СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АЛКОГОЛЬНОГО ПОРАЖЕНИЯ ПОЧЕК Российский патент 2002 года по МПК G01N33/53 G01N33/543 

Изобретение относится к медицине, нефрологии, конкретно к способам диагностики алкогольного поражения почек.

Известные способы заключаются в диагностике при остром токсическом поражении почек.

К ним относятся рентгенодиагностика, ультразвуковое исследование, непрямая радиоизотопная реноангиография, радиоизотопная ренография I и II варианты, биохимические методы (определение содержания мочевины, креатинина), флюоресцентный метод определения общей концентрации альбумина, метод определения циркулирующих иммунных комплексов. Ферментативный метод определения холестерина и триглицеридов.

Результаты, полученные при применении того или иного способа диагностики алкогольного поражения почек, несут только часть информации о патогенетическом процессе, развивающемся в почках при этой патологии, но не могут являться критериями диагностики, не являются специфическими в связи с общностью данных и при других заболеваниях почек неалкогольного генеза, что безусловно снижает их точность и информативность.

Наиболее близким способом диагностики алкогольного поражения почек к предлагаемому является ферментативный способ определения уровня холестерина и триглицеридов, предложенный Никитиным С.В. [6] с соавт. Данный способ применяется у больных хроническим алкоголизмом с нарушениями липидного обмена или клиническими проявлениями антифосфолипидного синдрома (АФС).

Для анализа используются сыворотки, полученные в день эксперимента. Концентрацию холестерина (ХС) и липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) измеряют на автоанализаторе. Сканирование фракции липопротеидов проводят на денситометре.

Принцип известного способа заключается в осаждении липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) в растворах полиэтиленгликоля (ПЭГ). Раствор А использовали для осаждения ЛПОНП и ЛПНП, а раствор В - для осаждения всех классов липопротеидов, оставляя в насадочной жидкости только фракцию липопротеидов высокой плотности - ЛПВП₃.

При кажущейся простоте указанный способ имеет свои недостатки. Следует отметить особо, что антифосфолипидный синдром (АФС) у больных хроническим алкоголизмом с поражением почек является одним из важнейших звеньев патогенеза алкогольной нефропатии и основанием для развития морфологических изменений, типичных для нее. Антифосфолипидные антитела (АФА), вызывающие повреждения липидного слоя мембраны клеток клубочков почек, взаимосвязаны с аполипопротеином В (АпоВ), по уровню которого в сыворотке крови можно судить о напряженности процесса повреждения почек.

Поэтому, исходя из вышесказанного, недостатком ферментного метода определения холестерина и триглицеридов является, в первую очередь, то, что данным способом диагностики можно определить только уровень фракций ЛПВП, который присутствует в надосадочной жидкости. Напротив, липопротеиды низкой и очень низкой плотности (ЛПОНП и ЛПНП), в состав которых входит и фракция АпоА, осаждаются.

Липопротеиды высокой плотности дают информацию об общем состоянии липидного обмена у больных хроническим алкоголизмом и не могут отражать, даже косвенно, состояния поражения почек при алкогольной болезни. Поэтому определение их уровня в крови в таком случае малоинформативно.

Вторым, не менее серьезным недостатком этого способа диагностики является то, что на показатели фракции липопротеидов высокой плотности в сыворотке крови влияет присутствие примесей, в частности билирубина, которые искажают результаты, снижая точность способа.

За норму показателей, определенных данным способом, принимали содержание в сыворотке крови здоровых лиц содержания триглицеридов N - 1,44±0,12 ммоль/л, ЛПВП - 1,12±0,05 ммоль/л, ЛПВП₃ - 0,98±0,05 ммоль/л. Что согласуется с данными литературы [1].

При определении указанных показателей у больных хроническим алкоголизмом с поражением почек ни в одном случае не выявлено отклонения от нормальных данных, что еще раз подтверждает малую точность и низкую информативность данного способа диагностики алкогольного поражения почек.

Технической задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является повышение информативности и точности способа.

Поставленную задачу решают применением нового способа диагностики алкогольного поражения почек, включающего определение уровня липопротеидов и их фракций в сыворотке крови, причем определяют фракции липопротеидов низкой плотности и при увеличении фракции АпоВ более чем на 100% диагностируют алкогольное поражение почек,
Способ осуществляют следующим образом.

1. Кровь из локтевой вены забирают натощак, в период воздержания от приема алкоголя, который в среднем был равен 22,1 ± 1,2 дня.

2. Отделяют сыворотку.

3. Очищают сыворотку от примесей:
а) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) по методу V.Laemmli [2], в процессе которой чистоту полученных белков оценивают с помощью дискового электрофореза в полиакриламидном геле [2] . Первый пик содержит АпоВ, второй - АпоА -I, АпоЕ и третий пик - аполипопротеины С;
б) белок фракции первого пика (АпоВ) используют в качестве антигена для иммунизации кроликов в количестве 100 мкг по схеме Полякова Л.М. [3];
в) γ-глобулиновую фракцию при очистке сыворотки получают троекратным осаждением 50% (NH₄)₂SО₄ с последующим диализом против 0,01 М, фосфатного буфера, при рН 7,4, содержащего 0,15M NaCl и 0,01% NaN₃.

4. Конечный этап очистки включает ионообменную хроматографию на ДЭАЭ - сефарозе. Полученные антитела хранят в замороженном виде при температуре 70^oC.

5. Идентификацию кроличьих антител к АпоВ сыворотки крови человека проводят с помощью двойной радиальной иммунодиффузии по Ouchterlonyo [4].

Антитела дают одну полосу преципитации с изолированными ЛПНП и ЛПОНП человека и с сывороткой крови человека. Для установления оптимального разведения антител на планшет сорбируют полученный по схеме Полякова Л.М. [3] антиген в избыточном количестве 1000 мкг в ячейку при температуре 4^oС в течение ночи или в течение 1 ч при температуре 37^oС. Образцы антител раститровывают при последовательном двукратном разведении буфером, содержащим 0,05% твина-20 и 0,5% бычьего сывороточного альбумина. В наших условиях оптимальное разведение антител составило 1:1000 и 1:2000.

6. Количество АпоВ в сыворотке крови определяют методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) [1].

Полистироловые планшеты ("Nunc", Дания) инкубируют в течение ночи при температуре 4^oС или в течение 1 ч при температуре 37^oС со 100 мкл стандартной сыворотки крови человека ("Calbiochem", США), содержащей 1,2,5,10,20,50,100 нг АпоВ в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ). После инкубации незанятые места сорбции блокируют смесью 2% овальбумина и 0,5% лактальбумина. После каждого этапа связывания планшеты трижды отмывают ФСБ, содержащем твина-20 (ФСБТ). В подготовленные планшеты добавляют по 100 мкл специфических антител в разведении 1:1000 в 0,01 М растворе ФСБТ. Связавшиеся с АпоВ первые антитела на следующем этапе насыщают вторыми антителами. Для этого используют козьи антитела, меченные пероксидазой (Био.С, Новосибирск), которые разбавляют в количестве 100 мкл в каждую ячейку в разведении 1: 2000. Планшеты инкубируют в течение 1 ч при температуре 37^oС. После пятикратного отмывания ФСБТ проводят ферментативную реакцию. В ячейки вносят по 200 мкл свежеприготовленного субстрата орто-фенилендиамина ("Serva", ФРГ) в концентрации 20 мг на 100 мл 0,1 М фосфатно-цитратного буфера, рН 5,0, содержащего 0,006% Н₂О₂. Через 30 мин ферментативную реакцию останавливают добавлением 50 мкл 10н. H₂SO₄ и измеряют экстинкцию при длине волны λ=492 нм на многоканальном фотометре ("Multisan Flow", Англия). В качестве отрицательного контроля принимают значения оптической плотности в ячейках, в которых вместо антигена добавляют по 100 мкл ФСБ.

Выбор критериев основан на изучении клинического материала. Было обследовано 96 пациентов, страдающих хроническим алкоголизмом мужчин с признаками алкогольного поражения почек, составивших I основную группу обследования. Средний возраст 38,2±1,1 лет. Давность злоупотребления алкоголем более 10 лет. II группу сравнения составили 72 больных, страдающих хроническим алкоголизмом мужчин без признаков алкогольного поражения почек. Средний возраст 42,0±1,1 года. Давность злоупотребления алкоголем более 10 лет. И III группу составили 54 мужчины, не страдающие хроническим алкоголизмом, но имеющие различные заболевания почек неалкогольного генеза. Средний возраст 51,1±1,2 год.

Предложенным способом диагностики (тИФА) определяли содержание АпоВ в сыворотке крови пациентов. За норму этого показателя были приняты данные, полученные у здоровых лиц (n=16). Содержание АпоВ у них равнялось 0,94±0,001 г/л, что соответствовало данным литературы, где доверительный интервал Δ= 0,90-0,72 г/л, а средние результаты у мужчин были 0,83±0,1 г/л. При обследовании было выявлено, что самый высокий показатель содержания АпоВ в сыворотке крови был у пациентов I группы с алкогольным поражением почек и составил в среднем 3,38±0,02 г/л. Что касается уровня АпоВ у больных II и III групп, то он составил 1,16±0,02 г/л и 1,14±0,01 г/л соответственно и достоверно не отличался от показателя у здоровых лиц.

Показатель уровня АпоВ в I группе был достоверно выше (р<0,05), чем во II группе и у здоровых лиц (р<0,002). В процентом отношении повышение уровня АпоВ в сыворотке крови у больных хроническим алкоголизмом с поражением почек (I основная группа) составило 359,57% или в 3,5 раза по сравнению с нормой. Таким образом, повышение содержания АпоВ у больных I группы относительно нормальных показателей произошло на 259,57%, в то время как содержание АпоВ у пациентов II группы, страдающих хроническим алкоголизмом без поражения почек, повысилось относительно нормы только на 23% и составило 123,4%, а у пациентов III группы - на 21% и составило 121,27%. Следовательно, повышение АпоВ в сыворотке крови у больных хроническим алкоголизмом более чем на 100% можно считать критерием алкогольного поражения почек.

На основании клинического материала проведена корреляция с результатами, полученными при применении ферментативного способа определения холестерина и предлагаемого способа непрямого твердофазового иммуноферментного анализа. Выявлено, что при использовании первого способа возникали трудности при заборе крови для исследования. Согласно требованиям способа использовались сыворотки, взятые в день исследования, а это исключало возможность забора крови у большого количества пациентов одновременно. Кроме того, каждый раз для определенного количества проб необходимо было готовить свежие растворы ПЭГ ("А" и "В") и выверять их молекулярную массу, которая должна была находиться в пределах 20 000, что вызывало определенные трудности и увеличивало время исследования. При сканировании на денситометре приходилось делать поправку на наличие в сыворотках билирубина, содержание которого было тем выше, чем выраженнее клинические признаки сопутствующего алкогольного поражения печени.

Предлагаемый способ диагностики путем непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, помимо своей патогенетической обоснованности, являл большую точность полученных результатов по сравнению с предыдущим способом ввиду применения высокоочищенного от примесей билирубина апопротеина В (АпоВ). Кроме того, в процессе исследования применялись стандартные наборы сывороток крови человека, козьи антитела, меченные пероксидазой, стандартный раствор субстрата орто- фенилендиамина и твина-20. Это значительно сокращало время исследования и позволяло одномоментно определить уровень АпоВ в большом количестве проб.

Большим достоинством способа, несомненно, являлось и то, что в результате получали данные об уровне содержания такой узкоспецифичной фракции липопротеидов, как АпоВ, которую получить первым способом было невозможно. Следовательно, и информативность способа непрямого твердофазного иммуноферментного анализа значительно выше.

Преимущества предлагаемого способа диагностики алкогольного поражения почек заключаются в следующем.

1. Возможность дифференцированного подхода к лечебной тактике, назначение более обоснованных, узкоспецифических лечебных препаратов в более ранние сроки, быстрое достижение максимального эффекта лечения, уменьшение количества койко-дней, возможность более точного прогнозирования.

2. Исследование можно проводить в обычной иммунологической и биохимической лаборатории. 3. Экономическая выгода составляет в среднем 94% по сравнению с внедрением способа-прототипа (54%).

Список литературы
1. Поляков Л.М., Потеряева О.Н., Панин Л.Е. // Лабораторное дело.-1991.- 9.-С.24-27.

2. Laemmli V. // Nature.- 1970. Vol.227.- P.680-685.

3. Поляков Л.М., Потеряева О.Н. // Лабораторное дело,- 1990.- 6.-С.11-14.

4. Ouchterlony О.// Progr. Allergy.- 1958.- Vol.5.-Р. 1-77.

5. Kosther G., Molinari E., Ficher P. // Clin. Chem.- 1979.- Vol.25.- P. 939-942.

6. Никитин С. В. , Волков Е.И., Творогова М.Г. и соавт. Сопоставление методов выделения липопротеидов высокой плотности // Клин. лаб. диагностика. - 1992.- 1-2.-С.7-10.

Изобретение относится к медицине, а точнее к нефрологии. Предлагаемый способ заключается в следующем: в сыворотке крови больного определяют фракции липопротеидов низкой плотности и при увеличении АпоВ более чем на 100% диагностируют алкогольное поражение почек. Технический результат: способ обеспечивает высокую точность диагностики.

Способ диагностики алкогольного поражения почек, отличающийся тем, что определяют фракции липопротеидов низкой плотности и при увеличении Апо В более чем на 100% диагностируют алкогольное поражение почек.