КОНЪЮГАТ, СОДЕРЖАЩИЙ АНТАГОНИСТ ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ И НОСИТЕЛЬ Российский патент 2003 года по МПК A61K47/48 A61K31/519 A61K38/38 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему антагонист фолиевой кислоты и носитель, способу получения такого конъюгата, а также к его применению.

Фолиевая кислота является встречающимся в природе соединением, имеющим важное значение для переноса метильных групп в клетках, а тем самым и для роста клеток. Фолиевая кислота имеет следующую структурную формулу:

СН-группа глутаминовой кислоты содержит асимметричный атом. Следовательно, фолиевая кислота существует в двух энатиомерных формах, а именно в виде D- и L-энантиомеров.

Однако из этих энантиомерных форм только L-энантиомер находится в клетках, благодаря чему только эта форма фолиевой кислоты, но не D-энантиомер, ответственна за ее действие. Причина этого заключается в том, что фолиевая кислота поглощается клетками через фолатный рецептор, который, однако, поглощает только L-энатиомер фолиевой кислоты, но не поглощает ее D-энантиомер.

Антагонистами фолиевой кислоты являются соединения, которые представляют собой производные фолиевой кислоты, но которые противодействуют ей именно в том месте, куда она стремится, т.е. в клетках. Поэтому антагонисты фолиевой кислоты существуют в виде L-энатиомеров, а не в виде D-энатиомеров. Примерами антагонистов фолиевой кислоты являются аминоптерин и аметоптерин, который имеет и другое название - метотрексат.

Метотрексат, т. е. L-энантиомер аметоптерина, часто применяется для лечения опухолей и воспалений. При этом, однако, имеют место значительные побочные действия, поскольку метотрексат поглощается также здоровой тканью, для которой он токсичен. Конъюгаты из метотрексата и альбумина, которые более интенсивно поглощаются опухолями, чем здоровой тканью, и тем самым являются менее токсичными, описаны только в DE-A 4122210.5. Тем не менее существует необходимость в разработке средств, которые обладали бы еще меньшими побочными действиями.

Исходя из вышеизложенного, в основу настоящего изобретения была положена задача разработать средство для лечения больных тканей, в частности для терапии опухолей, которое обладало бы минимальным побочным действием.

Согласно изобретению указанная цель достигается с помощью технических решений, представленных в формуле изобретения.

Объектом настоящего изобретения является, следовательно, конъюгат, содержащий D-энантиомер антагониста фолиевой кислоты и носитель.

Настоящее изобретение основано на полученных заявителем результатах исследований, которые свидетельствуют о том, что D-энантиомер антагониста фолиевой кислоты в конъюгате, содержащем носитель, предпочтительно поглощается больной тканью, в частности опухолевыми клетками, и в них проявляет свое действие против заболевания. Далее было установлено, что D-энантиомер антагониста фолиевой кислоты как таковой, т.е. существующий не в конъюгате по изобретению, не оказывает побочных действий на здоровую ткань.

Понятие "конъюгат" указывает на то, что антагонист фолиевой кислоты и носитель связаны ковалентно, например, через амидные и/или сложноэфирные связи, соответственно через линкер.

Понятие "D-энантиомер антагониста фолиевой кислоты" включает соединения любого типа, которые являются производными фолиевой кислоты, действуют в качестве антагониста фолиевой кислоты и существуют в виде D-энантиомера. D-энантиомер антагониста фолиевой кислоты содержит в качестве компонентов птеридин, в частности птерин, п-аминобензойную кислоту и D-аминокислоту, прежде всего D-глутаминовую кислоту, которые химически изменены, т.е. модифицированы относительно имеющихся в фолиевой кислоте компонентов. Эти изменения включают, например, замещения, такие как замещение атомов водорода С₁-С₄ алкильными группами, в частности метильной группой, атомами галогена, такими как F, Cl, Вr и I, ОН- и NH₂-группами, замещение ОН-групп вышеуказанными алкильными группами, NH₂-группами, атомами водорода и галогена, а также замещение NH₂-групп вышеуказанными алкильными группами, ОН-группами, атомами водорода и галогена. Далее, одна или обе карбоксильные группы глутаминовой кислоты могут присутствовать в виде кислотного производного, например в виде эфира или амида. Из вышеупомянутых модификаций одна или несколько могут присутствовать в применяемых согласно изобретению антагонистах фолиевой кислоты.

Антагонистами фолиевой кислоты предпочтительно являются D-аметоптерин (ниже называемый D-метотрексатом)

D-аминоптерин

и D-e,t-ФМТК (аналог метотрексата, у которого глутаминовая кислота (Glu) заменена на D-эритро,трео-4-фторо-Glu).

Конъюгат по изобретению может содержать в своем составе один или несколько антагонистов фолиевой кислоты. Если он содержит несколько антагонистов, то последние могут быть как одинаковыми, так и отличными друг от друга.

Понятие "носитель" включает соединения любого типа, которые пригодны для обогащения конъюгата в больной ткани, например в опухоли или очаге воспаления. Примеры таких носителей включают белки, которые не рассматриваются как чужеродные для организма, и простые полиэфиры.

Белки предпочтительно присутствуют в нативной форме. В нативной форме белки не имеют межмолекуляных и/или внутримолекулярных поперечных связей. Предпочтительно белки имеют молекулярную массу до 100000 дальтон, в частности от 30000 до 100000 дальтон. Далее, целесообразно использовать белки человека. Примеры белков включают альбумин, фибриноген, трансферрин, иммуноглобулины и липопротеины, причем предпочтителен человеческий альбумин. Могут применяться также фрагменты вышеуказанных белков. Кроме того, последовательность белков, соответственно их фрагментов может иметь модификации одной или нескольких аминокислот в сравнении с известной последовательностью белков, соответственно их фрагментов.

Примерами простых полиэфиров являются полиэтиленгликоли, в частности таковые с молекулярной массой от 100 до 20000 дальтон. Предпочтительны полиэтиленгликоли, которые этерифицированы до сложного или простого эфира по концевой гидроксильной группе С₁-С₁₂алкильной группой, прежде всего метильной группой.

Предлагаемый конъюгат может иметь один или несколько, в частности два, вышеуказанных носителя. Если он содержит несколько носителей, то последние могут быть как одинаковыми, так и отличными друг от друга. В случае нескольких полиэфиров последние предпочтительно выбирают таким образом, чтобы молекулярная масса всех полиэфиров составляла приблизительно 20000 или более дальтон.

В предлагаемом конъюгате антагонист фолиевой кислоты может быть ковалентно соединен с носителем непосредственно или через линкер, т.е. между носителем и антагонистом фолиевой кислоты присутствует линкер. В качестве линкера пригодны все соединения, способные соединять антагонист фолиевой кислоты с носителем.

Предпочтительно, чтобы линкер обладал способностью расщепляться в клетке. Термин "клетка" включает отдельные клетки и состоящие из клеток структуры. Примерами первых являются эндогенные клетки, не объединенные в общую структуру с другими клетками. Примерами объединенных в общую структуру клеток являются ткани, органы и опухоли.

Линкер вышеуказанного типа известен специалистам в данной области техники. Специалистам известны также факторы, например ферменты, которые обусловливают расщепление определенных химических связей в клетках. Поэтому специалист в данной области техники может сконструировать расщепляемые в клетке линкеры. Особенно предпочтительно, чтобы такой линкер включал азогруппу. Более предпочтительно, если линкер имеет следующую структуру:
-Y-R-N=N-
где R обозначает органическую группу, предпочтительно ароматическую, особенно предпочтительно фенилен или его производное, и
Y обозначает группу, выбранную из С(О), S(O)₂, P(O)OH и As(О)ОН.

Вышеуказанная структура предпочтительного линкера соответствует той, которую имеет линкер в конъюгате по изобретению. Кроме того, эта структура, по меньшей мере если R представляет собой фенилен или его производное, включает активное соединение, которое наиболее пригодно для лечения опухолевых, воспалительных и аутоиммунных заболеваний. После расщепления линкера и при определенных условиях разложения еще связанного с линкером белка это соединение может в полной мере проявить свою активность.

Предлагаемые согласно изобретению конъюгаты могут быть получены путем ковалентного связывания антагониста фолиевой кислоты с носителем и при необходимости с линкером. Пригодные для этой цели способы, а также необходимые материалы известны специалистам в данной области техники.

Если антагонист фолиевой кислоты имеет по меньшей мере одну карбоксильную группу, например карбоксильную группу глутаминовой кислоты, конъюгаты можно получать путем взаимодействия антагониста фолиевой кислоты с карбодиимидом и гидроксисукцинимидом с образованием реакционноспособных сложных сукцинимидиловых эфиров и взаимодействия последних с носителем. В случае конъюгатов с несколькими антагонистами фолиевой кислоты сукцинимидиловые эфиры можно получать совместно или раздельно.

Взаимодействие антагонистов фолиевой кислоты с карбодиимидом и гидроксисукцинимидом проводят в полярном апротонном растворителе, предпочтительно диметилформамиде (ДМФ). Молярное отношение антагонист фолиевой кислоты : карбодиимид : гидроксисукцинимид составляет приблизительно 1:1,5:10. Образовавшийся сложный сукцинимидиловый эфир затем подвергают взаимодействию в водном буферном растворе, предпочтительно NаНСО₃, с носителем, таким как альбумин. Концентрация носителя составляет приблизительно от 10 до 70 мг/мл. Активированная таким образом карбоксильная группа может затем реагировать с ОН- и NH-группами носителя с образованием амидных и эфирных связей кислоты, причем в результате этой реакции получают предлагаемые в изобретении конъюгаты. Эти конъюгаты можно подвергать многократной очистке, например, путем ультрафильтрации, и затем стерилизовать фильтрацией, после чего они готовы для применения.

Предлагаемые согласно изобретению конъюгаты отличаются тем, что они остаются в течение длительного времени в системе кровообращения пациента. Далее, они накапливаются в больной ткани, в частности в опухолях и очагах воспаления. Кроме того, конъюгаты по изобретению отличаются тем, что они обладают еще меньшим побочным действием, чем конъюгаты с антагонистами L-фолиевой кислоты, известными из DE-A 4122210.5, причем их действие на больные ткани, прежде всего опухоли и очаги воспаления, сохраняется.

Таким образом, предлагаемые согласно изобретению конъюгаты наиболее пригодны для лечения опухолей, таких как гематологические и солидные опухоли, воспалений, например заболеваний ревматичесого характера, таких как хронический полиартрит, или псориаза, и аутоиммунных заболеваний.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах.

Пример 1: Получение предлагаемого в изобретении конъюгата из D-метотрексата и человеческого сывороточного альбумина.

D-метотрексат (D-MTK) растворяли в концентрации 20 мг/мл в диметилформамиде. К прозрачному желтому раствору добавляли 1,5 моля дициклогексилкарбодиимида и приблизительно 10 молей гидроксисукцинимида. По истечении приблизительно 12 ч реакции превращение в сложный сукцинимидиловый эфир (D-MTK-ГСИЭ) завершалось, что можно было установить по выпавшему в кристаллический осадок количеству дициклогексилмочевины (ДЦМ). Аналитический контроль реакции проводили с помощью тонкослойной хроматографии:
пластинки: силикагель 60 с флуоресцентным индикатором;
система растворителей: этилацетат/МеОН в соотношении 75/25;
значения R_f: для D-MTK 0,0; для D-MTK-ГСИЭ 0,35-0,38.

Прозрачный желтый раствор D-MTK-ГСИЭ в ДМФ медленно, при постоянном перемешивании добавляли к раствору белка (50-70 мг человеческого сывороточного альбумина в 0,17-молярном растворе NаНСО₃, рН 8,5), при этом по истечении некоторого времени появлялось помутнение, обусловленное взвесью из непрореагировавшего дициклогексилкарбодиимида и еще растворенной в диметилформамиде ДЦМ. По истечении по меньшей мере 30 мин реакции взвесь отделяли фильтрованием через стерилизационный фильтр (0,22 мкм), а диметилформамид удаляли путем ультрафильтрации с соответствующим мембранным фильтром (YM30, фирма Amicon).

Контроль чистоты проводили с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР):
предварительная колонка: Zorbach Diol размером 50•4 мм;
колонки: 1-я: Zorbach GF 450, 2-я: Zorbach GF 250;
элюент: 0,2М фосфатный буфер, рН 7,4;
скорость потока: 1,0 мл/мин;
давление: около 65 бар.

В результате получили конъюгат по изобретению из D-метотрексата и человеческого сывороточного альбумина.

Пример 2: Сравнение токсичности конъюгата по изобретению, полученного из D-метотрексата и человеческого сывороточного альбумина, с конъюгатом, полученным из метотрексата и человеческого сывороточного альбумина.

Для этого опыта применяли конъюгат по изобретению из D-метотрексата и человеческого сывороточного альбумина (D-MTK-ЧCA) из примера 1. Далее применяли известный из DE-A 4122210.5 конъюгат, полученный из метотрексата и человеческого сывороточного альбумина (МТК-ЧСА).

Группам из пяти здоровых крыс линии Sprague-Dawley вводили D-MTK-ЧCA, соответственно МТК-ЧСА. Крысам инъицировали по 4 мг конъюгата (в пересчете на долю МТК, соответственно D-MTK в конъюгатах) на килограмм веса тела с двухдневным интервалом. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Использованные в таблице 1 сокращения имеют следующие значения: ВС означает "воспаление слизистой оболочки"; ПН означает "понос"; ВШ означает "взъерошенная шерсть"; ПВ означает "потеря веса"; СМ означает "смерть".

Как видно из таблицы 1, крысы при введении им конъюгата МТК-ЧСА, уже начиная с третьего дня, испытывали сильные побочные действия. На четвертый день две крысы были найдены мертвыми в клетке. Остальных трех крыс пришлось умертвить, поскольку они страдали от сильных побочных действий. В отличие от этого ни у одной из крыс, которым вводили конъюгат D-MTK-ЧCA по изобретению, не отмечалось побочных действий.

Таким образом, конъюгаты по изобретению оказывают лишь незначительные побочные действия.

Пример 3: Терапия опухолей конъюгатом по изобретению, полученным из D-метотрексата и человеческого сывороточного альбумина, в сравнении с коньюгатом, полученным из метотрексата и человеческого сывороточного альбумина.

Для этого опыта применяли указанные в примере 2 конъюгаты. В качестве подопытных животных использовали крыс-носителей карциносаркомы линии Walker-256. Лечение начинали на шестой день после пересадки опухоли объемом от 1000 до 2500 мм³ (диаметр опухоли от 1•1 до 1•2 см). Пяти крысам вводили МТК-ЧСА (3 инъекции с двухдневным интервалом дозой по 2 мг МТК-ЧСА в пересчете на долю МТК на килограмм веса тела). Предлагаемый в изобретении конъюгат D-MTK-ЧCA вводили двойной дозой согласно вышеприведенному протоколу. При указанных дозах в случае МТК-ЧСА имели место значительные побочные действия, тогда как при введении предлагаемого конъюгата D-MTK-ЧСА побочных действий не наблюдалось (см. пример 2). Полученные результаты представлены в таблице 2.

Использованные в таблице 2 сокращения имеют следующие значения: ПД означает "побочные действия"; СМ означает смерть в результате рецидива опухоли.

Результаты, приведенные в таблице 2, показывают, что в группе, в которой животным вводили МТК-ЧСА, опухоль спадала у трех животных (ремиссия). В этой группе у двух крыс имел место рецидив, и их пришлось умертвить. У трех крыс наблюдались побочные действия. В отличие от этого в группе, в которой животным вводили конъюгат D-MTK-ЧСА по изобретению, все животные излечивались от опухоли и при этом не наблюдалось побочных действий, хотя в сравнении с группой, которой вводили МТК-ЧСА, применяли двойную дозу конъюгата.

Таким образом, конъюгаты по изобретению обладают минимальными побочными действиями, причем с помощью этих конъюгатов возможно достижение исключительно высоких результатов в терапии опухолей.

Изобретение относится к медицине и касается конъюгата, содержащего D-энантиомер антагониста фолиевой кислоты и носитель, используемого для терапии опухолей. Конъюгат обладает повышенной активностью. 2 с. и 11 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Конъюгат, содержащий D-энантиомер антагониста фолиевой кислоты и носитель. 2. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что антагонист фолиевой кислоты содержит одно или несколько производных птеридина, п-аминобензойной кислоты и D-аминокислоты. 3. Конъюгат по п.2, отличающийся тем, что D-аминокислота является глутаминовой кислотой. 4. Конъюгат по п.3, отличающийся тем, что антагонист фолиевой кислоты является D-аметоптерином или D-аминоптерином. 5. Конъюгат по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что содержит несколько антагонистов фолиевой кислоты. 6. Конъюгат по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что носитель является нативным белком, который не рассматривается как чужеродный для организма, или простым полиэфиром. 7. Конъюгат по п.6, отличающийся тем, что белок является сывороточным альбумином. 8. Конъюгат по п.6, отличающийся тем, что полиэфир является полиэтиленгликолем. 9. Конъюгат по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что содержит несколько носителей. 10. Конъюгат по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что между антагонистом фолиевой кислоты и носителем имеется линкер. 11. Конъюгат по п.10, отличающийся тем, что линкер способен расщепляться в клетке. 12. Конъюгат по п.11, отличающийся тем, что линкер содержит азогруппу. 13. Способ получения конъюгатов по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что антагонист фолиевой кислоты, носитель и необязательно линкер ковалентно связывают друг с другом.