НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, СПОСОБНАЯ ИНГИБИРОВАТЬ АКТИВНОСТЬ IL-6, ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ ТРАНСФЕКЦИИ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ПРИ ТЕРАПИИ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2003 года по МПК C12N15/11 C12N15/63 A61K48/00 

Описание патента на изобретение RU2205874C2

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к нуклеотидной последовательности, которая способна ингибировать активность IL-6, ее применению в терапии, а также к содержащим ее фармацевтическим композициям.

Предпосылки создания изобретения
IL-6 является белком, принадлежащим к группе цитокинов, которые призваны играть ключевую роль в иммунной реакции организма и стимуляции гематопоэз.

Действительно, обнаружено много биологических функций IL-6 в гематологической и лимфатической системах, в печени и других мишенных органах и тканях. Некоторые из этих функций являются благоприятными, в то время как другие относятся к патологическим состояниям. К числу последних относится, как обнаружено, то, что IL-6 является фактором роста для клеток множественной миеломы; показано, что антитела против IL-6 временно блокируют пролиферацию миеломных клеток у пациента с лейкемией (см., например, Klein et al. , Blood, 78, (5), pp.1198-1204, 1991, и Lu et al., Eur. J.Immunol., 22, pp.2819-24, 1992).

Найдена взаимосвязь оцененных уровней IL-6 с аутоиммунными и воспалительными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит, гломерулонефрит, псориаз и болезнь Кастлемена (см., например, Graeve et al., Clin. Investig., 71, pp.664-71, 1993). Также показано, что IL-6 играет явную роль в остеопорозе и гиперкальциемии (см., например, Poli et al., Embo J., 13, (5), pp. 1189-96, и Yoneda et al., Cancer Res., 53, pp.737-40, Feb.1993).

Поэтому разработка ингибиторов активности IL-6 была предметом активных исследований. Для этих целей были выбраны различные подходы, в том числе, применение антител против IL-6 gp130 или gp80 (как сообщают Klein et al., см. выше); применение растворимого gp130; или применение мутеинов для IL-6, или рецептора IL-6.

Так как такие подходы могут ассоциироваться со специфическими нежелательными эффектами при клиническом применении (как сообщают Lu et al., см. выше), может быть полезным выдвижение других стратегий ингибирования активности IL-6.

Поэтому Заявитель провел исследования при другом подходе к ингибированию активности IL-6, а именно путем блокирования внутриклеточных белков, опосредующих сигнал IL-6.

Трансдукция сигнала IL-6 в отвечающих клетках тщательно исследована. Fowlkes et al. (PNAS USA, 81, pp.2313-6, 1984) первыми предположили, что существуют отвечающие элементы ДНК, специфические для IL-6, фланкирующие фибриногенные гены крысы.

Позднее Kunz et al. (Nuc. Ac. Res., 17, (3), 1121-37, 1989) показали отвечающий элемент с коровой последовательностью, идентичной последовательности генов крысиного фибриногена (CTGGGA), который отвечает на IL-6 в гене крысиного α2-макроглобулина.

Отвечающие элементы ДНК с последовательностями, родственными вышеупомянутым последовательностям, также определены в генах, кодирующих человеческий С-реактивный белок (CRP) (см. Toniatti et al., Mol. Biol. Med., 7, pp.199-212, 1990), человеческий гаптоглобин (см. Oliviero et al., Embo J. 6, (7), pp. 1905-12, 1987), и в других генах, кодирующих добавочные белки острой фазы, индуцированные IL-6 (см. Heinrich et al., Biochem. J., 265, pp.621-36, 1990), что приводит к определению коровой консенсусной последовательности CTGGGAW или CTGGRAA, где W представляет А или Т, и R представляет А или G.

Hocke et al. (Mol. Cell. Biol., 12, (5), pp.2282-94, 1992) показали, что многие родственные коровые последовательности, подобные коровой последовательности, упомянутой выше, могут присутствовать в регуляторных областях генов дикого типа, отвечающих IL-6, и что эта множественность ведет к амплификации ответа, что анализируется функционально с помощью анализа репортерного гена.

Wenenka et al. (Mol. Cell. Biol., 13, (1), pp.276-88, 1993) недавно предложили расширенную версию коровой консенсусной последовательности как элемента реакции острой фазы (APRE), активного в клетках гепатомы, которую можно представить формулой KTMYKGKAA, где М представляет С или А, К представляет Т или G, Y представляет С или Т.

Показано (Yuan et al., Mol. Cell. Biol., 14, (3), pp.1657-68, 1994), что такие APRE-подобные последовательности связывают белковый фактор транскрипции с молекулярной массой порядка 90 кД, названный APRE, который недавно клонирован (см. Akira et al., Cell, 77, pp.63-71, 1994). На практике, связывание активированного APRF с APRE-последовательностями приводило бы к активации IL-6-индуцибельных генов (содержащих такие APRE-последовательности) в отвечающих на IL-6 клетках.

Вследствие этого APRE-элемент можно использовать в качестве энхансера гена-мишени в отвечающих на IL-6 клетках следующим образом: в отвечающих на IL-6 клетках обработка IL-6 индуцирует синтез APRF-белков, которые связываются с APRE-элеменом, и такое связывание активирует экспрессию гена-мишени.

Serlupi Crescenzi et al. (сообщение на 12-й Европейской конференции по иммунологии, Барселона, 14-17 июня 1994) показали, что 8-кратный повтор ДНК-последовательности APRE (M8) отвечает за 50-100-кратную индукцию с помощью IL-6 репортерного гена в клетках гепатомы человека HepG2. В случае таких отдельных транскрипционных факторов действительно выявлены двухцепочечные олигонуклеотиды.

Краткое изложение сущности изобретения
Основным предметом настоящего изобретения является нуклеотидная последовательность, способная ингибировать активность IL-6, которая включает
I) по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, которая является APRE-элеменом общей формулы ZXMYKGKAA, где Z представляет Т или G или может также отсутствовать, Х представляет Т или также может отсутствовать, М представляет С или A, Y представляет С или Т и К представляет Т или G,
в сочетании с
II) по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью, составляющей сайт связывания транскрипционного фактора иной, чем APRE-элемент, такой как сайты, присутствующие в промоторных областях.

Примерами нуклеотидных последовательностей последнего типа являются блок ТАТА и сайты связывания факторов транскрипции, таких как АР-1 (см. Riabowol et al., PNAS USA, 89, pp.157-61, 1992), AP-2, HNF-1 (см. Clusel et al., Nuc. Ac. Res. , 21 (15), pp.3405-11), SP-1 (см. Wu et al., Gene, 89, pp.203-9, 1990), NF-kB (см. Bielinska et al., Science, 250, pp.997-1000, 1990), Oct-1, E-2 и факторов транскрипции SRF.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения как APRE-элемент (I), так и/или нуклеотидная последовательность (II) приведенной выше общей формулы повторяются по меньшей мере 2 раза, предпочтительнее - от 3 до 10 раз, еще предпочтительнее - 8 раз.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения элемент (I) содержит по меньшей мере два различных APRE-элемента, и/или нуклеотидная последовательность (II) содержит по меньшей мере две различные олигонуклеотидные последовательности, составляющие сайт связывания фактора транскрипции иной, чем APRE-элемент.

Нуклеотидная последовательность (II) является предпочтительно ранним промотором SV40.

APRE-элемент (I) содержит, например, нуклеотидную последовательность TTCTGGGAA.

На фиг. 2 приводится нуклеотидная последовательность, которая входит в объем изобретения, в соответствии с предпочтительными вариантами его осуществления. Такая последовательность также обозначается как послед. 1, и составляет предмет настоящего изобретения.

Другим предметом настоящего изобретения является плазмидный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность настоящего изобретения.

Дополнительным аспектом настоящего изобретения является применение нуклеотидной последовательности настоящего изобретения в качестве терапевтического средства для ингибирования действия IL-6 в условиях, когда IL-6 играет патологическую роль.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим нуклеотидную последовательность или плазмидный вектор по настоящему изобретению. Такие композиции могут быть составлены для перорального, ректального, внутривенного или местного применения. Составы настоящего изобретения могут включать использование любого сочетания переноса вирусоопосредованного гена, липосомной композиции, опосредованной рецептором доставки ДНК и/или гантельных структур активной нуклеотидной ингибирующей последовательности по настоящему изобретению.

Ингибирующее действие нуклеотидной последовательности настоящего изобретения определяют с помощью анализа репортерного гена.

Анализ репортерного гена настоящего изобретения основан на способности APRE-элемента функционировать в качестве энхансера любого гена в отвечающих на IL-6 клетках (как сообщалось выше). В этом случае APRE-элемент используют как энхансер репортерного гена-мишени (которым является, например, ген люциферазы) в отвечающих на IL-6 клетках (которыми являются, например, гепатоциты, такие как HepG2). Затем клетки обрабатывают IL-6: если достаточное количество продуцированных APRF-белков захватывается избытком нуклеотидной последовательности настоящего изобретения, ген-мишень не будет активироваться.

В соответствии с этим анализом строят ингибирующие плазмиды, которые содержат нуклеотидную последовательность настоящего изобретения. Пример такой плазмиды дается на фиг.1 вместе со стратегией ее построения.

Также подразумевается, что эта и другие плазмиды, содержащие нуклеотидную последовательность настоящего изобретения, составляют другой вариант осуществления настоящего изобретения.

В дальнейшем настоящее изобретение будет описываться с помощью примеров, которые не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение в какой-либо степени. В примерах будут даваться ссылки на чертежи, описанные здесь далее.

Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Построение плазмиды pM8SV. pM8SVL переваривают с Sal I и Hind III, и липкие концы трансформируют в тупые концы посредством реакции Кленова. Получающийся в результате фрагмент ДНК в 3,2 т.п.н. очищают с помощью электрофореза в агарозном геле, и затем его аутолигируют. Затем генерируют плазмиду pM8SV, содержащую последовательность М8 (170 п.н.) и последовательность от раннего промотора вируса SV40 (190 п.н.), но не имеющую гена люциферазы.

Фиг. 2. Последовательность фрагмента BamH I-Hind III ингибирующей ДНК плазмиды pM8SV. Непрерывная линия над верхней частью приведенной нуклеотидной последовательностью представляет последовательность М8. Четкая непрерывная линия над нижней частью нуклеотидной последовательности представляет промоторную последовательность SV40. Также указаны сайты рестрикции BamH I и Hind III.

Фиг.3. Анализ репортерного гена в клетках T47D и M1. Испытание различных плазмид, содержащих М8. Приведенные величины светового излучения являются средними значениями двукратного определения чос (cps) за период 30 секунд (AUC= площадь под кривой, ППК) из трансфектированных клеток. Каждый прямоугольник представляет среднее трех трансфекций ± ст.откл.

Фиг. 4. Зависимость от времени люциферазной индуцибельности трансфектированных клеток Нер G2 после обработки IL-6. Плазмиду pM8SVL используют в качестве позитивной плазмиды репортерного гена. Каждый прямоугольник представляет среднее из двух трансфекций ± ст.откл. На чертеже показаны результаты двух экспериментов.

Фиг. 5. Анализ репортерного гена HepG2 для IL-6. Испытания рМ8 как ингибирующей плазмиды против pM8SVL как плазмиды репортерного гена. Каждый прямоугольник представляет среднее из трех трансфекций ± ст.откл. На чертеже показаны результаты четырех экспериментов.

Фиг. 6. Анализ репортерного гена HepG2 для IL-6. Испытания pN8SV как ингибирующей плазмиды против pN8SVL как плазмиды репортерного гена. Каждый прямоугольник представляет среднее из трех трансфекций ± ст.откл. Результаты выражаются в виде % ингибирования по отношению к клеткам HepG2, трансфектированным плазмидой-носителем рС без ингибирующей плазмиды.

Фиг. 7. Анализ репортерного гена HepG2 для IL-6. Испытания pSV и pM8SV как ингибирующих плазмид против pN8SVL как плазмиды репортерного гена. Каждый прямоугольник представляет среднее из трех трансфекций ± ст.откл. Результаты выражаются в виде % инигибированя по отношению к клеткам HepG2, трансфектированным плазмидой-носителем рС без ингибирующей плазмиды.

Фиг.8. Испытания ингибирования активности IL-6 инигибирующими плазмидами рМ8 и pM8SV при анализе репортерного гена HepG2 на основе люциферазного гена под контролем индуцибельных регуляторных последовательностей IL-6 из промотора гена человеческого гаптоглобина. Каждый прямоугольник представляет среднее из трех трансфекций ± ст.откл. Результаты выражаются в виде % инигибирования по отношению к клеткам HepG2, трансфектированным плазмидой-носителем рС без ингибирующей плазмиды. Трансфекцию осуществляют 0,1 мкг репортерной плазмидной ДНК и указанным молярным избытком ингибирующей плазмиды. Общее количество трансфектированной ДНК поддерживают постоянным с помощью плазмиды-носителя. Трансфектированные клетки обрабатывают в течение 18 часов 1 нг/мл IL-6.

Подробное описание изобретения
Пример 1. Построение плазмид. Отвечающую на IL-6 плазмиду репортерного гена люциферазы конструируют, получая, сначала, путем химического синтеза двухцепочечный олигонуклеотид с 38 п.н. с невырезанным сайтом ВаmН I на его 5' тупом конце, и формируя выступ нижней цепочки в 4 нуклеотида, совместимых с сайтами Вgl II и ВаmН I на 3'-конце. Этот синтетический олигонуклеотид называют М2, и он содержит две идентичные APRE-последовательности из промоторной области гена крысиного α2-макроглобулина. Последовательность олигонуклеотида (верхняя цепочка, 5'-3') имеет вид GGATCCTTCTGGGAATTCTGATCCTTCTGGGAATTCTG (послед. 2). Этот олигонуклеотид клонируют в сайтах Sma I-Bgl II плазмиды pGL2-pv (от Promega Corporation), где экспрессия люциферазного репортерного гена производится ранним промотором вируса SV40, формируя, таким образом, после аутолигирования плазмиду pM2SVL.

Синтетический олигонуклеотид также лигируют, через его 5' тупой конец, с сайтом Sma I той же плазмиды pGL2-pv, и получающийся в результате линейный продукт лигирования затем разрезают Hind III. Получающийся в результате линейный вектор используют в качестве реципиента для клонирования следующих фрагментов ДНК: 1) фрагмента BamH I - Hind III с 238 п.н. из плазмиды pM2SVL с образованием, таким образом, после аутолигированя плазмиды pM4SLV; 2) фрагмента BamH I-Hind III с 280 п.н. из pM4SLV с образованием, таким образом, после аутолигирования плазмиды pM6SLV; и 3) фрагмента BamH I - Hind III с 322 п. н. из pM6SLV с образованием, таким образом, после аутолигирования плазмиды pM8SLV.

Плазмиду pM8L конструируют путем переваривания pM8SLV с Sfan I и путем конвертирования липких концов в тупые концы с помощью реакции вставки с ферментом Кленова. После переваривания BamH I получающийся в результате фрагмент ДНК М8 в 163 п.н. лигируют с синтетическим адаптором BamH I-KpnI с 16 п. н. и клонируют во фрагменте ДНК в 5,6 т.п.н., получающемся при переваривании Sma I + Крn I вектора pGL2-b (от Promega Corporation). Плазмида pGL-2b идентична вышеупомянутой плазмиде pGL2-pv, за исключением отсутствия промоторной последовательности SV40 в pDL2-b. Адаптор с 16 п.н. содержит сайт множественного клонирования, и его получают путем химического синтеза со следующией последовательностью:
верхняя цепочка:
5'CGCGGCCGCCTCGAGG3' (послед. 3);
нижняя цепочка:
5'GATCCCTCGAGGCGGCCGCGGTAC3' (послед. 4).

Плазмида, получающаяся из вышеуказанной конструкции, представляет собой pM8L, и она имеет последовательность ДНК М8 без промотора, вставленную в сайт множественного клонирования, в обратном направлении люциферазного гена.

Плазмиду люциферазного репортерного гена pM8TKL получают путем разрезания плазмиды pGEM-TK-CAT (описанной в Cohen et al., EMBO J., 7(5), pp. 1411-9, 1988) Xba I и Bgl II. Получающийся в результате фрагмент в 181 п.н., содержащий ТК-промоторную последовательность гена тимидинкиназы вируса HSV, лигируют с фрагментом Nhe I-Bgl II с 5,8 т.п.н. вектора pM8L между последовательностями М8 и ДНК люциферазы. Плазмиду люциферазного репортерного гена pHPSVL конструируют сначала путем PCR-амплификации 841 п.н. из промоторной области гена гаптоглобина из человеческой геномной ДНК. Конец 3' амплифицированного PCR фрагмента соответствует позиции 36 от начала транскрипции гена человеческого гаптоглобина (как сообщается в Maeda et al., J. Biol. Chem. , 260(11), pp. 6698-709, 1985). Этот PCR-продукт получают с верхней и нижней затравками, содержащими, соответственно, сайты рестрикции Mlu I и Вgl II. ДНК-затравки, синтезированные для геномной амплификации промоторной области гаптоглобина, имеют следующую последовательность:
верхняя затравка:
5'CTACGCGTGCAGTATTGACCCTTCCTCCT3' (послед. 5);
нижняя затравка:
5'CGCAGATCTAGCTCACTTCTCCCCCTTC3' (послед. 6).

Полученный таким образом PCR-фрагмент вставляют в сайты Mlu I и Вgl II указанной выше плазмиды люциферазного репортерного гена pGL2-pv, в обратном направлении раннего промотора SV40. Получающаяся в результате плазмида представляет собой pHPSVL.

Чтобы сконструировать ингибирующую плазмиду рМ8, вышеуказанную плазмиду pM8L переваривают с Sal I и Вgl II, и полученные таким образом липкие концы исправляют в тупые концы с помощью реакции Кленова. Получающийся в результате фрагмент в 3,1 т.п.н., не имеющий последовательности гена люциферазы, очищают с помощью электрофореза в агарозном геле, затем его аутолигируют, и генерируют ингибирующую плазмиду рМ8.

Игнибирующую плазмиду pM8SV получают так, как показано на фиг.1. Переваривают pM8SVL с Sal I и Hind III, и липкие концы трансформируют в тупые концы с помощью реакции Кленова. Получающийся в результате фрагмент ДНК в 3,2 т. п. н. очищают с помощью электрофореза в агарозном геле, затем его аутолигируют. Генерируют, таким образом, плазмиду pM8SV, содержащую последовательность М8 (170 п. н.) и последовательность из раннего промотора вируса SV40 (190 п.н.), но не имеющую люциферазного гена.

Ингибирующую плазмиду pSV конструируют посредством вырезания фрагмента Sal I - Hind III, содержащего люциферазный ген, из указанной выше плазмиды pGL2-pv. Получающийся в результате фрагмент в 3,1 т.п.н. подвергают реакции вставки с ферментом Кленова, очищают с помощью электрофореза в агарозном геле, и затем его аутолигируют, получая, таким образом, плазмиду pSV, которая содержит промотор SV40, но не имеет люциферазного гена.

Плазмиду-носитель рС получают путем разрезания указанной выше плазмиды pGL2-b ферментами рестрикции Sal I и Hind III. Получающийся в результате фрагмент в 2,9 т.п.н. подвергают реакции вставки с ферментом Кленова, очищают с помощью электрофореза в агарозном геле, и затем его аутолигируют, получая, таким образом, плазмиду рС.

Все описанные выше плазмидные конструкции используют для трансформации штамма Е. Coli XL1-Blue обычными способами (Ausubel R. et al., Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). Плазмидную ДНК экстрагируют из трансформированных клонов с помощью минипрепаративного метода щелочного лизиса (по Ausubel, цит. выше). Плазмидную ДНК проверяют с помощью рестрикционного анализа и электрофореза в агарозном геле. Отбирают клоны с предполагаемой картиной. Чтобы получить очищенные плазмидные препараты для применения при трансфекции клеток млекопитающих, получают 300 мл культур отобранных трансформантов Е. Coli XL1-Blue. Затем плазмиды очищают с помощью ионообменных миниколонок 500 с наконечником QIAGEN в соответствии с инструкциями изготовителя.

Пример 2. Клеточные линии и условия культивирования. Клетки гепатомы человека HepG2 (ATCC) культивируют в минимальной поддерживающей среде (MEM) с добавлением 10% FCS, 5 мМ L-глутамина, 20 мМ HEPES, 100 Е/мл пенициллина/стрептомицина. Клетки рака молочной железы человека T47D (ATCC) культивируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% FCS, 5 мМ L-глутамина, 20 мМ HEPES, 100 Е/мл пенициллина/стрептомицина. Клетки миелоидного лейкоза мыши M1 (ATCC) культивируют в RPMI с добавлением 10% FCS, 5 мМ L-глутамина, 20 мМ HEPES, 100 Е/мл пенициллина/стрептомицина. Культивирование вышеуказанных клеточных линий осуществляют в присутствии или в отсутствие соответствующий дозы IL-6 (производный СНО h IL-6 от Interpharm Laboratories), как описано ниже.

Пример 3. Промежуточная трансфекция и анализы люциферазы и β-галактозидазы. Промежуточную трансфекцию клеток гепатомы человека HepG2 и клеток рака молочной железы человека T47D осуществляют с использованием преципитации ДНК фосфатом кальция в буфере HEPES, по стандартным процедурам (Ausubel R. et al., Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). Промежуточную трансфекцию клеток миелоидного лейкоза мыши M1 осуществляют с использованием DEAE-декстрана обычными процедурами (по Ausubel, цит. выше).

Чтобы обнаружить активность люциферазы и β-галактозидазы, клетки экстрагируют in situ путем инкубации в течение 15 минут при комнатной температуре с 1 мл/106 клеток буфере для экстракции (25 мМ трис-фосфата, рН 7,8, 2 мМ DTT, 2 мМ ЭДТК, 10% глицерина, 1% тритона Х-100). В случае люциферазной активности непосредственно анализируют 20 мкл клеточного экстракта со 100 мкл буфера для анализа люциферазы (20 мМ трицина, 1,07 мМ (МgСО3)4Mg(ОН)2 • 5Н2О, 2,67 мМ МgSO4, 0,1 мМ ЭДТК, 33,3 мМ DTT, 0,27 мМ кофермента А, 0,47 мМ люциферина, 0,53 мМ АТФ). В случае активности β-галактозидазы 10 мкл клеточного экстракта инкубируют в течение 1 часа при 37oС со 100 мкл субстрата Lumigal (от Lumigen). Считывание данных с Lumigal и люциферазы осуществляют с помощью люменметра Berthold Autolumat LB953, причем излучаемая мощность представляет число отсчетов за секунды (чос), взятое за период 30 секунд в случае люциферазы и за период 15 секунд в случае β-галактозидазы.

Показано, что репортерная плазмида pM8SVL предоставляет IL-6-отвечаемость после промежуточной трансфекции клеток HepG2, повышая экспрессию люциферазной активности в 50-100 раз (Serlupi Crescenzi et al., сообщение на 12-й Европейской конференции по иммунологии, Барселона, 14-17 июня 1994).

Эту плазмиду также испытывают в клетках рака молочной железы человека T47D и в клетках миелоидного лейкоза мыши M1. Клетки M1 трансфектируют 0,5 мкг ДНК на 106 клеток с использованием DEAE-декстрана, в то время как для кальцийфосфатной трансфекции клеток T47D используют 2,5 мкг ДНК на 105 клеток.

Только весьма ограниченные признаки разделяются этими двумя клеточными линиями, кроме их обычной реакции на человеческий IL-6. Результаты (фиг.3) показывают, что молекула ДНК М8 в плазмиде pM8SVL существенно активна в обеих клеточных линиях после обработки IL-6. Как показывает фиг.3, значительная реакцию на IL-6 также наблюдается в клетках M1 с плазмидой репортерного гена pM8TKL, где молекула М8 фланкирована тимидинкиназным промотором, который отличается от промотора SV40, присутствующего в pM8SVL.

Зависимость от времени люциферазной индуцибельности трансфектированных клеток HepG2 проверяют после обработки IL-6 (1 нг/мл). Плазмиду pM8SVL используют в качестве позитивной плазмиды репортерного гена (при 0,2 мкг/105 клеток). Клетки трансфектируют в течение ночи, расщепляют и затем подвергают обработке IL-6. Результаты приводятся на фиг.4, и они показывают, что почти полного ответа на IL-6 можно достичь спустя только два часа после обработки IL-6.

Пример 4. Испытание ингибирующей плазмиды рМ8. Ингибирование активности IL-6 молекулами ДНК М8 измеряют после котрансфекции в клетки HepG2 I) плазмиды репортерного гена pM8SVL, отвечающей на IL-6, и II) молекулы М8, вставленной в ингибирующую плазмиду М8. Эта последняя плазмида выступает в роли хозяина последовательности М8, но она не обладает способностью предоставлять отвечаемость на IL-6. Клетки HepG2 трансфектируют 2,5 мкг/105 клеток отвечающей на IL-6 репортерной плазмиды pM8SVL (содержащей М8 и ген люциферазы) и 10- или 50-кратным молярным избытком рМ8, в присутствии различных доз IL-6. Общее количество ДНК на трансфекцию поддерживают постоянным, используя плазмиду-носитель рС, которая идентична рМ8, за исключением отсутствия в первой плазмиде специфического фрагмента ДНК М8 длиной в 165 п. н.

Как видно из фиг.5, ингибирующая плазмида не показывает существенного и воспроизводимого специфического ингибирования активности IL-6 в четырех экспериментах, даже при 50-кратном молярном избытке ингибирующей плазмиды рМ8. В этих экспериментах отвечающую на IL-6 плазмиду репортерного гена используют при дозе 0,1 мкг/105 клеток, в то время как постоянное количество общей ДНК, используемой при трансфекции, составляет 5 мкг/105 клеток. Субоптимальная доза IL-6, использованная в этих экспериментах, составляет 1 нг/мл. Как показывает фиг.5, изменчивость при этих условиях эксперимента приемлема, исходя из факта, что различные трансфекции сами по себе являются неизбежным источником изменчивости.

Пример 5. Испытание инигибирующей плазмиды pM8SV. Результаты, приведенные на фиг.5, являются несколько неожиданными, поскольку активная ингибирующая ДНК-последовательность М8 ингибирующей плазмиды рМ8 идентична активной последовательности плазмиды репортерного гена pM8SVL. Поэтому после котрансфекции следовало бы ожидать конкуренции между двумя идентичными М8 последовательностями, присутствующими в различных плазмидах, приводящей к ингибированию активности IL-6 при анализе репортерного гена.

Кроме того, описанные выше результаты нельзя объяснить с помощью присутствия избытка активированного IL-6-специфического фактора (факторов) транскрипции, которые недостаточно нейтрализованы молекулами ингибирующей ДНК М8, так как данные получают в присутствии ограниченного количества IL-6. Кроме того, опубликованные данные о подобных экспериментах с сайтами связывания ДНК для известных факторов транскрипции (26-30) не совместимы с результатами, приведенными на фиг.5.

Другим объяснением результатов, показанных на фиг.5, может быть то, что отличающиеся от М8 последовательности в плазмиде репортерного гена могут вносить вклад в IL-6-специфическую сигнальную трансдукцию. Эти последовательности должны отсутствовать в ингибирующей последовательности рМ8, но они должны присутствовать в позитивной плазмиде репортерного гена pM8SVL (например, последовательности раннего генного промотора SV40, которые могут связывать общие факторы транскрипции). Ингибирующая плазмида рМ8 поэтому может быть неэффективной при конкуренции с плазмидой репортерного гена pM8SVL.

Чтобы проверить эту гипотезу, конструируют ингибирующую плазмиду (pM8SV), содержащую в качестве ингибирующих IL-6 ДНК-последовательностей как последовательность М8, так и промоторную последовательность SV40 (см. фиг. 1). Эту ингибирующую плазмиду проверяют при анализе репортерного гена IL-6 с клетками HepG2. Осуществляют четыре независимых эксперимента, при двукратном повторении трансфекции на эксперимент. Трансфекцию осуществляют 0,1 мкг репортерной плазмидной ДНК и молярным избытком инигибирующей плазмиды, как показано на фиг. 6. Общее количество трансфектированной ДНК поддерживают постоянным с помощью плазмиды-носителя. Трансфектированные клетки обрабатывают в течение 18 часов 1 нг/мл IL-6.

Результаты, приведенные на фиг.6, показывают четкое зависимое от дозы ингибирование активности IL-6 ингибирующей плазмидой pM8SV. Необработанные данные для фиг.6 приводятся в табл.1. При каждом эксперименте осуществляют три повторных трансфекции на дозу ингибирующей плазмиды. Для каждого эксперимента величины в случае индуцирования и без индуцирования, приведенные в отдельной колонке, приводят к одной и той же трансфекции. Данные значения светового излучения представляют чос за период в 30 секунд. Как можно видеть из табл.1, наблюдается некоторое непостоянство в этих экспериментах, особенно, при более низких дозах ингибирующей плазмиды, но обычно коэф. вариации повторных трансфекций твердо составляет ниже 20%.

Чтобы исключить предположение, что ингибирование активности IL-6, обеспеченное ингибирующей плазмидой pM8SV, происходит исключительно благодаря ДНК-последовательности промотора SV40, а не сочетанию последовательностей М8 и SV40, конструируют дополнительную ингибирующую плазмиду, и испытывают ее при анализе репортерного гена. Эта плазмида содержит в качестве инигибитора активности IL-6 только ДНК-последовательность SV40, без последовательности М8, а также люциферазного гена.

Трансфекцию осуществляют 0,1 мкг репортерной плазмидной ДНК и молярным избытком ингибирующей плазмиды, как показано на фиг.7. Общее количество трансфектированной ДНК поддерживают постоянным с помощью плазмиды-носителя. Трансфектированные клетки обрабатывают в течение 18 часов 1 нг/мл IL-6. Результаты, приведенные на фиг. 7, показывают, что эта ингибирующая плазмида (pSV) демонстрирует только частичное ингибирование активности IL-6, которое никогда не превышает 40% и не зависит от дозы. Это позволяет сделать вывод, что одной ДНК-последовательности SV40 недостаточно для эффективного ингибирования активности IL-6. С другой стороны, содержащая люциферазу репортерная плазмида pGL2-pv содержит промоторную последовательность SV40, но не содержит последовательность М8, давая, таким образом, в результате, основной уровень экспрессии люциферазы, более не индуцируемый IL-6. В этой плазмиде основной уровень экспрессии люциферазы не ингибируется ингибирующей плазмидой pM8SV, показывая, таким образом, что факторы транскрипции, которые специфически связываются только промоторной областью SV40 pGL2-pv, не удаляются эффективно ингибирующей плазмидой pM8SV. В действительности, в присутствии последней ингибирующей плазмиды активность люцеферазы из репортерной плазмиды pGL2-pv даже выше, чем в отсутствие указанной инигибирующей плазмиды (не показано).

Пример 6. Игибирование pM8SV активности IL-6, предоставленной плазмидой репортерного гена pHPSVL. Авторы затем пожелали проверить ингибирующую плазмиду pM8SV при дополнительном анализе репортерного гена для IL-6, когда последовательность ДНК-мишени, опосредующей сигнал IL-6 в плазмиде репортерного гена, не вполне соответствует ингибирующей последовательности М8. Поэтому клетки HepG2 трансфектируют плазмидой pHPSVL, которая содержит 841 пару оснований из промоторной последовательности гена человеческого гаптоглобина, фланкированную промотором SV40 и люциферазным геном. В этой плазмиде присутствует один сайт APRE из гаптоглобиновой промоторной последовательности (согласно Maeda at al., J. Biol. Chem., 260 (11), pp.6698-709, June 10, 1985). Авторы предварительно показали, что эта плазмида отвечает на IL-6 6-8-кратным увеличением экспрессии люциферазы (Surlupi Crescenzi et al., сообщение на 12-й Европейской конференции по иммунологии, Барселона, 14-17 июня 1994).

Результаты одного из экспериментов при трехкратном повторе трансфекции приводятся на фиг.8. После котрансфекции плазмиды репортерного гена pHPSVL с 50-кратным молярным избытком плазмиды-носителя индуцибельность за счет IL-6 дает, в результате, экспрессию люциферазы в 4 раза выше основного уровня. Напротив, котрансфекция с 50-кратным молярным избытком ингибирующей плазмиды pM8SV полностью разрушает индуцибельность за счет IL-6. Следовательно, ингибирующая плазмида pM8SV способна ингибировать активность IL-6 также тогда, когда испытывают отвечающую на IL-6 плазмиду репортерного гена, отличающуюся от pM8SVL (например, репортерную плазмиду pHPSVL).

Пример 7. Испытание ингибирующей плазмиды pM8SV в клетках T47D. Ингибирующую плазмиду рМ8SV также испытывают при анализе репортерного гена pM8SVL, используя клетки рака молочной железы человека T47D, где трансдукция сигнала IL-6 может быть иной, чем в клетках гепатомы. Как упоминалось ранее, анализ репортерного гена IL-6 с плазмидой репортерного гена pM8SVL работает в этой клеточной линии, хотя он не оптимизирован. Так как чувствительность анализа с клетками T47D иногда ниже, трансфекцию осуществляют с 1 мкг позитивной плазмиды репортерного гена на 105 клеток, что является относительно высоким уровнем плазмидной ДНК. Поэтому в этом эксперименте наблюдают неспецифическое ингибирование в присутствии избытка плазмиды-носителя или инигибирующей плазмиды, приводящее, в результате, к более высокой изменчивости IL-6-специфического ингибирования.

Результаты приводятся в табл.2. Показаны средние (ср) и стандартные отклонения (ст.откл.) трехкратно повторенной трансфекции в двух экспериментах.

Средние величины кратной индукции вычисляют из необработанных значений каждой трансфекции. В экспериментах 1 и 2 используют 1 и 0,5 мкг плазмиды репортерного гена, соответственно, на 105 трансфектированных клеток.

В этих экспериментах осуществляют отдельную трансфекцию плазмиды-носителя и ингибирующей плазмиды, причем обе плазмиды используют при указанном молярном избытке по отношению к репортерной плазмиде.

После трансфекции клетки индуцируют в течение 18 часов 1 нг/мл IL-6. Приведенные величины светового излучения являются чос за период в 30 секунд. Специфическое ингибирование IL-6 в этих экспериментах оценивают путем сравнения индукции, полученной в присутствии избытка ингибирующей плазмиды, и индукции, полученной в присутствии соответствующей дозы плазмиды-носителя.

Кроме того, из-за неспецифического ингибирования основной уровень экспрессии люциферазы приближается к количественному пределу анализа. Результаты, приведенные в табл. 2 (см. эксперимент 1), показывают, что после трансфекции, повторенной трижды, релевантное специфическое ингибирование активности IL-6 получают при 20-кратном молярном избытке ингибирующей плазмиды pM8SV, а не при 10-кратном молярном избытке. В этом эксперименте нельзя провести испытания при 50-кратном молярном избытке ингибирующей плазмиды, поскольку неспецифическое ингибирование становится слишком высоким.

Эти результаты нельзя воспроизвести в дополнительном эксперименте, когда используют 0,5 мкг ДНК на 105 клеток (табл.2, см. эксперимент 2). Причиной такого отсутствия воспроизводимости может быть относительно высокая изменчивость и низкая чувствительность анализа репортерного гена T47D. С другой стороны, эти результаты может объяснить различная селективность клеток-мишеней.

Пример 8. Определение минимальной ингибирующей последовательности ДНК. Чтобы идентифицировать минимальную ДНК-последовательность, которая сохраняет способность ингибировать связывание факторов транскрипции, релевантных для IL-6-индуцибельности, можно использовать экспериментальный подход анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) (по Ausubel). Испытание на функциональное ингибирование, сообщенное этой минимальной последовательностью, можно осуществить с использованием анализа репортерного гена, указанного в примере 3 и последующих примерах. Авторы показали, что минимальная ДНК-последовательность, которая функционально ингибирует активность IL-6 при анализе репортерного гена, является фрагментом Bam I-Hind III в 350 п.н. ингибирующей плазмиды pM8SV, которая содержит 8-кратный повтор APRE-ДНК-последовательности и ранней промоторной последовательности SV40. Известно, что эта последняя последовательность содержит сайты связывания для общих факторов транскрипции, такие как АР-1-подобный сайт (как сообщают Zenke et al. , EMBA J. , 5(2), pp.387-97, 1986), и 6-кратный повтор сайта Sp-1 (как сообщают Dynan et al., Cell, 35, pp.79-87, 1983). Фрагмент ДНК Bam I-Hind III может быть удален из ее 5'- и/или 3'-концов с помощью обычных методов, таких как PCR или обработка нуклеазой (по Ausubel), чтобы последовательность содержала, например, две APRE-последовательности и только один или несколько сайтов связывания для специфических факторов транскрипции из раннего промотора SV40. Получающиеся в результате ДНК-последовательности можно использовать для испытаний на ингибирование при анализе репортерного гена на основе pSVM8L в клетках HepG2.

Кроме того, минимальный фрагмент ДНК, который сохраняет полную способность функционально ингибировать сигнал IL-6, может быть использован при EMSA путем мечения этой ДНК 32P-нуклеотидом посредством обычных способов, таких как концевое мечение или вставка при реакциях Кленова. Получающийся в результате меченый ДНК-фрагмент можно инкубировать с нуклеарными экстрактами из клеток HepG2 после обработки IL-6.

Увеличивающееся количество конкурирующей ДНК-последовательности также можно коинкубировать, как какой-нибудь из немеченых ДНК-фрагментов, который образовался в результате вышеуказанных делеций фрагмента ингибирующей ДНК Bam I-Hind III. После инкубации смесь можно подвергнуть электрофорезу в неденатурирующем геле. Связывание релевантных факторов транскрипции с испытываемым меченым фрагментом ДНК будет обнаруживаться по сдвигу в подвижности геля (замедлению), ожидаемому для несвязанной меченой ДНК. Ингибирование этого связывания в присутствии конкурирующих немеченых ДНК-последовательностей будет обнаруживаться по специфическому исчезновению сдвинутых полос в геле.

Похожие патенты RU2205874C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ АКТИВАЦИИ ТРАНСКРИПЦИОННО-МОЛЧАЩЕГО ГЕНА 1990
  • Скотт С.Чеппель
RU2128227C1
ПОЛИПЕПТИД, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ), ДНК (ВАРИАНТЫ), ВЕКТОР (ВАРИАНТЫ), КЛЕТКА, ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ (ВАРИАНТЫ) 1993
  • Антонино Сирна
RU2177480C2
ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ИЗОФОРМА АНТАГОНИСТА РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 1995
  • Колотта Франческо
  • Муцио Марта
  • Мантовани Альберто
RU2193064C2
РЕЦЕПТОР ФОЛЛИКУЛОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ГОРМОНА (FSH) ЧЕЛОВЕКА, ДНК, ВЕКТОР, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ 1992
  • Келтон Кристи Энн
  • Ченг Ширлей Вью Йен
  • Нугент Норин Патрис
  • Швайкхардт Рене Линн
RU2193599C2
ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ БЕЛОК 1995
  • Эндрю Марк Шарки
  • Стивен Кивин Смит
  • Кимберли Деллоу
RU2155810C2
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, СПОСОБ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ STREPTOMYCES ГЕНА α -АМИЛАЗЫ 1990
  • Антонио Даза Ортега
  • Хосе Антонио Жиль
  • Томас Вигаль Гарсиа
  • Хуан Франциско Мартин
RU2124559C1
ФРАГМЕНТ ДНК, ПОЛУЧЕННЫЙ ПУТЕМ МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛОНИРОВАНИЯ ИЗ STREPTOMYCES GRISEUS АТСС 10137, КОДИРУЮЩИЙ SAF-ПОЛИПЕПТИД, SAF-ПОЛИПЕПТИД, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ ЭКСПРЕССИЮ SAF-ПОЛИПЕПТИДА (ВАРИАНТЫ), РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PULAD3, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PULAD 300, ШТАММ ГРИБОВ STREPTOMYCES LIVIDANS, СОДЕРЖАЩИЙ РЕКОМБИНАНТНУЮ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК PULAD3, И СПОСОБ ЭКСПРЕССИИ SAF-ПОЛИПЕПТИДА 1990
  • Антонио Даза Ортега
  • Хосе Антонио Жиль
  • Томас Вигаль Гарсиа
  • Хуан Франциско Мартин
RU2114910C1
РАСТВОРИМЫЕ ПОЛИПЕПТИДНЫЕ ФРАКЦИИ ПРОТЕИНА LAG-3, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ, ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, АНТИТЕЛО 1995
  • Фор Флоранс
  • Эрсен Тьерри
  • Юар Бертран
  • Триебель Фредерик
RU2178306C2
ЖИДКИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ХОРИОНИЧЕСКИЙ ГОНАДОТРОПИН (HCG) 1995
  • Фабрицио Самаритани
  • Патрициа Натале
RU2160605C2
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, РАСПОЛОЖЕННАЯ ВЫШЕ ГЕНА CARP, ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ ЭТУ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ 2001
  • Бенуа Патрик
  • Шварц Бертран
  • Бранеллек Дидье
  • Чиэнь Кеннет
  • Чэнь Цзюй
RU2283865C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 205 874 C2

Реферат патента 2003 года НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, СПОСОБНАЯ ИНГИБИРОВАТЬ АКТИВНОСТЬ IL-6, ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ ТРАНСФЕКЦИИ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ПРИ ТЕРАПИИ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ (ВАРИАНТЫ)

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для ингибирования активности IL-6. Нуклеотидная последовательность, способная ингибировать активность IL-6, содержит I) восьмикратный повтор нуклеотидной последовательности, которая является APRE-элементом общей формулы ZXMYKGKAA, где Z представляет Т или G или может также отсутствовать, Х представляет Т или может также отсутствовать, М представляет С или A, Y представляет С или Т и К представляет Т или G, в сочетании с II) по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью, составляющей сайт связывания фактора транскрипции иной, чем APRE-элемент, такой как сайты, присутствующие в промоторных областях. На основе полученной нуклеотидной последовательности конструируют плазмидный вектор для трансфекции в клетки млекопитающих. Изобретение позволяет разрабатывать фармацевтические композиции для ингибирования активности IL-6. 4 с. и 7 з.п.ф-лы, 8 ил., 2 табл.

Формула изобретения RU 2 205 874 C2

1. Нуклеотидная последовательность, способная ингибировать активность IL-6, которая содержит i) восьмикратный повтор нуклеотидной последовательности, которая представляет собой последовательность элемента реакции острой фазы (APRE-элемент) общей формулы ZXMYKGKAA, где Z представляет Т, или G, или может отсутствовать; Х представляет Т или может отсутствовать; М представляет С или А; Y представляет С или Т и К представляет Т или G, в сочетании с ii) по меньшей мере, одной нуклеотидной последовательностью, составляющей сайт связывания фактора транскрипции иной, чем APRE-элемент, и такой, что присутствует в области промотора. 2. Нуклеотидная последовательность по п.1, где (i) является последовательностью TTCTGGGAA. 3. Нуклеотидная последовательность по любому из предшествующих пунктов, где (ii) выбирают из группы, состоящей из блока ТАТА и сайтов связывания для следующих факторов транскрипции: АР-1, АР-2, HNF-1, SP-1, NF-kB, Oct-1, E-2 и SRF. 4. Нуклеотидная последовательность по любому из предшествующих пунктов, где последовательность (i) содержит, по меньшей мере, два различных APRE- элемента. 5. Нуклеотидная последовательность по любому из предшествующих пунктов, где последовательность (ii) содержит, по меньшей мере, две различные олигонуклеотидные последовательности, составляющие сайт связывания фактора транскрипции. 6. Нуклеотидная последовательность по п.5, где последовательность (ii) является ранним промотором SV40. 7. Нуклеотидная последовательность по п.1, имеющая вид SEQ ID N 1. 8. Плазмидный вектор для трансфекции в клетки млекопитающих, содержащий нуклеотидную последовательность по п.1, функционально связанную с регуляторными участками. 9. Нуклеотидная последовательность по любому из пп.1-7 для ингибирования действия IL-6 при терапии. 10. Фармацевтическая композиция для ингибирования действия IL-6, содержащая эффективное количество нуклеотидной последовательности по любому из пп. 1-7 вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или эксципиентами. 11. Фармацевтическая композиция для ингибирования IL-6, содержащая эффективное количество плазмидного вектора по п.8 вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или эксципиентами.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2003 года RU2205874C2

A
RAY et al
Приспособление для точного наложения листов бумаги при снятии оттисков 1922
  • Асафов Н.И.
SU6A1
Molecular and Cellular Biology
Способ приготовления консистентных мазей 1919
  • Вознесенский Н.Н.
SU1990A1
H.WU et al
Inhibition of in vitro transcription by specific double-stranded oligodeoxyribonucleotides
Gene, 1990, v.89, p.203-209
C.CLUESL et al
Ex vivo regulation of specific gene expression of nanomolar concentration of double-stranded duble oligonucleotides
Nucleic Acids Research
Способ изготовления фанеры-переклейки 1921
  • Писарев С.Е.
SU1993A1

RU 2 205 874 C2

Авторы

Серлупи-Крешенци Оттавиано

Пеццотти Аннарита

Даты

2003-06-10Публикация

1995-05-11Подача