний БМ.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток фибробластов СПФ-эмбрионов кур (ФЭК) штаммом ВГИ 3 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление защитной среды, обработку вируссодержащей суспензии ультразвуком, ее замораживание с последующей лиофилизацией целевого продукта (6).

Недостаток способа-прототипа состоит в том, что полученная данным способом вакцина обладает низкой иммуногенной активностью в хозяйствах с высоким уровнем заболеваемости БМ.

В задачу создания группы настоящих изобретений входила разработка сухой вирусвакцины против БМ на основе нового штамма ВГИ 3 серотипа, обладающей более высокой иммуногенной активностью по сравнению с вакциной-прототипом, и способа ее изготовления.

Технический результат от использования группы предлагаемых изобретений заключается в повышении иммуногенной активности препарата.

Указанный технический результат достигнут созданием группы изобретений, образующих единый изобретательский замысел. В группу включены изобретения, одно из которых предназначено для получения другого.

Указанный технический результат достигнут созданием сухой вирусвакцины против БМ, охарактеризованной следующей совокупностью признаков:
1) сухая вирусвакцина против БМ;
2) клеточно-свободный штамм ВГИ 3 серотипа;
3) из штаммов 3 серотипа вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ;
4) штамм "ВНИИЗЖ/N110" взят в эффективном количестве;
5) вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ с биологической активностью не менее 2•10⁵ ФОЕ/см³;
6) защитная среда;
7) в качестве защитной среды вакцина содержит 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере;
8) клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ и защитная среда взяты в соотношении, мас.%:
штамм "ВНИИЗЖ/N110" - 40-60
защитная среда - остальное.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) сухая вирусвакцина против БМ:
2) клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ:
3) штамм "ВНИИЗЖ/N110" взят в эффективном качестве;
4) защитная среда.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ с биологической активностью не менее 2•10⁵ ФОЕ/см³;
2) в качестве защитной среды вакцина содержит 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере;
3) клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ и защитная среда взяты в соотношении, мас.%:
штамм "ВНИИЗЖ/N110" - 40-60
защитная среда - остальное.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются
1) сухая вирусвакцина против БМ;
2) клеточно-свободный штамм ВГИ 3 серотипа;
3) защитная среда.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком изобретения является то, что из штаммов 3 серотипа вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ, взятый в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ с биологической активностью не менее 2•10⁵ ФОЕ/см³;
2) в качестве защитной среды вакцина содержит 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере;
3) клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ и защитная среда взяты в соотношении, мас.%:
штамм "ВНИИЗЖ/N110" - 40-60
защитная среда - остальное.

Предлагаемая вакцина обладает более высокой иммуногенной активностью по сравнению с вакциной-прототипом.

Штамм "ВНИИЗЖ/N110" является новым, ранее неизвестным вариантом ВГИ.

Указанный технический результат достигнут также созданием способа изготовления сухой вирусвакцины против БМ, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:
1) способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ;
2) инфицирование культуры клеток штаммом ВГИ 3 серотипа;
3) из штаммов 3 серотипа используют штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ в эффективном количестве;
4) штамм "ВНИИЗЖ/110" ВГИ используют с биологической активностью не менее 2•10⁵ ФОЕ/см³;
5) в качестве клеточного субстрата используют культуру клеток ФЭК;
6) инкубирование зараженной культуры;
7) сбор вируссодержащей клеточной массы;
8) добавление защитной среды;
9) в качестве защитной среды используют 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере;
10) клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" и защитную среду смешивают в соотношении 1:1;
11) обработка вируссодержащей суспензии ультразвуком;
12) замораживание вируссодержащей суспензии;
13) лиофилизация целевого продукта.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ;
2) инфицирование культуры клеток штаммом "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ;
3) инкубирование зараженной культуры:
4) сбор вируссодержащей клеточной массы;
5) добавление защитной среды:
6) обработка вируссодержащей суспензии ультразвуком;
7) замораживание вируссодержащей суспензии:
8) лиофилизация целевого продукта.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) в качестве клеточного субстрата используют культуру клеток ФЭК;
2) штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ используют с биологической активностью не менее 2•10⁵ ФОЕ/см³;
3) в качестве защитной среды используют 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере;
4) клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ и защитную среду смешивают в соотношении 1:1.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ;
2) инфицирование культуры клеток штаммом ВГИ 3 серотипа;
3) инкубирование зараженной культуры;
4) сбор вируссодержащей клеточной массы;
5) добавление защитной среды;
6) обработка вируссодержащей суспензии ультразвуком;
7) замораживание вируссодержащей суспензии;
8) лиофилизация целевого продукта.

По сравнению со способом-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемого изобретения является использование нового штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) в качестве клеточного субстрата используют культуру клеток ФЭК;
2) штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ используют с биологической активностью не менее 2•10⁵ ФОЕ/см³;
3) в качестве защитной среды используют 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере;
4) клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/110" ВГИ и защитную среду смешивают в соотношении 1:1.

Достижение технического результата от использования предлагаемого способа объясняется тем, что при изготовлении вакцины используют новый штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ, обладающий по сравнению со штаммом FC-126 ВГИ более высокой иммуногенной активностью.

Исходный вирус для получения штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ выделен в 1998 году из эпителия перьевых фолликулов СПФ-цыплят, иммунизированных вируссодержащим материалом из штамма FC-126 ВГИ. Производственный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ получен методом перемежающихся пассажей через организм СПФ-цыплят и культуру клеток ФЭК. Штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ представляет собой апатогенный генетически однородный вирусный материал, легко культивируемый в культуре куриных эмбриональных фибробластов с высокой биологической активностью (титр вируса 2,0-3,0•10⁶ ФОЕ/см³) и вызывающий напряженный иммунитет по сравнению со штаммом FC-126 у привитой птицы.

Штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации, сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 18.12.98 под регистрационным номером "ВНИИЗЖ/N110-ДЕП".

Сущность изобретения пояснена на графическом материале (чертеж), на котором представлена нуклеотидная последовательность фрагмента гена gB 966-1296 штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ (жирным шрифтом отмечены его нуклеотидные отличия от штамма FC-126).

Штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки
Штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ относится к семейству Herpesviridae, роду Herpesvirus, серотипу 3.

На основании сравнительного элкектронно-микроскопического изучения производственного штамма FC-126 и штамма "ВНИИЗЖ/N110" при репродукции их в культурах клеток установлена идентичность характеристик обоих штаммов. Эти вирусы проходили онтогенетический цикл развития в нуклеоплазме, а в цитоплазме - завершающие стадии морфогенеза. Внутриядерный цикл развития включает стадии виропласта, нуклеоида, сборку нуклеокапсида, формирование наружной суперкапсидной мембраны. Наиболее частой формой, присутствующей на всех стадиях культивирования, является нуклеокапсид с нуклеотидом, представленным плотным образованием, заключенным в капсидную белковую оболочку. При электронно-микроскопическом исследовании штамм "ВНИИЗЖ/N110" представлен типичными для вирусов герпеса группами В вирионами, имеющими икосаэдрическую форму, нуклеокапсид содержит 2-нитевую ДНК. В ядре пораженной клетки вирион имеет величину 90-100 нм, в цитоплазме размер его увеличивается за счет белковой оболочки до 180-200 нм. Оболочка состоит из 162 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ относится к серотипу 3. При введении в организм вызывает латентно протекающую вирусемию. Антитела к данному вирусу обнаруживают в крови у цыплят к 14-21-дневному сроку с дальнейшим нарастанием к 40-60 дню. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП и ИФА. Активность в РСК не установлена. Концентрированный антиген "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ реагирует в РДП со специфическими сыворотками ВГИ и ВБМ. Выявляются общие антигены с ВБМ в прямой и непрямой РИФ. При разрушении клетки вступает в реакцию с антителами к ВГИ и ВБМ в РН. В ИФА вступает в реакцию с антителами к ВГИ и ВБМ.

Биотехнологические характеристики
Штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ активно размножается в СПФ-эмбрионах кур и в первично-трипсинизированной культуре клеток ФЭК. Трипсинизацию эмбрионов и культивирование фибробластов проводят по общепринятым методикам с использованием смеси сред на основе ГЛА, Игла и 199, взятых в равных частях, с добавлением 10% сыворотки крови КРС. Клетки фибробластов выращивают во флаконах емкостью 50 см³ и 100 см³ (Повицкого), в матрасах емкостью 1,5 дм³ и в роллерных 3-литровых сосудах. Посевная концентрация для флаконов и матрасов составляет 400-500 кл/см³, для роллерных сосудов от 1,2 до 1,5 млн. кл/см³. При размножении в культуре фибробластов вирус проявляет ярко выраженный цитопатический эффект-образование характерных фокусов, состоящих из рефрактильных округлых клеток (поликариоцитов). Размеры фокуса достигают 0,1-0,2 мм. При проведении последовательных пассажей в культуре клеток ФЭК инфекционный титр вируса увеличивался и достигал 2,0-3,0•10⁶ ФОЕ/см³ (фокусообразующих единиц).

При заражении 6-суточных СПФ-эмбрионов кур в желточный мешок штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ вызывает их гибель до 20% на 3-5 сутки инкубации. У павших эмбрионов отмечают отставание в росте, гепатиты, увеличение селезенки и почек. На хориоаллантоисной оболочке образуются мелкие бляшки серовато-белого цвета звездчатой формы размером до 1 мм в небольших количествах. У эмбрионов развивается гепатит. Штамм "ВНИИЗЖ/N110" предназначен для использования в качестве сырья для приготовления живой вакцины против БМ.

Результаты определения репродуктивной способности штамма "ВНИИЗЖ/N110" в культуре клеток ФЭК представлены в таблице 1.

Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм "ВНИИЗЖ/N110" является ДНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 108-120х10⁶ Да. Нуклеиновая кислота представлена двуцепочечной линейной молекулой. Содержание G+C-46%. Вирион состоит из нуклеоида, икосаэдрического капсида, асимметрично расположенного вокруг капсида электронно-плотного материала, обозначаемого как тегумент, и липопротеидной оболочки. Вирионная ДНК участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Основными антигенными белками являются гликопротеины А (gA) и В(gB). Гликопротеин В играет важную роль в индукции защитного иммунитета и является высококонсервативным среди герпесвирусов. Он представляет собой комплекс трех гликопротеинов: gp 49; gp 60 и gp 100.

Проведено определение первичной структуры фрагмента гена gB вируса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования амплифицированного фрагмента.

Изучение нуклеотидной последовательности генома штамма "ВНИИЗЖ/N110" методом секвенирования по Сенгеру показало, что фрагмент гена gB966-1296 H имеет 2 нуклеотидные замены в позициях 1038H "C" на "Т", 1200H "А" на "G" и одну замену в позиции 1175H с "Т" на "C" в отличие от штамма FC-126, представленного в международном генбанке. Таким образом, штамм "ВНИИЗЖ/N110" отличается от штамма FC-126 по трем нуклеотидным основаниям, однако все три мутации не приводят к заменам соответствующих аминокислот. Гомология нуклеотидной структуры исследованного фрагмента штаммов FC-126 и "ВНИИЗЖ/N110" составляет 99,1%. Результаты исследований представлены на прилагаемом графическом материале.

Устойчивость к внешним факторам
Устойчивость штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ к физическим и химическим факторам характеризуется следующими данными. Центрифугирование при 50000 g осаждает вирус в течение 1 часа. В пределах рН 4-10 вирус чувствителен к эфиру.

Вирус выдерживает неоднократное замораживание-оттаивание и воздействие ультразвуком в течение 10 мин. Полная термоинактивация вируса происходит при 4^oC через 2 недели хранения, при 20-25^oC - через 4 дня, при 37^oC - через 18 часов и при 60^oC - за 10 мин.

Хранение и консервирование
Вирус сохраняется в клеточно-ассоциированном виде в смеси равных объемов сред на основе гидролизата лактальбумина (ГЛА), Игла и 199 с 20% сыворотки крови КРС и 10% диметилсульфоксида в герметически запаянных ампулах в жидком азоте при -196^oC в течение 24 месяцев.

Патогенные свойства
Не вызывает инфекции у птиц, контагиозность не установлена.

Лабораторные и домашние животные к вирусу не чувствительны.

Иммуногенность штамма
Штамм "ВНИИЗЖ/N110" вызывает иммунитет в дозе 1000 ФОЕ у 90-98% цыплят в производственных условиях. Иммуногенность не меняется в течение 5 последовательных пассажей.

Дополнительные признаки и свойства
Штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ свободен от контаминации бактериальной и грибковой флорой, чужеродными вирусами и микоплазмами, безвреден в 10-кратной дозе для суточных цыплят.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным изолятом ВГИ.

В таблице 2 приведены результаты сравнительного изучения признаков и свойств штамма "ВНИИЗЖ/N110" и штамма FC-126.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемых изобретений, позволили установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемых изобретений. Определение из перечня выявленных аналогов прототипов, как наиболее близких по совокупности признаков аналогов, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины и способа ее изготовления, изложенных в независимых пунктах формулы.

Следовательно, заявляемые изобретения соответствуют условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствие предлагаемых решений условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительные части независимых пунктов формулы. Результаты поиска показали, что предлагаемые решения не вытекают для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемых изобретений), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемых изобретений преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемая вакцина и способ ее изготовления соответствуют условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемых изобретений пояснена примерами их исполнения.

Пример 1
Для получения клеточной суспензии, выращивания первичных культур клеток ФЭК и культивирования ВГИ, штамм "ВНИИЗЖ/N110", используют трипсин, солевой раствор Хенкса или Эрла, среду Игла, 0,5% раствор ГЛА на растворе Хенкса (ГЛАХ) или Эрла (ГЛАЭ), среду 199 и сыворотку крови КРС. В качестве ростовой среды используют смесь равных объемов среды Игла, среды ГЛАЭ, среды 199 и 10% сыворотки крови КРС. pH ростовой среды устанавливают в пределах 7,0-7,2. В качестве поддерживающей среды для культивирования ВГИ, штамм "ВНИИЗЖ/N110", используют смесь равных объемов среды Игла, среды ГЛАЭ, среды 199 и 2% сыворотки КРС. рН поддерживающей среды устанавливают в пределах 7,4-7,6.

Для получения первичной культуры клеток используют СПФ-эмбрионы кур 11-12-суточного возраста. Эмбрионы разделывают в асептических условиях и промывают 3-5 раз раствором Хенкса, содержащим по 200 ед/мл пенициллина и стрептомицина. После этого эмбрионы помещают в плоскодонный сосуд объемом 1-2 дм³ и заливают теплым (36-37^oC) 0,25-0,3% раствором трипсина в соотношении ткани и жидкости 1:5. Сосуд устанавливают на термостатирующую магнитную мешалку на 35 минут. Сосуд снимают с магнитной мешалки, жидкость фильтруют в центрифужный флакон, в который добавляют 2% к объему жидкости сыворотки крови КРС для нейтрализации действия трипсина. Отфильтрованную клеточную суспензию немедленно центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования трипсин сливают, а к клеточному осадку добавляют ростовую среду в объеме, равном объему удаленного трипсина, и энергичным встряхиванием ресуспендируют. Полученную клеточную суспензию фильтруют. Фильтр промывают ростовой средой в объеме 100-200 см³. Концентрация данной суспензии должна составлять ≈ 10 млн. кл/см³. Количество клеток подсчитывают в камере Горяева. Концентрированную суспензию клеток разводят до посевной концентрации 1,3-1,5 млн/см³ для бутылей и 0,6-0,7 млн/см³ для 50 см³ флаконов, используемых для титрования вакцинного вируса, и расфасовывают по емкостям. Бутыли вращают со скоростью 8-10 об/мин. Для заражения вирусом используют 48-72-часовой монослой клеток.

Для изготовления производственной серии вакцины используют вирус маточной расплодки, проверенный на стерильность, безвредность, отсутствие контаминации чужеродными вирусами и микоплазмами и имеющий активность не ниже 1•10⁵ ФОЕ/см³.

Изготовление производственной серии вакцины включает следующие этапы: "освежение" и поддержание вируса в пассажах, съем инфицированных клеток с последующим диспергированием и сушкой, формирование серии вакцины и ее контроль.

Освежение вируса проводят двумя последовательными пассажами. Для этого в бутылях с монослоем культуры клеток ФЭК проводят замену ростовой среды на поддерживающую и вносят в бутыль вирус из расчета 200000 ФОЕ. Количество ампул, используемых для заражения, определяют, исходя из титра маточного штамма вируса. Ампулы достают из жидкого азота и немедленно помещают в воду с температурой 27^oC до полного размораживания, затем ампулы обрабатывают 3% раствором перекиси водорода, фламбируют и вскрывают. Содержимое ампул объединяют и разводят питательной средой из расчета, чтобы в каждом см³ суспензии содержалось 10000 ФОЕ. Для первого пассажа заражают не менее 6 бутылей. Бутыли с зараженным монослоем помещают в термальные комнаты на 3-4 суток при температуре 37-38^oC. К моменту сбора вируса типичное ЦПД в виде фокусов должно быть отчетливо видно под микроскопом (50-70% поражения монослоя). Из бутылей удаляют поддерживающую среду и вносят подогретый до 37^oC 0,25 раствор трипсина в объеме 90-120 см³ на бутыль. Монослой смачивают раствором трипсина в течение 1-3 минут, затем его быстро удаляют, а бутыли помещают в термальную комнату на 10-15 минут или вращают при комнатной температуре 5-7 минут со скоростью 20 об/мин. По истечении времени в бутыли вносят поддерживающую среду без сыворотки, энергичным встряхиванием отслаивают клетки от стекла и суспендируют в ней, не допуская образования пены. Полученным вирусом проводят второй пассаж из расчета 1:8-1:10, т.е. инфицированными клетками, снятыми с 1 бутыли, можно заразить 8-10 бутылей. Вирус второго пассажа культивируют в течение 48-72 часов до появления ЦПД на 70-80% поверхности монослоя.

Затем проводят съем инфицированных клеток. Для этого из бутылей удаляют поддерживающую среду, в каждую бутыль вносят по 60-90 см³ 0,25% раствора трипсина, подогретого до 37^oC, и вращают бутыли 5-7 минут в термальной комнате. Резким встряхиванием клетки отслаивают от стекла. Затем полученным вирусом проводят третий пассаж из расчета 1:10-1:20, четвертый пассаж из расчета 1: 50-1:100 и при необходимости пятый. В третьем, четвертом и пятом пассажах вирус культивируют 48-72 часа до появления ЦПД на 80-90% поверхности монослоя. Съем клеток осуществляют также, как и после второго пассажа. После третьего, четвертого и пятого пассажей полученный клеточно-ассоциированный вирус подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10 минут для удаления трипсина. После этого вируссодержащую суспензию сливают в охлаждаемые тающим льдом мерные цилиндрические флаконы объемом 250,0 или 500,0 см³, в которые вносят в соотношении 1:1 к объему суспензии защитную среду, содержащую 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере. Смесь подвергают ультразвуковой обработке для получения клеточно-свободного вируса. Ультразвуковую дезинтеграцию клеток осуществляют при частоте 20 кГц и мощности 600 Вт в течение 250-300 секунд с 10-секундным перерывом через каждые 10 секунд. После завершения ультразвуковой обработки вакцину сливают в емкости. В вакцине клеточно-свободный вирус должен быть с активностью не ниже 2,0•10⁵ ФОЕ/см³ и свободен от контаминации бактериальной и грибковой флорой. Емкости с вакциной помещают в мелко наколотый лед так, чтобы охлаждалась равномерно вся суспензия, и вакцину фасуют по 1,0-2,0 см³ в заранее промаркированные пенициллиновые флаконы, которые помещают в стерильные кассеты. При расфасовке в 2,0 см³ пенициллиновые флаконы титр клеточно-свободного вируса должен быть не ниже 2,0•10⁵ ФОЕ/см³ и при расфасовке в 1 см³ флаконы - не ниже 4,0-10⁵ ФОЕ/см³. Кассеты закрывают 2-слойной стерильной марлей и загружают в холодильник для замораживания.

Процесс замораживания и сушки контролируется температурными датчиками. Вакцину замораживают до -45^oC. Замороженную вакцину подвергают высушиванию методом сублимации. Сушка продолжается 24-28 часов. После окончания сушки флаконы с вакциной укупоривают пробками и закатывают металлическими колпачками. Готовую вакцину контролируют в соответствии с ТУ. Стабильность вируса в вакцине проверяют по величине снижения титра его инфекционности после хранения образцов сухой вакцины в течение 1 мес. при 4-6^oC. Титр вируса при хранении в указанных условиях практически не меняется.

Сухая культуральная вирусвакцина против БМ представляет собой заключенную во флаконы однородную мелкопористую массу белого цвета в виде таблетки цилиндрической формы. Срок годности вакцины 12 месяцев со дня изготовления при условии соблюдения правил хранения и транспортирования.

Полученная сухая вирусвакцина против БМ имеет оптимальный компонентный состав, мас.%:
клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ - 40-60
защитная среда - остальное
Пример 2
Проведены испытания сухой вирусвакцины против БМ, содержащей, мас.%:
клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ - 50
защитная среда - 50
Для определения иммуногенной активности полученной вакцины использовали односуточных цыплят. Для этого были сформированы 4 группы цыплят:
1 группа - контроль опыта;
2 группа - контроль вирулентного вируса;
3 группа - вакцинирована лиофилизированной вакциной на основе штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ;
4 группа - вакцинирована лиофилизированной вакциной на основе штамма FC-126 ВГИ.

Лиофилизированные вакцины разводили дистиллированной водой. Цыплятам вводили вакцины в объеме 0,2 см³ внутримышечно в области бедра. Через 14 дней после вакцинации цыплята групп 2, 3 и 4 были подвергнуты контрольному заражению вирулентным штаммом "Конкур" вируса БМ в объеме 0,2 см³ внутримышечно. Продолжительность испытаний зависела от падежа 60% голов контрольной группы, что составило 150 дней. На протяжении всего опыта за птицей вели клиническое наблюдение. Всех павших цыплят вскрывали и учитывали патологические изменения внутренних органов, на 65 и 150 дни было проведено контрольное взвешивание.

Эффективность вакцинации определяли после убоя подопытной птицы с учетом изменений как при вскрытии, так и данных вскрытия павшей в процессе опыта птицы.

Эффективность рассчитывали по формуле

где Э - эффективность вакцинации в %;
В - % птицы с признаками болезни Марека в вакцинированной группе;
К - % птицы с признаками болезни Марека в контрольной группе.

Результаты эксперимента по определению иммуногенности образцов лиофилизированных вакцин против БМ представлены в таблице 3.

Пример 3
Проведена оценка эффективности применения сухой вирусвакцины против БМ из штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ в условиях птицефабрики "Дружба" Барановичского района Брестской области Республики Беларусь. Опыт проведен на суточных цыплятах-бройлерах в период откорма в течение 47,5 дней. Испытание проводилось в птичнике N 29 бригады 3. Результаты испытаний представлены в таблице 4.

Приведенные в таблице 4 данные свидетельствуют о положительном влиянии проведенной вакцинации суточных цыплят-бройлеров на производственные показатели.

Пример 4
Проведена оценка эффективности применения сухой вирусвакцины против БМ из штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ в условиях птицефабрики "Васильевская" в Пензенской области. Опыт проведен на суточных цыплятах-бройлерах в период откорма. Результаты испытаний представлены в таблице 5.

Согласно приведенным в таблице 5 данным сохранность поголовья в опытных партиях повысилась по сравнению с контрольными в среднем на 5,5%.

Пример 5
Проведена оценка эффективности применения сухой вирусвакцины против БМ из штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ в условиях ОАО "Тольяттинская птицефабрика". Было провакцинировано 87 000 голов суточных цыплят-бройлеров сухой культуральной вакциной против БМ из штамма "ВНИИЗЖ/N110" (2 напольных корпуса и 1 клеточный). В качестве контроля было взято также 2 напольных корпуса и 1 клеточный корпус в количестве 88770 голов.

Результаты испытаний приведены в таблице 6.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании группы предлагаемых изобретений следующей совокупности условий:
- сухая вирусвакцина против БМ на основе штамма "ВНИИЗЖ/N110" и способ ее изготовления, воплощающие предлагаемые изобретения, предназначены для использования в сельском хозяйстве, в именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для группы предлагаемых изобретений в том виде, как они охарактеризованы в независимых пунктах формулы изобретения, подтверждена возможность их осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- при использовании предлагаемых сухой вирусвакцины и способа ее изготовления достигается технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения. Следовательно, предлагаемая группа изобретений соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания на группу изобретений к заявке на выдачу патента РФ на "Сухую вирусвакцину против БМ и способа ее изготовления"
1. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998, с. 689-721.

2. Пат. ГДР N 209738, А 61 К 39/255, С 12 N 7/00, 23.05.84.

3. Пат. PCT N 93/18790, А 61 К 39/12, 39/15, 39/255, 30.09.93.

4. Пат. ЕПВ N 0496135, А 61 К 39/255, 27.07.94.

5. Пат. ЕПВ N 0703294, C 12 N 7/00, A 61 K 39/255, 27.03.96.

6. Пат. PCT N93/23078, A 61 К 39/255, 25.11.93 (прототип).

7. Коровин Р.Н. Особенности эпизоотологии БМ и организации мер борьбы с ней в птицеводческих хозяйствах промышленного типа: Автореф. дис. д-ра вет. наук. - Л., 1989, 34 с.

8. Лукина В.А., Коровин Р.Н., Деревлева Т.А. Стабильность штаммов вируса герпеса индеек по некоторым показателям эффективности вакцины против БМ. Передовой научно-производ. опыт в биол. пром. - М., 1987, 24 с.

9. Авт.свид. СССР N 792643, А 61 К 39/255, 1979.

10. Никитин Е. Е. , Токарик Э.Ф., Слепенко Т.Б. и др. Получение сухой вакцины против болезни Марека. - Ветеринария, 1973, 12, с. 45-47.

11. Слепенко Т. Б., Лукина В.А., Адамушкин В.Е. Размножение вакцинного вируса в организме цыплят, привитых вакциной против болезни Марека. Передовой научно-производ. опыт в биол. пром. - М., 1980, 5.

12. Слепенко Т.Б. и др. Получение и титрование свободного от клеток ВГИ. Труды ВГНКИ, 1975, 21, с. 49-54.

13. Calnak B.W. et al. Lyophilization of cell free Marek's disease herpesvirus and a herpesvirus from turkeys. - Appl. Microbiol, 1970. P. 20.

14. Witter R.L Protection by attenuated and polyvalent vaccines against highly virulent strains of Marek's disease virus. - Avian Pathol., 1989, 11, 1.

Изобретение предназначено для профилактики болезни Марека (БМ). Вирусвакцина содержит клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" (коллекция ВГНКИ) вируса герпеса индеек (ВГИ) и защитную среду. Вакцина содержит, мас.%: штамм ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110" 40 - 60, защитная среда остальное. В качестве защитной среды используют 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере. В качестве клеточного субстрата используют культуру клеток фибробластов СПФ-эмбрионов кур (ФЭК). Штамм ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110" ВГИ используют с биологической активностью не ниже 2•10⁵ ФОЕ/см³. Инфицированную клеточную массу смешивают с защитной средой. Подвергают ее дезинтеграции ультразвуком для получения клеточно-свободного вируса. Вакцину замораживают и сушат методом лиофилизации. Изобретение повышает иммуногенную активность вакцины. 2 с. и 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 6 табл.

1. Сухая вирусвакцина против болезни Марека, содержащая клеточно-свободный штамм вируса герпеса индеек 3 серотипа в защитной среде, отличающаяся тем, что из штаммов 3 серотипа вакцина содержит штамм вируса герпеса индеек, сем. Herpesviridae, род Herpesvirus, ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" в эффективном количестве. 2. Сухая вирусвакцина по п.1, отличающаяся тем, что вакцина содержит штамм ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" вируса герпеса индеек с биологической активностью не ниже 2 • 10⁵ ФОЕ/см³,
3. Сухая вирусвакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве защитной среды вакцина содержит 8%-ный раствор сахарозы в фосфатном буфере. 4. Сухая вирусвакцина по п.1 или 3, отличающаяся тем, что клеточно-свободный штамм ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" и защитная среда взяты в соотношении, мас.%:
Клеточно-свободный штамм ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" - 40 - 60
Защитная среда - Остальное
5. Способ изготовления сухой вирусвакцины против болезни Марека, включающий инфицирование культуры клеток штаммом вируса герпеса индеек 3 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление защитной среды, обработку вируссодержащей суспензии ультразвуком, замораживание вируссодержащей суспензии и лиофилизацию целевого продукта, отличающийся тем, что из штаммов 3 серотипа используют штамм вируса герпеса индеек, сем. Herpesviridae, род Herpesvirus, ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" в эффективном количестве. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что инфицируют культуру клеток фибробластов СПФ-эмбрионов кур. 7. Способ по п.5, отличающийся тем, что получают целевой продукт с содержанием ВГНКИ штамм "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" вируса герпеса индеек с биологической активностью не ниже 2 • 10⁵ ФОЕ/см³. 8. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве защитной среды используют 8%-ный раствор сахарозы в фосфатном буфере. 9. Способ по п.5, отличающийся тем, что в клеточно-свободный штамм ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" добавляют защитную среду в соотношении 1:1.