СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНТИФОСФОЛИПИДНОГО СИНДРОМА У ПАЦИЕНТОВ С ТРОМБОЗАМИ И/ИЛИ АКУШЕРСКОЙ ПАТОЛОГИЕЙ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/53 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, а именно к разделу клинической медицины - ревматологии, и может быть использовано для диагностики антифосфолипидного синдрома (АФС) у пациентов с тромбозами и акушерской патологией.

Уровень техники

АФС - приобретенное тромбофилическое заболевание, при котором продуцируются аутоантитела к фосфолипидным детерминантам мембран клеток или фосфолипидсвязывающим белкам крови [Решетняк ТМ. Антифосфолипидный синдром: диагностика и клинические проявления (лекция). Научно-практическая ревматология. 2014; 52 (1): 56-71. doi: 10.14412/1995-4484-2014-56-71]. Распространенность АФС составляет 1 случай на 2000 пациентов. Клинические проявления, связанные с антифосфолипидными антителами (аФЛ), варьируют от бессимптомного носительства аФЛ до развития жизнеугрожающих состояний. Клиническая картина АФС характеризуется не только артериальными и/или венозными тромбозами, но и патологией беременности (рецидивирующий синдром потери плода в любом триместре беременности, преэклампсия/эклампсия, задержка внутриутробного развития плода, фетоплацентарная недостаточность) [Решетняк ТМ, Чельдиева ФА, Нурбаева КС, и др. Антифосфолипидный синдром: диагностика, механизм развития, вопросы терапии. Тромбоз, гемостаз и реология. 2020;(4):4-21. doi: 10.25555/THR.2020.4.0940].

Первые клинико-лабораторные критерии АФС были разработаны в 1998 г. экспертами международного симпозиума в Саппоро (Япония). В 2006 г. в Сиднее - последний пересмотр критериев АФС, в которых клинические проявления остались схожими, однако изменения коснулись серологических маркёров: удлинено время повторного их исследования - через не менее чем 12 недель вместо 6, для исключения ложно-позитивных результатов на фоне инфекций [Miyakis S, Lockshin MD, Atsumi T, Branch DW, Brey RL, Cervera R, et al. International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome (APS). J Thromb Haemost 2006; 4:2 95-306, doi: 10.1111/j.1538-7836.2006.01753.x].

Сиднейские критерии классификации (АФС диагностируется при наличии одного клинического и одного серологического критерия) включают:

1. Клинические критерии:

a) сосудистый тромбоз (один или более клинических эпизодов артериального, венозного тромбоза или тромбоз мелких сосудов в любой ткани или органе);

b) патология беременности (один или более случае внутриутробной гибели морфологически нормального плода после 10 недель гестации или один или более случаев преждевременных родов морфологически нормального плода до 34 недель гестации из-за выраженной преэклампсии, или эклампсии, или выраженной плацентарной недостаточности, или три или более последовательных случаев спонтанных абортов до 10-й недели гестации (исключение - анатомические дефекты матки, гормональные нарушения, материнские или отцовские хромосомные нарушения).

2. Лабораторные критерии:

a) антитела к кардиолипину (аКЛ) IgG- или IgM-изотипа, выявляемые в сыворотке в средних или высоких концентрациях по крайней мере 2 раза не менее чем через 12 недель стандартизованным иммуноферментным анализом (ИФА);

b) антитела к β₂-гликопротеину 1 (анти-β₂ГП1) IgG- и/или IgM-изотипа, выявляемые в сыворотке в средних или высоких концентрациях по крайней мере 2 раза не менее чем через 12 недель стандартизованным ИФА;

c) Волчаночный антикоагулянт (ВА) в плазме в двух или более случаях исследования с промежутком не менее 12 недель, определяемый согласно рекомендациям Международного общества тромбозов и гемостаза (исследовательская группа по ВА/фосфолипид-зависимым антителам): а) удлинение времени свертывания плазмы в фосфолипидзависимых коагулогических тестах: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), коалиновое время свертывания (КВС), протромбиновое время, тесты с ядами Рассела, текстариновое время; б) отсутствие коррекции удлинения времени свертывания в скрининговых тестах при проведении тестов смешивания с донорской плазмой; в) укорочение или коррекция удлинения времени свертывания в скрининговых тестах при добавлении фосфолипидов; г) исключение других коагулопатий (например, ингибитора фактора VIII свертывания крови или гепарина), удлиняющих фосфолипидзависимые тесты свертывания крови.

Как видно из критериев, диагностика АФС во многом зависит от выявления аФЛ, так как тромбозы и акушерская патология могут быть проявлениями и других заболеваний. Однако спектр аФЛ, входящих в критерии 2006 г. ограничен только 3-мя видами аФЛ. Семейство аФЛ включает достаточно большую группу аутоантител, диагностическая значимость которых в настоящее время продолжает обсуждаться. Кроме того, у ряда пациентов имеются классические клинические признаки АФС без наличия стандартных аФЛ.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является создание более точного способа диагностики АФС с помощью определения различного спектра аФЛ у пациентов с тромбозами и/или акушерской патологией.

Раскрытие сущности изобретения

Заявляемый способ диагностики позволяет, используя анамнестические данные и данные физикального обследования, а также результаты иммунологического анализа крови, с высокой долей вероятности (не менее 91%) верифицировать АФС у больных с тромбозами и акушерской патологией. Предлагаемый способ позволит врачам практического здравоохранения своевременно установить диагноз, что будет способствовать своевременному назначению антикоагулянтной терапии с целью профилактики рецидива сосудистых осложнений.

Технический результат достигается тем, что проводят забор образца венозной крови пациента и проводят измерение (определение) в образце крови следующих параметров:

1. IgG/IgM аКЛ, IgG/IgM анти-β₂ГП1 методом ИФА;

2. Волчаночный антикоагулянт (ВА) на автоматическом коагулометре с использованием скринингового (ВА1) и подтверждающего (ВА2) тестов;

3. IgG/IgM/IgA аКЛ, IgG/IgM/IgA анти-β₂ГП1, IgG анти-β₂ГП1DI методом ХЛА;

4. IgG/IgM аФс/Пт методом ИФА.

При этом определение аФЛ проводят следующим образом:

1. Первый этап - определение IgG/IgM аКЛ, IgG/IgM анти-β₂ГП1 методом ИФА и исследование ВА. При выявлении какого-либо исследуемого аФЛ и подтверждении его позитивности спустя 12 недель ставят диагноз АФС.

2. При их отрицательных значениях проводится определение IgG/IgM аКЛ, IgG/IgM- анти-β₂ГП1 методом ХЛА. При выявлении какого-либо исследуемого аФЛ и подтверждении его позитивности спустя 12 недель ставят диагноз АФС.

3. При отсутствии IgG/IgM аКЛ, IgG/IgM анти-β₂ГП1 (как ИФА, так и ХЛА) и ВА проводят определение IgA аКЛ, IgA анти-β₂ГП1, IgG анти-β₂ГП1DI (методом ХЛА) и IgG/IgM аФс/Пт (методом ИФА). При выявлении какого-либо из исследуемых внекритериальных аФЛ и подтверждении позитивности спустя 12 недель ставят диагноз АФС.

Заявляемый способ пошагово расписывает план диагностики АФС, что может существенно сократить экономические затраты и установить диагноз с точностью не менее 91% за срок, не превышающий 16 недель (период в интервальном значении от 12 до 16 недель) при условии повторного определения аФЛ через 12 недель и с учетом времени, затраченного на выполнение анализов.

Определение параметров можно проводить одномоментного, а также могут быть использованы показатели ранее проведенных исследований показателей, что может существенно сократить экономические затраты.

Расширение спектра определяемых аФЛ, среди которых внекритериальные аФЛ (IgA аКЛ, IgA анти-β2ГП1, IgG/IgM антитела к комплексу фосфатидилсерин-протромбин (аФс/Пт) и IgG антитела к домену 1 β2-гликопротеина 1 (анти-β2ГП1D1), а также использование хемилюминесцентного анализа (ХЛА) для определения аФЛ позволяет с высокой точностью проводить диагностику АФС у пациентов с тромбозами и/или акушерской патологией.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлены кривые ROC-анализа исследуемых внекритериальных антифосфолипидных антител в зависимости от наличия антифосфолипидного синдрома, а - для IgG анти-β₂-ГП1DI, б - для IgA аКЛ, в - для IgA анти-β₂ГП1, г - для IgG/IgM аФс/Пт.

Осуществление изобретения

Предлагаемые методы исследования аФЛ и новые серологические маркеры позволят своевременно диагностировать заболевания, а предлагаемый метод диагностики АФС превосходит предложенные критерии 2006 г.

В настоящее время, согласно критериям 2006 г., для определения аФЛ используют ИФА. Одним из недостатков определения аФЛ методом ИФА является их низкая специфичность. При определении IgG/IgM аКЛ и IgG/IgM анти-β₂ГП1 ИФА выявляются различные типы антител, которые могут не обладать патогенными свойствами - например, низкоаффинные антитела, криптические аФЛ и др. На результаты значений аФЛ при исследовании ИФА могут также влиять такие факторы как: свойства стандартных и контрольных сывороток (специфичность, авидность, стабильность), технология ИФА, аналитические характеристики используемых тест-систем, наличие интеркуррентной инфекции и др.

Определение аФЛ методом ХЛА обладает рядом преимуществ: высокая аналитическая чувствительность и производительность, широкий диапазон определяемых концентраций с сохранением высокой точности на любом отрезке калибровочной кривой. Стоит отметить, что несмотря на, казалось бы, немалое количество маркеров заболевания (5 лабораторных маркеров) встречаются пациенты с классическими признаками АФС, но с отрицательными аФЛ по международным критериям 2006 г. При исследовании аФЛ методом ХЛА возможно определение не только классических аФЛ, но и некоторых внекритериальных, необходимость определения которых обусловлена наличием пациентов с классическими клиническими признаками АФС, но с отрицательными аФЛ по принятым критериям.

Таким образом, преимущества заявляемого способа диагностики АФС заключается в расширении спектра исследуемых аФЛ, по сравнению с критериями 2006 г., в частности определение IgG анти-β₂ГП1DI, IgA аКЛ, IgA анти-β₂ГП1 и IgG/IgM аФс/Пт и определение классических аФЛ методом ХЛА [Ткаченко О.Ю., Лапин С.В., Мазинг А.В., Блинова Т.В., Бутина С.Е., Эмануэль В.Л. Новые методы выявления антифосфолипидных антител. Доктор.Ру. 2019; 10(165): 57-62. doi: 10.31550/1727-2378-2019-165-10-57-62; Arachchillage DRJ, Laffan M. Pathogenesis and management of antiphospholipid syndrome. Br J Haematol. 2017 Jul;178(2):181-195. doi: 10.1111/bjh.14632].

Так же известно, что ВА является лучшим предиктором тромботических осложнений и неблагоприятного исхода беременности, по сравнению с аКЛ или анти-β₂ГП1, однако интерпретация положительного результата на наличие ВА затруднена на фоне антикоагулянтной терапии. Кроме того, зачастую пациенты попадают на прием к ревматологу принимая антикоагулянтную терапию, в связи с чем определение ВА не проводится. Отрицательные результаты определения IgG/IgM аКЛ и IgG/IgM анти-β₂ГП1 методом ИФА затрудняют и/или откладывают своевременную диагностику АФС. Отмена антикоагулянтной терапии для определения ВА в ряде случаев сопряжена с высокими рисками рецидива тромбоза, в связи с чем дополнительное определение аФЛ методом ХЛА и/или определение внекритериальных аФЛ позволит врачам своевременно диагностировать заболевание.

Значимость исследования IgG анти-β₂ГП1DI нашла отражение в систематическом обзоре M. Radin и соавт. [Radin M, Cecchi I, Roccatello D, Meroni PL, Sciascia S. Prevalence and Thrombotic Risk Assessment of Anti-β2 Glycoprotein I Domain I Antibodies: A Systematic Review. Semin Thromb Hemost. 2018 Jul;44(5):466-474. doi: 10.1055/s-0037-1603936].

Диагностика АФС у пациентов с СКВ значительно повышается при определении IgA анти-β₂ГП1 в дополнение к IgG- и IgM анти-β₂ГП1. Результаты работы Lakos G. и соавт. (1999) так же позволили рекомендовать определение IgA анти-β₂ГП1 в дополнение к IgG- и IgM анти-β₂ГП1 при подозрении на АФС [Lakos G, Kiss E, Regëczy N, Tarján P, Soltész P, Zeher M, Bodolay E, Szakony S, Sipka S, Szegedi G. Isotype distribution and clinical relevance of anti-beta2-glycoprotein I (beta2-GPI) antibodies: importance of IgA isotype. Clin Exp Immunol. 1999 Sep;117(3):574-9. doi: 10.1046/j.1365-2249.1999.01007.x].

В исследовании V. Murthy и соавт. (2013) было показано, что определение IgA анти-β₂ГП1 может быть полезным у пациентов с классическими клиническими признаками АФС, отрицательными по критериальным аФЛ [Murthy V., Rohan Willis R., Romay-Penabad Z. et al. Value of isolated IgA anti-β2-glycoprotein I positivity in the diagnosis of the antiphospholipid syndrome. Arthritis Rheum. 2013;65(12):3186-93. DOI: 10.1002/art.38131].

Клиническая значимость аФс/Пт в диагностике АФС отмечена рядом исследователей [Žigon P, Čučnik S, Ambrožič A, et al. Antibodies to phosphatidylser-ine/prothrombin complex as an additional diagnostic marker of APS? Lupus. 2012 Jun;21(7):790-2. doi: 10.1177/0961203312444173; Tselios K, Sarantopoulos A, Gkougkourellas I, Boura P. The role of anti-phosphatidylserine/prothrombin antibodies in thrombotic manifestations of systemic lupus erythematosus patients. Front Neurol. 2013 Jun 4;4:66. doi: 10.3389/fneur.2013.00066; Atsumi T, Ieko M, Bertolaccini ML, et al. Association of autoantibodies against the phosphatidylserine-prothrombin complex with manifestations of the antiphospholipid syndrome and with the presence of lupus anticoagulant. Arthritis Rheum. 2000 Sep;43(9):1982-93. doi: 10.1002/1529-0131(200009)43:9<1982:AID-ANR9>3.0.CO;2-2].

Способ разработан на основании обследования 192 пациентов с АФС и системной красной волчанкой (СКВ), группы сравнения - 50 пациентов (тромбоз без аФЛ (n=7), ревматоидный артрит (РА) (n=11), болезнь Бехчета (ББ) (n=15), системная склеродермия (ССД) (n=12), беременные (n=2), полимиозит (n=2) и эндартериит Бюргера (n=1) и 100 относительно здоровых лиц, составивших группу контроля. Все пациенты и группа контроля подписали информированное согласие о включении в исследование и были обследованы в ФГБНУ НИИР им. В.А. Насоновой. Клинико-лабораторная характеристика включенных в исследование лиц приведена в табл. 1.

Определение аФЛ поводили следующим образом:

- IgG/IgM аКЛ, IgG/IgM анти-β₂ГП1 методом ИФА на автоматическом анализаторе для лабораторной диагностики аутоиммунных заболеваний Alegria (фирма «Orgentec Diagnostika GmbH», Германия) с набором реагентов для определения антител фирмы Orgentec Diagnostika GmbH, Германия. IgG аКЛ измерялись в фосфолипидсвязывающей активности IgG аКЛ на 1 мкг/мл в единицах GPL (IgG phospholipid binding units (GPL Ед/мл), а IgM-аКЛ - в фосфолипидсвязывающей активности IgM аКЛ на 1 мкг/мл в MPL (IgM phospholipid binding units (MPL Ед/мл). IgG/IgM анти-β₂ГП1 измерялись в Ед/мл;

- ВА на автоматическом коагулометре фирмы Siemens Healthcare (Германия) с использованием скринингового (ВА1) и подтверждающего (ВА2) тестов. Исследование ВА необходимо проводить пациентом, не получающим антикоагулянты;

- IgG/IgM/IgA аКЛ, IgG/IgM/IgA анти-β₂ГП1, IgG анти-β₂ГП1DI методом ХЛА на анализаторе BIO-FLASH® (фирма «BiokitS.A.», Испания). Набор реагентов для определения IgG/IgM анти-β₂ГП1 и IgG/IgM аКЛ - AcuStar, Испания, для определения IgA аКЛ, IgA анти-β₂ГП1 и IgG анти-β₂ГП1DI - QUANTA Flash®, США. Исследуемые аФЛ измерялись в CU;

- IgG/IgM аФс/Пт методом ИФА c помощью абсорбционного микропланшетного спектрофотометра Tecan sunrise (Австрия) с набором реагентов для определения антител фирмы AESKULISA Serin-Prothrombin-GM. IgG/IgM аФс/Пт измерялись в Ед/мл.

Таблица 1 Общая характеристика обследованных больных и группы контроля Параметр Значение параметра ПАФС, n=55 верАФС, n=12 СКВ+АФС, n=61 СКВ, n=64 Всего, n=192 Группа сравнения, n=50 Группа контроля, n=100 Возраст
Me [25;75 перцентиль], лет 38,0
[32,0-43,0] 34,0
[29,5-45,5], 40,0
[33,0-46,0] 31,5
[24,0-40,5] 37,0
[29,0-43,5] 39,5
[35,0-49,0] 41,0
[30,0-54,0] Длительность заболевания
Me [25;75 перцентиль], лет 8,9
[3,6-13,0] 0,9
[0,3-2,1] 12,0
[5,8-19,0] 4,1
[1,8-9,3] 7,0
[2,0-15,0] 6,5 [1,6-20,0] - Пол: женщины/мужчины, абс. 32 / 23 10 / 2 49 / 12 56 / 8 147 /45 34 / 16 86 / 14 Тромбоз, n (%)
Вен. тромбоз, n (%)
Арт. тромбоз, n (%)
Арт. и вен. тромбоз, n (%) 47 (90)
21 (45)
16 (34)
10 (21) 1 (8)
0 (0)
0 (0)
1 (100) 51 (86)
24 (47)
15 (29)
12 (24) 14 (22)
10 (72)
2 (14)
2 (14) 113 (60)
55 (49)
33 (29)
25 (22) 20 (40)
14 (70)
5 (25)
1 (5) 1 (1) **
1 (100)
0 (0)
0 (0) Невынашивание беременности, n (%)* n=20
19 / (95) n=2
1 / (50) n=31
26 / (84) n=16
7 / (44) n=69
53 / (77) n=13
5 / (38) n=51
2 (4)*** IgG аКЛ, n (%),
Me [25;75 перцентиль]
IgM аКЛ, n (%),
Me [25;75 перцентиль]
IgG+IgM аКЛ, n (%) 40 (73)
120,0 [79,8-120,0]
12 (22)
49,9 [33,5-74,9]
8 (15) 7 (58)
120,0 [79,8-120,0]
3 (25)
30,6 [25,5-53,6]
1 (8) 41 (67)
107,9 [58,4-120,0]
11 (18)
66,8 [49,8-80,0]
8 (13) 8 (12,5)
84,5 [55,0-115,6]
7 (11)
59,5 [41,5-80,0]
6 (9) 96 (50)
120,0 [69,6-120,0]
33 (17)
55,2 [36,9-80,0]
23 (12) n=21; 0 (0)
0,0 [0,0-0,0]
n=21; 0 (0)
0,0 [0,0-0,0]
n=21; 0 (0) нд IgG анти-β₂ГП1, n (%),
Me [25;75 перцентиль]
IgM анти-β₂-ГП1, n (%),
Me [25;75 перцентиль]
IgG+IgM анти-β₂ГП1, n (%) 39 (71)
100,0 [56,9-100,0]
12 (22)
40,5 [18,3-58,5]
11 (20) 7 (58)
100,0 [100-100,0]
5 (42)
26,0 [25,0-33,9]
3 (25) 46 (75)
75,9 [46,2-100,0]
13 (21)
78,8 [27,2-94,0]
12 (20) 9 (14)
59,3 [49,9-73,4]
7 (11)
58,2 [26,8-100,0]
6 (9) 100 (52)
86,6 [50,1-100,0]
37 (19)
41,3 [25,0-84,7]
32 (17) n=19; 2 (10,5)
35,3 [19,9-50,8]
n=19; 0 (0)
0,0 [0,0-0,0]
n=19; 0 (0) нд Терапия:
Глюкокортикоиды
Гидроксихлорохин
БПВП
Аспирин
НМГ
ПОАК
Варфарин 4 (7)
33 (60)
0 (0)
19 (35)
7 (13)
28 (51)
11 (20) 2 (17)
4 (33)
0 (0)
3 (25)
1 (8)
1 (8)
0 (0) 48 (79)
54 (88)
7 (11)
23 (38)
10 (16)
19 (31)
15 (25) 54 (84)
55 (86)
19 (30)
18 (28)
14 (22)
2 (3)
2 (3) 108 (56)
146 (76)
26 (14)
63 (33)
32 (17)
50 (26)
28 (15) 32 (64)
9 (18)
27 (54)
8 (16)
8 (16)
8 (16)
1 (2) -

Примечание: значения представлены как Me [25%; 75%-ные квартили] или количество (доля в процентах); n - количество пациентов в группах; нд - нет данных, аКЛ - антитела к кардиолипину, анти-β₂-ГП1 - антитела к бета-2 гликопротеину 1, ПАФС - первичный антифосфолипидный синдром, верАФС - вероятный антифосфолипидный синдром, СКВ - системная красная волчанка, АФС - антифосфолипидный синдром, арт - артериальный тромбоз, вен - венозный тромбоз, БПВП - базисные противовоспалительные препараты, НМГ - низкомолекулярные гепарины, ПОАК - пероральные антикоагулянты; *акушерская патология рассчитана из числа женщин, имевших беременность на фоне заболевания, **постинъекционный тромбоз, ***у 1 - выкидыш до 10-ой недели гестации, у 1 - преэклампсия

На основании средних значений группы контроля для определения IgG/IgM/IgA аКЛ, IgG/IgM/IgA анти-β₂ГП1 (ХЛА) и IgG/IgM аФс/Пт (ИФА) были выделены уровни позитивности по формулам: среднее арифметическое (М) + 3 или 5 стандартных отклонений (SD): М+3SD и М+5SD. Оценка диагностической ценности выделенных уровней позитивности и уровней, предложенных производителями реагентов, проводилась согласно формулам, представленным в таблице 2.

Таблица 2 Формулы для определения метрик диагностической ценности предложенных уровней позитивности исследуемых антифосфолипидных антител Показатель Формула Чувствительность Истинно позитивные / истинно позитивные + ложно отрицательные Специфичность Истинно отрицательные / истинно отрицательные + ложно позитивные Точность (общая валидность) Истинно позитивные + истинно отрицательные / истинно позитивные + истинно отрицательные + ложно позитивные + ложно отрицательные Отношение правдоподобия положительного результата Чувствительность / 1 - специфичность Отношение правдоподобия отрицательного результата 1 - чувствительность / специфичность Прогностическая ценность положительного результата Истинно позитивные / истинно позитивные + ложно позитивные Прогностическая ценность отрицательного результата Истинно отрицательные / истинно отрицательные + ложно отрицательные Частота ложных срабатываний 1 - специфичность

На основании этого анализа были выделены уровни позитивности для всех определяемых антител: позитивные значения в ХЛА для IgG аКЛ составили уровни >25,9 CU (M+5SD), для IgM аКЛ - >19,5 CU (M+3SD), для IgA аКЛ - >18,9 CU (М+5SD), для IgG анти-β₂ГП1 - >32,0 CU (М+5SD), для IgM анти-β₂ГП1 - >6,9 CU (М+3SD), для IgA анти-β₂ГП1 - >20,0 CU (данные фирмы производителя реагентов), для IgG анти-β₂ГП1DI - >19,0 CU (данные фирмы производителя реагентов) , для IgG аФс/Пт - >73,6 Ед/мл (M+3SD), для IgM аФс/Пт - >18,0 Ед/мл (данные фирмы производителя реагентов).

Для анализа диагностической эффективности определения внекритериальных аФЛ использовалась характеристическая кривая - ROC-кривая (receiver operating characteristic, «кривая ошибок»), отражающая зависимость частоты истинно положительных результатов от частоты ложноположительных результатов. ROC-кривые строились в пакете программы IBM SPSS Statistics 13.0 for Windows (IBM Corporation, USA). Клиническая информативность лабораторного теста определялась тем, насколько высоко лежит его ROC-кривая. Для оценки ROC-кривых вычислялась площадь под кривой (AUC = area under the curve). AUC оценивалась в диапазоне 0-1: < 0,6 - непригодно, 0,61-0,8 - требуется доработка, ≥ 0,81 - может быть допущено к клинической валидации.

Площадь под ROC-кривой для IgG анти-β₂ГП1DI составила 0,838 (фиг. 1а), для IgA аКЛ - 0,851 (фиг. 1б), для IgA анти-β₂ГП1 - 0,813 (фиг. 1в), для IgG аФс/Пт - 0,822 (фиг. 1г), для IgM аФс/Пт - 0,693 (фиг. 1г).

Для анализа различия частот в 2-х независимых группах объектов исследования (определение IgG/IgM аКЛ и IgG/IgM анти-β₂ГП1 методами ИФА и ХМА) использовали методы статистического анализа: χ² (критерий Пирсона), при наличии абсолютных частот в клетках таблиц частот меньше 10 применялся χ² с поправкой по Йетесу (табл. 3). Для измерения степени согласованности результатов определения аФЛ методами ИФА и ХЛА использовался коэффициент каппа Коэна. Вычисление коэффициента производилось с помощью статистического программного пакета IBM SPSS 26.0. при значениях коэффициента каппа Коэна менее 0,20 степень согласованности считалась очень слабой, при 0,21-0,40 - слабой, 0,41-0,60 - умеренной, 0,61-0,80 - хорошей, 0,81-1,00 - очень хорошей.

Таблица 3 Частота положительных значений IgG/IgM антител к кардиолипину и IgG/IgM антител к бета-2 гликопротеину 1 при исследовании иммуноферментным анализом (ИФА) и хемилюминесцентным анализом (ХЛА) Показатель ИФА
Число позитивных пациентов, n (%) ХЛА
Число позитивных пациентов, n (%) χ²; р Каппа; р IgG аКЛ, n=192 пол 96 (50) 118 (61) 5,11; 0,02 0,667;
0,0001 отр 96 (50) 74 (39) IgM аКЛ, n=192 пол 33 (17) 56 (29) 7,74; 0,005 0,537;
0,0001 отр 159 (83) 136 (71) IgG анти-β₂ГП1, n=191 пол 100 (52) 122 (64) 5,21; 0,02 0,621;
0,0001 отр 91 (48) 69 (36) IgM анти-β₂ГП1, n=191 пол 37 (19) 61 (32) 7,91; 0,004 0,615;
0,0001 отр 154 (81) 130 (68)

Пример 1

Примером, подтверждающим более частое выявление аФЛ методом ХЛА и необходимость определения внекритериальных антител, может служить пациентка с клиническими проявлениями АФС, у которой определялись отрицательные уровни аФЛ при их неоднократном определении методом ИФА.

Пациентка Ч., 46 лет (1976 г. р.), наблюдается в ФГБНУ НИИР им. В.А. Насоновой с 38 лет с достоверным диагнозом СКВ. У пациентки было 3 случая невынашивания беременности (мертворождения в связи с фетоплацентарной недостаточностью на 38, 25 и 18 неделях гестации в возрасте 22 лет (1998 г.), 29 лет (2005 г.) и 31 года (2007 г.)), 2 эпизода острого нарушения мозгового кровообращения (в 34 года (2010 г) и в 39 лет (2015 г.)), а также тромбоз глубоких вен правой нижней конечности в 36 лет (2012 г.). Пациентке неоднократно проводилось определение аФЛ методом ИФА, однако уровни их были негативными, в связи с чем диагноз АФС, согласно критериям 2006 г., не был подтвержден. Нами были исследованы IgG/IgM аКЛ и IgG/IgM анти-β₂ГП1 методом ХЛА. Выявлены позитивные значения IgG аКЛ (82,8 CU) и IgG анти-β₂ГП1 (189,8 CU). В динамике (спустя 19 месяцев) их уровни составили 80,3 CU и 150,2 CU соответственно. Кроме того, для подтверждения диагноза были определены и внекритериальные антитела, среди которых отмечались позитивные уровни IgG анти-β₂ГП1DI - 239,9 CU, а через 19 месяцев - 366,8 CU.

Таким образом, по критериям 2006 г. диагноз АФС у данной пациентки не может быть выставлен. Однако, выявление IgG аКЛ, IgG анти-β₂ГП1 и IgG анти-β₂ГП1DI методом ХЛА, и, затем, сохранение их позитивных уровней в динамике, позволили верифицировать АФС и обосновать долговременный прием варфарина.

Пример 2

Примером, подтверждающим согласованность определения аФЛ ИФА и ХЛА, может служить пациент с достоверным диагнозом АФС.

Пациент Б., 41 год (01.11.1980 г. р.) наблюдается в ФГБНУ НИИР им. В.А. Насоновой с весны 2016 г. с достоверным диагнозом СКВ и АФС. Из анамнеза известно, что в январе 2005 г. (в возрасте 24 лет) перенес тромбоз локтевой и лучевой артерий, а в мае 2018 г. у пациента случился спонтанный разрыв левой почки. При морфологическом исследовании биоптата почки преобладали проявления АФС (выявлялись свежие и организованные тромбы в сосудах почки; ишемический инфаркт почки с геморрагическим пропитыванием), волчаночный гломерулонефрит имел низкий индекс активности. Пациенту неоднократно проводилось определение аФЛ методом ИФА, уровни их были стабильно высоко-позитивными (IgG аКЛ - более 120 GPL, IgG анти-β₂ГП1 - более 100 Ед/мл). Определение аФЛ ХЛА подтвердило наличие высоких значений аФЛ: IgG аКЛ - 2024,0 CU, IgG анти-β₂ГП1 - 6541,4 CU. Так же у пациента выявлялись позитивные уровни внекритериальных антител: IgA аКЛ - 24,7 CU, IgG анти-β₂ГП1DI - 280,3 CU, IgG аФс/Пт - 263,39 Ед/мл.

Таким образом, диагноз АФС у пациента подтверждается как критериями 2006 г., так и заявляемым способом диагностики данного заболевания.

Пример 3

Примером, показывающим полезность определения критериальных аФЛ ХЛА и внекритериальных аФЛ, может служить пациентка с достоверным АФС.

Пациентка Б., 36 лет (1986 г. р.), наблюдается в ФГБНУ НИИР им. В.А. Насоновой с 29 лет с достоверным диагнозом АФС. У пациентки в анамнезе острое нарушение мозгового кровообращения по ишемическому типу в бассейне левой средней мозговой артерии, синдромом потери плода (2 выкидыша на сроках более 20 недель гестации). Пациентке неоднократно проводилось определение IgG/IgM аКЛ и IgG/IgM анти-β₂ГП1 методом ИФА, однако их уровни были негативными. Отмечалась изолированная позитивность по ВА (выявлена дважды с интервалом более 12 недель, согласно критериям АФС 2006 г.). В дальнейшем на фоне приема антикоагулянтов определение ВА пациентке не проводилось. При исследовании аФЛ методом ХЛА были отмечены позитивные значения IgG аКЛ - 41,0 CU. Для исключения ложно-позитивных результатов в динамике (через 21 неделю) пациентке было проведено повторное исследование IgG аКЛ, уровни остались позитивными - 40,8 CU.

Таким образом, мониторинг серологических маркеров АФС у данной пациентки возможно методом ХЛА. Исключена изолированная позитивность ВА - с интервалом более чем в 12 недель показано, что значения IgG аКЛ при исследовании ХЛА остаются позитивными.

Предлагаемый способ диагностики АФС во всех случаях оказал положительный диагностический аспект, что говорит о его высокой эффективности.

Изобретение относится к области медицины, а именно к разделу клинической медицины - ревматологии, и может быть использовано для диагностики антифосфолипидного синдрома-АФС у пациентов с тромбозами и/или акушерской патологией. Для этого производят забор венозной крови пациента и определение в образцах крови следующих антифосфолипидов - аФЛ: IgG/IgM аКЛ, IgG/IgM анти-β₂ГП1, ВА, IgA аКЛ, IgA анти-β₂ГП1, IgG анти-β₂ГП1DI, IgG/IgM аФс/Пт. Сначала проводят определение IgG/IgM аКЛ, IgG/IgM анти-β₂ГП1 методом иммуноферментного анализа - ИФА и исследование волчаночного антикоагулянта – ВА. При получении отрицательных значений проводят определение IgG/IgM аКЛ, IgG/IgM- анти-β₂ГП1 методом хемилюминесцентного анализа - ХЛА и при выявлении какого-либо исследуемого аФЛ и подтверждении его позитивности спустя 12 недель ставят диагноз АФС. При отсутствии IgG/IgM аКЛ, IgG/IgM анти-β₂ГП1 проводят определение IgA аКЛ, IgA анти-β₂ГП1, IgG анти-β₂ГП1DI методом ХЛА и IgG/IgM аФс/Пт методом ИФА и при выявлении какого-либо из исследуемых аФЛ и подтверждении позитивности не менее чем через 12 недель ставят диагноз АФС. Изобретение позволяет с высокой долей вероятности верифицировать АФС у больных с тромбозами и/или акушерской патологией. 3 пр., 3 табл., 1 ил.

Способ диагностики антифосфолипидного синдрома - АФС у пациентов с тромбозами и/или акушерской патологией, включающий забор венозной крови пациента и определение в образцах крови следующих антифосфолипидов - аФЛ: IgG/IgM аКЛ, IgG/IgM анти-β₂ГП1, ВА, IgA аКЛ, IgA анти-β₂ГП1, IgG анти-β₂ГП1DI, IgG/IgM аФс/Пт, отличающийся тем, что сначала проводят определение IgG/IgM аКЛ, IgG/IgM анти-β₂ГП1 методом иммуноферментного анализа - ИФА и исследование волчаночного антикоагулянта - ВА, при этом при получении отрицательных значений проводят определение IgG/IgM аКЛ, IgG/IgM- анти-β₂ГП1 методом хемилюминесцентного анализа - ХЛА и при выявлении какого-либо исследуемого аФЛ и подтверждении его позитивности спустя 12 недель ставят диагноз АФС, при отсутствии IgG/IgM аКЛ, IgG/IgM анти-β₂ГП1 проводят определение IgA аКЛ, IgA анти-β₂ГП1, IgG анти-β₂ГП1DI методом ХЛА и IgG/IgM аФс/Пт методом ИФА и при выявлении какого-либо из исследуемых аФЛ и подтверждении позитивности не менее чем через 12 недель ставят диагноз АФС.