СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАДОНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к наркологии и может быть использовано для определения метадона в биологических жидкостях.

Известен способ определения метадона в моче методом твердофазного иммуноферментного анализа (В журн. : Токсикологический вестник, 1995, N 4, с. 26-29).

Недостатком этого способа является невысокая чувствительность (250 нг/мл), а также непригодность для определения метадона в крови в связи с необходимостью улавливания концентрации препарата 80-100 нг/мл, имеющей место при поддерживающей терапии метадоном.

Техническим результатом предлагаемого способа определения метадона в биологических жидкостях (сыворотке или плазме крови и моче) является повышение чувствительности (снижение предела обнаружения метадона) до 10 нг/мл, а также возможность его определения не только в моче, но и в крови.

Этот результат достигается тем, что используют сыворотку крови кролика в конечном разведении 1:1600, содержащю антитела к метадону в титре 1:25600 с константой аффинности (Ka) 1,4•10⁸ М^-1.

Не вытекает явным образом из известного уровня техники тот факт, что использование сыворотки крови кролика в конечном разведении 1:1600, содержащей антитела к метадону в титре 1:25600 с Ka 1,4•10⁸ М^-1, повышает чувствительность способа определения метадона в различных биологических жидкостях (крови и моче) в 25 раз. В эксперименте показано, что при сохранении прочих параметров способа по прототипу использование конечного разведения сыворотки крови кролика в ИФА 1:1600 снижает чувствительность метода в 1,5 раза, тогда как применение сыворотки крови кролика с антителами к метадону в титре 1: 25600 по предлагаемому способу повышает чувствительность метода только в 2 раза, что не позволяет выявлять наличие метадона в крови. Таким образом, достигнутый нами технический результат - повышение чувствительности метода в 25 раз, не мог быть получен, исходя из известных закономерностей.

Способ осуществляют следующим образом.

В основе способа определения метадона в биологических жидкостях лежит конкурентный вариант иммуноферментного анализа, для осуществления которого необходимо:
I. Получение гипериммунной сыворотки кролика.

II. Проведение конкурентного (ингибиторного) иммуноферментного анализа (ИФА).

III. Получение характеристики гипериммунной сыворотки кролика (титра и аффинности антител к метадону).

IV. Построение калибровочной кривой и расчет концентрации метадона в исследуемых биологических жидкостях.

V. Определение чувствительности способа при исследовании различных биологических жидкостей.

I. Получение гипериммунной сыворотки кролика.

Источником антител к метадону служит сыворотка крови кролика, иммунизированного конъюгированным антигеном метадон-бычий сывороточный альбумин (БСА). Связывание метадона с белками проводили по методике, описанной ранее (В журн.: Токсикологический вестник, 1995, N 4, с. 26-29).

Иммунизацию кроликов осуществляют по следующей схеме. Первый курс иммунизации состоит из подкожного введения в 6 точек спины 500 мкг метадона-БСА в 300 мкл воды с добавлением 300 мкл полного адъюванта Фрейнда. Через 2 недели внутримышечно в заднюю лапу вводят такую же дозу антигена, но полный адъювант Фрейнда заменяют на неполный. Второй курс иммунизации проводят через 4 месяца, внутримышечно в заднюю лапу вводят по 500 мкг метадона-БСА в 300 мкл воды с добавлением 300 мкл неполного адъюванта Фрейнда. Через 10 дней проводят вторую инъекцию аналогично предшествующей. Третий курс иммунизации проводят через 6 месяцев. Подкожно в 6 точек спины вводят 500 мкг метадона-БСА в 300 мкл воды с добавлением 300 мкл полного адъюванта Фрейнда. Через две недели вводят внутримышечно в заднюю лапу 500 мкг метадона в 300 мкл воды с добавлением 300 мкл неполного адъюванта Фрейнда. Через 2 недели делают еще одну инъекцию аналогично предыдущей; всего - 7 инъекций антигена. Через 14 дней после последней инъекции антигена из краевой вены уха кролика отбирают кровь и получают гипериммунную сыворотку. Исследование в ИФА показало, что в сыворотке присутствуют антитела к метадону в титре 1:25600 с Ka 1,4•10⁸ М^-1.

II. Проведение конкурентного ИФА.

- Подготовка планшета. Сорбция антигена - метадона, конъюгированного с белковым носителем - лизоцином (реагент получен в лаборатории иммунохимии ГНЦ наркологии) на 96-луночных полистироловых планшетах для иммуноферментного анализа с плоским дном (фирмы Nunc, Дания, или их аналоги отечественного производства). Для этого в лунки планшета заливают по 100 мкл раствора антигена в 0,05 М карбонатном буфере, pH 9,5 с концентрацией белка 10 мкг/мл и оставляют планшет на 18 ч при +4^oC.

- Промывку планшета проводят путем заполнения лунок физиологическим раствором (0,9% NaCl), забуференным фосфатами (ЗФР), pH 7,4 с добавлением детергента Твина-20 (производства фирмы Sigma, США) в конечной концентрации 0,1% (ЗФР-Т) с последующим удалением (отсасыванием). Обычно достаточно 6 циклов такой промывки. После последней промывки остатки промывной жидкости стряхивают на фильтровальную бумагу досуха. Планшет готов к работе.

- В лунки планшета в триплетах вносят по 50 мкл калибровочных растворов метадона определенной концентрации. В зависимости от вида анализируемой жидкости калибровочные растворы должны быть приготовлены в соответствующей жидкости (моче, сыворотке или плазме крови). В остальные лунки планшета, за исключением двух контрольных (бланк) вносят по 50 мкл исследуемых образцов биологической жидкости с неизвестной концентрацией препарата. Перед внесением эти образцы могут быть разведены ЗФР с добавлением бычьего сывороточного альбумина и твина-20 (ЗФР-АТ) в конечных концентрациях 0.1%. Вслед за этим в лунки добавляют по 50 мкл сыворотки иммунизированного кролика с титром антител к метадону 1:25600 и Ka 1,4•10⁸ М^-1 (получена в лаборатории иммунохимии в конечном разведении 1:1600 в ЗФР-АТ. В две контрольные лунки (бланк) вместо исследуемого образца вносят 50 мкл ЗФР-АТ и вместо гипериммунной сыворотки кролика также вносят 50 мкл ЗФР-АТ.

- Планшет инкубируют при +37^oC в течение 90 мин.

- Планшет промывают, как указано выше.

- Превращение невидимого результата иммунологической реакции в видимый. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл раствора вторичных антител против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой хрена (козьи антитела к IgG кролика с активностью фермента 35 ед/мл производства фирмы Sigma, США, или их аналоги отечественного производства). Антитела разводят ЗФР-АТ до разведения, рекомендованного инструкцией к реагенту.

- Планшет инкубируют в течение 60 мин при +37^oC.

- Планшет 10-кратно промывают, как указано выше.

- В лунки планшета вносят по 100 мкл субстратной смеси (0,04% раствор хромогена ортофенилендиамина (ОФД) производства фирмы Sigma, США, в 0,05 М цитратно-фосфатном буфере с pH 5,0, к которому непосредственно перед заливкой в лунки добавляют раствор 30% перекиси водорода из расчета: на 10 мл раствора ОФД - 4 мкл H₂O₂. Время развития достаточной цветной реакции при комнатной температуре в темноте составляет обычно 15-20 мин. Ферментативную реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл 10% раствора H₂SO₄.

- Величину оптической плотности (ОП) измеряют с помощью любого спектрофотометра, предназначенного для планшетов для микротитрования, к примеру, анализатора колориметрического иммуноферментного АКИ-Ц-01, выпускаемого ОКБ ПК и А, г. Йошкар-Ола, при длине волны 492 нм. Из показаний ОП в опытных лунках вычитают среднее показание ОП в контрольных лунках (бланк).

III. Определение титра и аффинности антител к метадону в гипериммунной сыворотке кролика.

Сыворотка была получена после трех циклов иммунизации антигеном метадон-БСА. Гипериммунную сыворотку кролика титруют двукратным шагом в лунках полистиролового планшета, на котором сорбирован конъюгированный антиген метадон-лизоцим. Затем в лунки добавляют антитела к иммуноглобулину кролика, меченные пероксидазой хрена, в оптимальном, заранее подобранном разведении (1: 8000). После добавления субстратной смеси и экспозиции в течение 20 мин. измеряют величину оптической плотности (ОП). За титр гипериммунной сыворотки принимают то максимальное ее разведение, которое дает в ИФА ОП, превышающую значение в контроле (контрольной служит лунка, содержащая все компоненты системы за исключением сыворотки) на 0,1. В результате реакции установлено, что титр этой сыворотки составляет 1:25600. Установлено, что титр гипериммунной сыворотки кролика в данном способе превышает титр сыворотки в прототипе в 2 раза (1:12800).

Для характеристики аффинности антител к метадону строят ингибиторные кривые и вычисляют IC50 (концентрация ингибитора-метадона, которая вызывает угнетение реакции в ИФА на 50%). Приблизительную константу аффинности (Ka) вычисляют как величину, обратную IC50 (в журн. Вопросы наркологии, 1989, N 4, с. 7-11) и выражают в M^-1. Для построения ингибиторной кривой по существу строят калибровочную кривую, как описано выше, однако берут концентрации метадона в ЗФР-АТ в диапазоне от 1 до 10⁸ пг/мл с 10-кратным шагом. Во все лунки приливают постоянное количество гипериммунной кроличьей сыворотки в конечном разведении 1:1600, в отличие от способа по прототипу, где сыворотку брали в конечном разведении 1:400. После инкубации в течение 90 мин. добавляют антитела к иммуноглобулину кролика, меченные пероксидазой хрена. Оказалось, что IC50 метадона составляет в данном случае 2,5 нг/мл. Учитывая, что 1 моль метадона гидрохлорида равен 346•10⁶ нг/мл, то IC50 соответствует 7,23•10^-9 М, а Ka соответственно 1/ 7,23•10^-9 М или 1,4•10⁸ М^-1. Ka возросла в 160 раз (в сравнении с 8,7•10⁵ М^-1 в прототипе). Когда калибровочные растворы метадона были приготовлены не в ЗФР-АТ, а в неразведенной сыворотке (плазме) крови или моче, то Ka соответственно снизилась лишь в 2 раза. При этом чувствительность метода (предельно обнаруживаемая концентрация метадона в биологической жидкости) оказалась равной 10 нг/мл, т.е. в 25 раз выше, чем в способе по прототипу.

III. Построение калибровочной кривой и расчет концентрации метадона в биологических жидкостях.

Для определения метадона в биологических жидкостях используют конкурентный вариант ИФА. В основе его лежит конкуренция между метадоном, сорбированным на твердой фазе (полистироловых планшетах) и метадоном, присутствующим в исследуемых образцах, за центры связывания со специфическими антителами, содержащимися в сыворотке крови кролика, иммунизированного конъюгатом метадона с белком. Для выявления иммунологических комплексов антиген-антитело, образовавшихся на поверхности полистирола, в лунки планшета вносят антитела против иммуноглобулинов кролика, меченные ферментом, с последующим добавлением субстрата и хромогена. В результате ферментативной реакции происходит изменение окраски реакционной смеси, которое легко зарегистрировать с помощью спектрофотометра для микропланшетов. Интенсивность развивающейся окраски - оптическую плотность (ОП) - сравнивают с окраской в лунке, не содержащей метадон в жидкой фазе (контрольная лунка). В случае присутствия в исследуемой жидкости метадона наблюдают снижение интенсивности окрашивания, возникающего в лунке после внесения субстратной смеси.

Для того чтобы определить не только качественное, но и количественное содержание метадона в исследуемых образцах биологических жидкостей, строят калибровочную кривую. Калибровочную кривую строят по 5-6 точкам, добавляя в жидкую фазу растворы с заведомо известной концентрацией метадона (калибровочные растворы). В зависимости от вида биологической жидкости для приготовления калибровочных растворов метадон необходимо разводить на конечной стадии соответственно контрольной (не содержащей метадон) мочой или сывороткой (плазмой) крови. Величины ОП отмечают на оси ординат, а соответствующие им концентрации метадона в растворе на оси абсцисс. Найденные точки соединяют и полученную таким образом кривую используют для количественного определения метадона в тестируемых образцах. С этой целью значение ОП, выявленное при исследовании мочи или сыворотки (плазмы) крови, находят на оси ординат и, используя построенную калибровочную кривую, определяют на оси абсцисс соответствующую концентрацию метадона. Умножив полученную концентрацию на используемое в ИФА разведение, получают концентрацию метадона в 1 мл биологической жидкости.

IV. Определение чувствительности способа при исследовании различных биологических жидкостей
1. Определение метадона в моче
Пороговая концентрация (достоверно устанавливаемая положительная концентрация соединения) метадона в моче составляет 250 нг/мл (В кн.: "Анализ наркотических средств" М. , Мысль, 1993 , стр. 90), что намного превышает предел обнаружения метода. Поэтому при диагностическом исследовании мочи ее рекомендуется сразу разводить в 5 раз (1:4) ЗФР-АТ. При приготовлении калибровочных растворов метадон необходимо разводить в контрольной моче, также разведенной ЗФР-АТ в отношении 1: 4. Для построения калибровочной кривой необходимо взять калибровочные растворы в диапазоне концентраций от 0 до 500 нг/мл, к примеру: 0-25-50-100-250-500 (фиг. 1).

При количественном определении метадона в моче чувствительность метода составляет 10 нг/мл. Чувствительность метода рассчитывают общепринятым способом, т.е. определяют в ИФА оптическую плотность для нескольких контрольных образцов мочи от лиц, не употреблявших метадон, вычисляют среднее значение X и стандартное отклонение S. В нашем конкретном случае для 12 контрольных образцов X+S составили 0,96+0,092. Поскольку в случае присутствия метадона в образце значения ОП снижаются, то определяют нижнюю границу контрольных значений после вычитания из значения X трех стандартных отклонений - 3S. Эта величина составляет 0,69. Таким образом, чувствительность метода (предел обнаружения) будет соответствовать с 99% вероятностью концентрации метадона в том калибровочном растворе, который дает значение ОП ниже величины 0,69. В нашем конкретном случае наиболее близким к данному значению является значение ОП для калибровочного раствора с концентрацией 10 нг/мл (0,54 + 0,02). Это значение существенно ниже, чем среднее значение с контрольными образцами (P < 0,001). В действительности, чувствительность метода даже ниже 10 нг/мл, что в 25 раз превышает чувствительность способа по прототипу.

2. Определение метадона в крови.

Для анализа метадона в крови исследуют плазму (в кровь добавляют антикоагулянт, обычно гепарин или ЭДТА) или сыворотку (дефибринированная плазма, антикоагулянт в кровь не добавляют). При работе с плазмой допускается лишь однократное замораживание и оттаивание образца. Предел обнаружения (чувствительность метода) рассчитывают аналогичным описанному выше способом. Для 10 образцов контрольных неразведенных сывороток крови среднее значение ОП составило 1,51 при S = 0,09317, X - 3S = 1,51 - 0,28 = 1,23. Оптическая плотность калибровочного раствора с концентрацией метадона 10 нг/мл составляет 0,97 + 0,0265, что существенно ниже (p < 0,001) средней ОП для 10 контрольных образцов. Следовательно, чувствительность разработанного способа определения метадона в крови не выше 10 нг/мл, что в 25 раз превышает чувствительность по прототипу.

Для построения калибровочной кривой используют растворы с концентрацией метадона в диапазоне от 0 до 400 нг/мл (фиг. 2). Обычно бывает достаточно определить ОП для 6 точек, соответствующих концентрации 0, 5, 20, 50, 100 и 200 нг метадона в 1 мл раствора. Калибровочная кривая имеет при этом вид прямой линии.

Благодаря высокой чувствительности метод дает хорошие результаты в диапазоне концентраций 20-200 нг/мл и позволяет исследовать плазму или сыворотку крови без предварительного разведения. Поскольку у больных, получающих в качестве заместительной терапии метадон, уровень препарата в крови может варьировать от 80 до 400 нг/мл и выше, то образцы сыворотки (плазмы) при высоких концентрациях метадона необходимо разводить, по крайней мере 1:1. Калибровочная кривая, построенная с использованием сыворотки, разведенной ЗФР-АТ в отношении 1:1, практически идентична кривой, полученной с неразведенной сывороткой.

Пример 1. К трем образцам сыворотки крови здорового человека предварительно добавили раствор метадона в конечной концентрации 60, 120 и 180 нг/мл. Провели ИФА по предлагаемому способу. Для этого засорбировали планшет для ИФА фирмы Nunc (Дания) раствором антигена метадон-лизоцим в концентрации 10 мкг/мл в 0,05 М карбонатном буфере, pH 9,5, по 100 мкл в каждую лунку в течение 18 час при 37^oC. Затем планшет отмыли 6 раз физиологическим раствором, забуференным фосфатами, с добавлением 0,1% Твина-20 (ЗФР-Т). В лунки высушенного встряхиванием планшета в триплетах добавили по 50 мкл калибровочных растворов метадона в сыворотке крови с известными концентрация: 0, 50, 100, 150 и 200 нг/мл. В свободные лунки в дуплетах внесли по 50 мкл исследуемых образцов сыворотки крови человека, содержащих различные концентрации метадона. В 2 контрольные лунки (бланк) вместо сыворотки человека добавили по 50 мкл ЗФР-АТ. Вслед за этим во все лунки, за исключением бланка, добавили по 50 мкл специфической к метадону гипериммунной сыворотки кролика в конечном разведении 1: 1600 с титром антител к метадону 1:25600 и Ka 1,4•10⁸ М^-1. В 2 контрольные лунки (бланк) вместо сыворотки кролика добавили по 50 мкл ЗФР-АТ. После инкубации в течение 90 мин. при 37^oC и 6-кратной промывки в каждую луну планшета внесли по 100 мкл раствора антител против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой хрена (Sigma) в разведении 1: 8000. После инкубации в течение 60 мин. при 37^oC и 10-кратной промывки в каждую лунку внесли по 100 мкл свежеприготовленной субстратной смеси (раствор ОФД в 0,05М цитратно-фосфатном буфере с pH 5,0 с добавлением H₂O₂). Через 20 мин. инкубации при комнатной температуре реакцию остановили добавлением в каждую лунку 50 мкл 10% H₂SO₄. Развившуюся окраску реакционной смеси в лунках планшета измеряют на спектрофотометре Minireader II (Dynatech). В результате измерения ОП во всех лунках и вычитания из этих показаний значений ОП в 2 контрольных лунках (бланк) была построена калибровочная кривая (фиг. 3). ОП в лунках с образцами сыворотки крови, содержащими метадон, представлена в следующей табл. 1 (табл. 1, 2 см. в конце описания).

Таким образом, применение предлагаемого способа дало возможность определить в образцах сыворотки крови концентрации метадона, лежавшие за пределами чувствительности способа по прототипу.

Пример 2. К трем образцам мочи здорового человека предварительно добавили раствор метадона в конечных концентрациях 10, 40 и 200 нг/мл. ИФА проводили так же, как и в примере 1. Калибровочную кривую строили на моче с известными концентрациями метадона: 0, 10, 25, 50, 100, 250, 500 (фиг. 4). ОП в лунках с образцами мочи, содержащими метадон, и соответствующая ей концентрация метадона, представлена в следующей табл. 2:
Таким образом, применение предлагаемого способа дало возможность определить в образцах мочи концентрации метадона, лежавшие за пределами чувствительности способа по прототипу.

Предлагаемый способ применен при исследовании 10 образцов мочи, к которым был добавлен метадон в конечной концентрации 1000 нг/мл. Так как рекомендуемая калибровочная кривая дает наилучшие измерения в диапазоне концентраций 0-500 нг/мл, то эти образца мочи развели ЗФР -АТ в 5 раз, так что реально определяемая концентрация метадона составила 200 нг/мл. В результате проведения анализа во всех образцах мочи, в отличие от способа по прототипу, был обнаружен метадон (100%). Среднеарифметическая концентрация метадона (X) составила 229 нг/мл.

Предлагаемым способом проведено также исследование 30 сывороток крови, к которым добавили метадон в конечной концентрации 10, 75 и 150 нг/мл. Способом по прототипу ни в одном из образцов метадон выявлен не был. С помощью предлагаемого способа во всех образцах обнаружен метадон (100%). Среднеарифметическая концентрация метадона в образцах, содержащих по 10 нг/мл составила 9 нг/мл, 75 нг/мл - 69 нг/мл, а в образцах, содержащих 150 нг/мл, - 130 нг/мл.

Предлагаемый способ имеет преимущество перед известным, заключающееся в повышении чувствительности метода в 25 раз (до 10 нг/мл) с возможностью применения для исследования различных биологических жидкостей, в том числе и крови, что делает его уникальным в связи с отсутствием аналогов. Метод прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования и реагентов и может заменить зарубежные коммерческие наборы для исследования мочи, основанные на радиоиммунном и иммунофлуоресцентном анализе.

Изобретение относится к медицине, в частности к наркологии. С целью повышения чувствительности метода и адаптации его для определения метадона в крови (сыворотке, плазме) применяют метод твердофазного иммуноферментного анализа, с использованием сыворотки крови кролика в конечном разведении 1 : 1600, содержащей антитела в титре 1 : 25600 с контактной аффинности (Ka) 1,4 • 10⁸ М^-1. Способ обладает высокой чувствительностью (составляет 10 нг/мл, что в 25 раз выше чувствительности известного метода). 2 табл., 4 ил.

Способ количественного определения метадона в биологических жидкостях (крови, моче) методом твердофазного иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что используют сыворотку крови кролика в конечном разведении 1 : 1600, содержащую антитела к метадону в титре 1 : 25600 с константной аффинности (Ка) 1,4 • 10⁸ М^-1.