СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/483 

Изобретение относится к медицине, а именно к наркологии, и может быть использовано для выявления хронической алкогольной интоксикации (ХАИ) у человека.

Известен способ диагностики хронической алкогольной интоксикации путем проведения иммуноферментного анализа с альбумином, конъюгированным с ацетальдегидом, и (или) неконъюгированным альбумином с определением титра антител класса А к альбумину, конъюгированному с ацетальдегидом, и неконъюгированному альбумину (В журнале: Вопросы наркологии, 1999, 4, с. 38-42).

Недостатком этого способа является низкая специфичность (48%) иммуноферментного анализа (ИФА) при диагностике ХBИ только по уровню антител к альбумину, конъюгированному с ацетальдегидом. Чувствительность при этом составляет 74%. Специфичность теста существенно повышается (до 82%), если при оценке результатов исследования учитывается не только титр специфических антител, но также соотношение титров антител к альбумину, конъюгированному с ацетальдегидом, и неконъюгированному альбумину (соответственно к КА и к НКА). Однако при этом отмечается значительное снижение чувствительности диагностики (до 42%).

Техническим результатом предлагаемого способа диагностики ХАИ является повышение точности диагностики за счет одновременного достижения высокой чувствительности и специфичности ИФА (соответственно 71 и 83%).

Этот результат достигается тем, что определяют разность величин оптической плотности при взаимодействии сыворотки крови с альбумином, конъюгированным с ацетальдегидом, и неконъюгированным альбумином, титр антител класса А к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом, определяют при разности не менее 0,1, и при титре не менее 64 диагностируют хроническую алкогольную интоксикацию.

Не вытекает явным образом из известного уровня техники тот факт, что определение антител класса А к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом, в титре не менее 64 при разности величин оптической плотности, обнаруживаемой при взаимодействии сыворотки крови с альбумином, конъюгированным с ацетальдегидом, и неконъюгированным альбумином не менее 0,1 (а не при разнице титров антител к КА и к НКА, как это было указано в способе по прототипу), будет способствовать повышению точности диагностики.

Способ осуществляют следующим образом:
В основе способа диагностики хронической алкогольной интоксикации по уровню антител к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом, в сыворотках крови лежит непрямой вариант иммуноферментного анализа, для осуществления которого необходимо:
1. Проведение непрямого варианта иммуноферментного анализа.

2. Система учета получаемых результатов.

3. Определение величины условно-диагностического титра антител для выявления ХАИ с помощью ИФА.

4. Оценка чувствительности и специфичности способа для диагностики ХАИ.

1. Проведение непрямого варианта ИФА
Сенсибилизация 96-луночных полистироловых плоскодонных планшетов для проведения иммуноферментного анализа (фирмы Dinatech, Nunc, Costar или их аналоги отечественного производства) антигенами - очищенным препаратом сывороточного альбумина человека коммерческого производства, например фирмы Serva, или конъюгатом этого белка с ацетальдегидом, полученным в системе in vitro в лаборатории иммунохимии НИИ наркологии. Для этого в лунки планшета вносят по 100 мкл раствора антигенов (КА или НКА) с концентрацией белка 2,8 мкг в 1 мл 0,05 М карбонат-бикарбонатного буфера, рН 9,5. Сорбцию антигенов осуществляют в течение 18 ч при температуре 20-22^oС.

Несвязавшиеся с полистиролом антигены восемь раз отмывают забуференным фосфатами физиологическим раствором, рН 7,2-7,4, содержащим 0,1% Твина-20 производства фирмы Sigma, США (ЗФР-Т). Отмывку планшетов проводят путем заполнения лунок промывной жидкостью (ЗФР-Т) с последующим ее отсасыванием. По завершении этого процесса планшет просушивают, стряхивая остаток жидкости на фильтровальную бумагу.

В лунки планшетов, сенсибилизированные КА или НКА, вносят по 100 мкл исследуемой сыворотки крови в последовательных двукратных разведениях, приготовленных на ЗФР-Т. Планшет с сыворотками инкубируют при 37^oС в течение 1 ч.

Планшет отмывают от несвязавшихся с антигенами антител по методике, описанной выше.

В лунки планшета вносят по 100 мкл иммунопероксидазного реагента, полученного в лаборатории иммунохимии НИИ наркологии и представляющего собой антитела против иммуноглобулинов человека класса А, меченные пероксидазой хрена. Фиксированное рабочее разведение, подобранное в предварительном эксперименте, готовят на ЗФР-Т. Планшет инкубируют при 37^oС в течение 1 ч.

Планшет отмывают 10 раз ЗФР-Т в соответствии с методикой, описанной выше.

Иммунологическое взаимодействие компонентов выявляют внесением в лунки по 100 мкл субстратной смеси, представляющей собой 0,04% раствор ортофенилендиамина (фирма Sigma, США) в 0,05 М цитратно-фосфатном буфере, рН 5,0, с добавлением 30% перекиси водорода из расчета 4 мкл на 10 мл раствора. Планшет инкубируют в темноте при 20-22^oС в течение 30 мин, после чего дальнейшее развитие окраски ингибируют добавлением 50 мкл 10% серной кислоты.

2. Система учета результатов исследования
Результаты учитывают спектрофотометрически при длине волны 490 нм. Учет результатов осуществляют, исходя из разности показателей оптической плотности, обнаруживаемых при взаимодействии исследуемой сыворотки крови с альбумином, конъюгированным с ацетальдегидом, и с неконъюгированным альбумином. Титр антител к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом, соответствует величине, обратной максимальному разведению сыворотки крови, при котором разность показателей оптической плотности оказывается не менее 0,1.

3. Определение величины условно-диагностического титра антител
Для того чтобы диагностировать ХАИ по результатам иммуноферментного анализа, необходимо определение величины условно-диагностического титра (диагностического порога). Эта необходимость продиктована, в первую очередь, тем, что ацетальдегид, а следовательно, и антитела к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом, обнаруживаются не только у лиц, злоупотребляющих спиртными напитками, но также и у непьющих людей.

Величину условно-диагностического титра определяют в предварительном эксперименте, исходя из результатов обследования больных хроническим алкоголизмом и социально пьющих лиц (доноров крови). В таблице 3 представлены усредненные показатели оптической плотности, обнаруженные с помощью ИФА в исследованных сыворотках крови при выявлении антител класса А к сывороточному альбумину человека коммерческого производства и к конъюгату этого белка с ацетальдегидом. Очевидно, что строка, обозначенная в таблице как "Δ ОП", отражает результаты титрования антител к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом. Было показано, что в том случае, когда Δ ОП приближается к 0,1, но не опускается ниже этого значения, различие показателей оптической плотности, регистрируемых в исследуемых сыворотках крови при выявлении антител к КА и к НКА, еще является статистически достоверным. Именно поэтому за титр сыворотки была принята величина, обратная такому ее разведению, при котором значение ΔОП оказывается не менее 0,1, что свидетельствует о наличии в ней антител к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом. Из таблицы 1 видно, что у больных алкоголизмом титр антител к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом, равняется 64. Оказалось также, что у 75% из 12 обследованных социально пьющих лиц (доноры крови) антитела этой специфичности регистрируются в более низких титрах. На основании полученных результатов принятое значение условно-диагностического титра соответствовало 64 (6,0 - log₂).

4. Определение чувствительности и специфичности способа
Оценку диагностических параметров способа выявления хронической алкогольной интоксикации с применением ИФА осуществляют по методике, предложенной ВОЗ (Власов В.В. Эффективность диагностических исследований. - М.: Медицина. - 1988. - 254 с.).

Чувствительность - количество лиц с хронической алкогольной интоксикацией (в %), у которых титр антител к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом, равняется условно-диагностическому значению или превышает его.

Специфичность - количество социально-пьющих людей (в %) с титрами специфических антител ниже условно-диагностического.

Диагностические характеристики предлагаемого способа выявления ХАИ с помощью ИФА, полученные исходя из результатов обследования больных алкоголизмом (120 человек) и социально пьющих лиц (71 человек), представлены в таблице 4. Для сравнения в этой таблице представлены также диагностические параметры при выявлении ХАИ способом по прототипу.

Таким образом, чувствительность и специфичность предлагаемого способа выявления хронической алкогольной интоксикации с помощью ИФА соответственно равны 71 и 83%, что выгодно отличает его от способа по прототипу и позволяет говорить о реальной возможности использования его для диагностических целей.

Пример 1. Больной В., 1946 года рождения, история болезни 443, госпитализирован в клинику НИИ наркологии 23.04.1999 г. с диагнозом алкоголизм 2 степени у синтонной личности, малопрогредиентное течение заболевания. У больного было выявлено также диффузное поражение печени и калькулезный панкреатит. Длительность хронической алкогольной интоксикации - 20 лет, давность сформировавшегося алкогольного абстинентного синдрома - 9 лет, суточная алкогольная толерантность - 0,8 л, длительность воздержания от алкоголя - 2 дня. С помощью предлагаемого способа в сыворотке крови больного выявляли антитела к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом. Титр специфических антител у этого больного соответствовал 64 (таблица 1), т.к. при этом разведении сыворотки разность величин оптической плотности при ее взаимодействии с КА и НКА соответствует 0,170 (0,557-0,387). Полученные предлагаемым способом результаты подтвердили диагноз, поставленный на основании клинического обследования (хроническая алкогольная интоксикация), поскольку антитела к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом, обнаруживались у него в диагностически значимом титре.

Пример 2. Донор крови К., 1950 года рождения, сдававший кровь на Городской станции переливания крови г. Москвы, был обследован с помощью предлагаемого способа на наличие антител к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом. Как следует из результатов, представленных в таблице 2, разность величин оптической плотности, обнаруживаемая при взаимодействии этой сыворотки крови, разведенной в 32 раза, с КА и НКА равняется 0,155 (0,547-0,392). Обследуемый не страдает хронической алкогольной интоксикацией, поскольку антитела к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом, выявляются у него в титре, соответствующем 32, что ниже условно-диагностического значения.

Указанным способом были обследованы больные алкоголизмом и лица с не установленным алкогольным анамнезом (социально пьющие люди; социально пьющие люди, не употреблявшие алкоголь по крайней мере в течение одного месяца до обследования - "отрицательный" контроль; больные опийной наркоманией, больные вирусным гепатитом В или С, лица с заболеваниями печени и желчевыводящих путей; больные, проходившие курс реабилитационного лечения после инфаркта миокарда; больные аллергиями и аутоиммунными расстройствами). Из представленных в таблице 5 результатов следует, что антитела класса А к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом, выявляемые с помощью ИФА по предлагаемому способу, у больных алкоголизмом регистрируются в достоверно более высоких титрах, чем у лиц с не установленным алкогольным анамнезом. Наличие у последних различных патологических состояний, напрямую не связанных со злоупотреблением алкоголем, не влияет на результаты обследования, поскольку средний уровень специфических антител у таких больных практически не отличается от аналогичного показателя в социально пьющей группе.

На основании выведенного значения условно-диагностического титра антител с помощью ИФА среди представителей указанных выше групп выявляли лиц, предположительно злоупотребляющих спиртными напитками. Полученные результаты представлены в таблице 6. Для сравнения в этой таблице демонстрируются результаты аналогичного исследования, проведенные способом по прототипу.

Диагностически значимые титры антител к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом, полностью отсутствовали у социально пьющих лиц, не употреблявших алкоголь по крайней мере в течение одного месяца до обследования, и обнаруживались лишь у 8 - 18% обследованных с не установленным алкогольным анамнезом. При этом специфические антитела в условно-диагностическом или более высоком титре (до 1024) у больных алкоголизмом регистрировались достоверно чаще, чем во всех прочих группах. Совпадение диагноза, полученного с помощью предлагаемого способа, с клиническим имело место в 71% случаев. Особенно важно, что активизация аутоиммунных процессов и накопление аутоантител, в частности аутоантител к сывороточному альбумину, часто обнаруживаемые при различных заболеваниях печени, сердца, иммунной системы и т.п., не влияют на результаты диагностики ХАИ с помощью рассматриваемого способа, чем он выгодно отличается от способа по прототипу.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики ХАИ имеет преимущества перед известными, заключающиеся в одновременном повышении чувствительности и специфичности ИФА (соответственно 71 и 83%). Предлагаемый способ диагностики ХАИ исключает также зависимость результатов обследования от состояния аутоиммунной системы, чем выгодно отличается от способа по прототипу.

Изобретение относится к медицине, а именно к наркологии, и может быть использовано для диагностики хронической алкогольной интоксикации. Сущность способа заключается в определении разности величин оптической плотности при взаимодействии сыворотки крови с альбумином, конъюгированным с ацетальдегидом, и неконъюгированным альбумином и определении титра антител класса А к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом, при разности не менее 0,1 и титре не менее 64 диагностируют хроническую алкогольную интоксикацию. Техническим результатом является повышение точности диагностики хронической алкогольной интоксикации. 6 табл.

Способ диагностики хронической алкогольной интоксикации с помощью иммуноферментного анализа с альбумином, конъюгированным с ацетальдегидом, и неконъюгированным альбумином с определением титра специфических антител класса А, отличающийся тем, что определяют разность величин оптической плотности при взаимодействии сыворотки крови альбумином, конъюгированным с ацетальдегидом, и неконъюгированным альбумином, титр антител класса А к альбумину, химически связанному с ацетальдегидом, определяют при разности не менее 0,1, и при титре не менее 64 диагностируют хроническую алкогольную интоксикацию.