СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/32 C12R1/91 

Изобретение относится к области микробиологии, медицины и биотехнологии, а именно, к способам культивирования микроорганизмов.

В связи с широким распространением туберкулеза во всем мире ВОЗ поставило это заболевание в число приоритетных в части совершенствования диагностических средств и способов его лечения. Для изучения возбудителя туберкулеза (бактерий Mycobacterium tuberculosis) необходимо создание более совершенных способов его культивирования, позволяющих поддерживать биологические свойства Mycobacterium tuberculosis в течение нескольких пассажей.

Известен способ культивирования бактерий рода Mycobacterium из патологического материала от больных туберкулезом, заключающийся в использовании яичной среды Левенштейна-Йенсена, поддержании температуры культивирования 37-38^oС и рН 7,0-7,2 (Драбкина P.O. Микробиология туберкулеза. М.: Медгиз, 1963, с. 94-99). Способ позволяет выращивать бактерии на агаризованных средах. В питательных средах необходимо присутствие белкового компонента, глицерина, факторов роста (биотин, никотиновая кислота, рибофловин).

Недостатками данного способа является то, что культивирование идет очень медленно, каждый цикл деления происходит в среднем за 14-18 часов. На агаризованной среде наблюдается рост на 14-40 сутки в виде сухого морщинистого налета кремового цвета. Среда нестабильна по химическому составу из-за присутствия в ней яиц. При длительном культивировании через несколько пересевов (пассажей) изменяются биологические свойства штамма, а также изменяется спектр чувствительности к противотуберкулезным препаратам.

Известен способ культивирования бактерий рода Mycobacterium, заключающийся в использовании жидкой синтетической среды Сотона, поддержании температуры культивирования 37-38^oС и рН 7,0-7,2 (Васильев В.Н. Миобактериозы и микозы легких. София, 1971, с. 156). Основные недостатки данного способа культивирования совпадают с первым способом-аналогом. Культивирование идет очень медленно, каждый цикл деления происходит в среднем за 14-18 часов. При длительном культивировании через несколько пересевов (пассажей) изменяются биологические свойства штамма, а также изменяется спектр чувствительности к противотуберкулезным препаратам.

Известен способ культивирования медленнорастущих микобактерий, включающий выращивание микобактерий на жидкой синтетической питательной среде Сотона с добавлением катодной фракции электрохимически активированной солевой композиции среды Сотона (патент РФ 2106879, МПК⁷ А 61 К 39/04, С 12 N 1/20, опубл. 20.03.98 г.).

Однако при длительном культивировании через несколько пересевов (пассажей) изменяются биологические свойства штамма, а также изменяется спектр чувствительности к противотуберкулезным препаратам.

Наиболее близким аналогом (прототипом) к заявляемому способу является способ культивирования бактерий рода Mycobacterium, заключающийся в использовании жидкой среды Школьникова с добавлением плазмы, снятой с цитратной крови человека, поддержании температуры культивирования 37-38^oС и рН 7,0-7,2 (Справочник фтизиатра под редакцией Н.А.Шмелева, М.: Медицина, 1975, с. 96) или (Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней под редакцией К.И.Матвеевой и М.И.Соколова, М.: Медицина, 1964, - с. 421). Способ позволяет выращивать бактерии суспензионно. В течение выращивания спектр чувствительности к противотуберкулезным препаратам изменяется незначительно.

Основным недостатком способа-прототипа является то, что при длительном культивировании штамма микобактерий через несколько пассажей изменяются его биологические свойства.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является приближение способа культивирования Mycobacterium tuberculosis к естественным условиям, возможность длительного культивирования без потери чувствительности к противотуберкулезным препаратам и без изменения биологических свойств Mycobacterium tuberculosis.

Указанный технический результат достигается тем, что выращивание Mycobacterium tuberculosis осуществляют совместно с культурой клеток млекопитающих до стадии открепления последних от подложки.

Для модели использовались два варианта питательных сред.

В качестве первой жидкой питательной среды для культур клеток млекопитающих используют среду BSK-II. Причем данная жидкая питательная среда для культур клеток млекопитающих содержит общий белок не менее 60 г/л. Динамику роста Mycobacterium tuberculosis в этой системе описывают по отличиям от контрольного флакона с культурой клеток на среде BSK-II.

В качестве второй жидкой питательной среды для культур клеток млекопитающих используют среду Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes. Динамику роста Mycobacterium tuberculosis в этой системе описывают по отличиям от контрольного флакона с культурой клеток на среде Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes.

В качестве культуры клеток млекопитающих используют два варианта линий клеток. Первым вариантом линии клеток является перевиваемая линия клеток VERO. Вторым вариантом линии клеток является перевиваемая культура клеток почки кошки ПК-91.

Использование культуры клеток для совместного выращивания Mycobacterium tuberculosis в питательной среде, например BSK-II, является новым, неизвестным ранее свойством, которое позволяет приблизить Mycobacterium tuberculosis к естественным условиям развития и обеспечивает, по крайней мере, в течение 5 пассажей сохранение без изменения биологических свойств Mycobacterium tuberculosis. При этом не наблюдается какого-либо замутнения среды.

Анализ антибиотикоустойчивости выращиваемого штамма показал сохранение его устойчивости в течение 5 пассажей.

Характерной особенностью культивирования Mycobacterium tuberculosis предлагаемым методом является сохранение времени удвоения клеток при пассировании. Известно, что при выращивании клеток традиционными методами, наблюдается процесс адаптации микобактерий к питательной среде, что выражается в изменении морфологии клеток, уменьшении времени удвоения, но параллельно при этом происходит изменение биологических свойств штамма. Предлагаемый метод не обладает вышеописанными недостатками.

Способ культивирования обеспечивает стабильные скорости роста, морфологические параметры, устойчивость к лекарственным препаратам в течение, по меньшей мере, 5 пассажей.

Перевиваемая линия культуры клеток Vero получена из почки зеленой мартышки (Новые методы культуры животных тканей под редакцией проф. Ю.М.Оленова. - М.: Мир, 1978, с. 116-129).

Перевиваемая линия культуры клеток ПК-91 получена из почки кошки (патент РФ 2121501 от 19.12.94).

Питательная среда для культур клеток BSK II (Каталог фирмы Sigma Chemical Company. -1997, с. 1337) содержит следующие компоненты в 1 литре:
- питательная среда SMRL-1066 до 1 литра;
- желатин 11,4 г;
- неопептон 5,0 г;
- дрожжевой экстракт 2,54 г;
- бычий сывороточный альбумин 50,0 г;
- Hepes 5 г;
- глюкоза 5 г;
- цитрат Na 0,7 г;
- перуват Na 0,8 г;
- N-ацетил-О-глюкозамин 0,4 г;
- бикарбонат Na 2,2 г;
- L-глютамина 0,1 г;
- сыворотка бычья (или кроличья) фетальная 0,08 л;
- рифампицин 0,051 г;
- налидиксовая кислота 0,1 г.

На данный момент известно, что на питательной среде BSK-II культивируют бактерии рода Borrelia при температуре 33^oС и рН 7,0-7,2.

Питательная среда для культур клеток Игла MEM в модификации Дульбеко (Каталог фирмы ISN, biochemicals and reagents catalog, 2002-2003 г., с. 791, 1033220) с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes содержит следующие компоненты в 1 литре:
- питательная среда DMEM (ISN, 2002-2003, 1033220) навеска на 1 литр,
- BSA V фракция (ISN, 2002-2003, 194772 - 2 г,
- Hepes 1 M (ISN, 2002-2003, 1688449) - 15 мл,
- рифампицин 0,051 г.

На данной среде производят культивирование многих перевиваемых и первичных культур клеток.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Подготовка клеток культуры Vero к совместному культивированию
Перевиваемую линию культуры клеток Vero (почка зеленой мартышки) в лаборатории ведут в монослое, на роллерной установке в стеклянных флаконах на ростовой среде Игла MEM с добавлением 5 процентов сыворотки крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем, и 1 процента сыворотки плодов коровы. Кратность рассева: 1:3-1:5. Частота пересевов: по мере образования плотного монослоя, как правило, один раз в 4-5 суток.

В пластиковые флаконы с площадью поверхности 25 см² засевают по 1•10⁶ (0,04•10⁶ кл/см²) клеток на указанной ростовой среде в объеме 10 мл. Флаконы помещают в термостат при 37±0,5^oC. Через двое суток при плотности монослоя клеток 10⁵ кл/см² ростовую среду сливают и заливают среду BSK-II в объеме 10 мл или среду Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes в объеме 10 мл. Флаконы помещают в термостат при 37±0,5^oC. Визуальный осмотр культуры клеток Vero проводят ежедневно с использованием инвертируемого микроскопа. Плотный монослой клеток при использовании среды BSK-II сохраняется до 30 суток. Плотный монослой клеток при использовании среды Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes сохраняется до 18 суток
Подготовка клеток культуры ПК-91 к совместному культивированию
Перевиваемую линию культуры клеток ПК-91 (почка кошки) в лаборатории ведут в монослое, на роллерной установке в стеклянных флаконах на ростовой среде Игла MEM с добавлением 5 процентов сыворотки крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем, и 1 процента сыворотки плодов коровы. Кратность рассева: 1:4-1:7. Частота пересевов: по мере образования плотного монослоя, как правило, один раз в 5-6 суток.

В пластиковые флаконы с площадью поверхности 25 см² засевают по 1•10⁶ (0,04•10⁶ кл/см²) клеток на указанной ростовой среде в объеме 10 мл. Флаконы помещают в термостат при 37±0,5^oC. Через двое суток при плотности монослоя клеток 10⁵ кл/см² ростовую среду сливают и заливают среду BSK-II в объеме 10 мл или среду Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes в объеме 10 мл. Флаконы помещают в термостат при 37±0,5^oC. Визуальный осмотр культуры клеток ПК-91 проводят ежедневно с использованием инвертируемого микроскопа. Плотный монослой клеток при использовании среды BSK-II сохраняется до 21 суток. Плотный монослой клеток при использовании среды Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes сохраняется до 14 суток
Изоляты Mycobacterium tuberculosis для экспериментальных исследований.

Изолят 542 получен из Муниципального специализированного объединения "ФТИЗИАТРИЯ" 1, выделен из мокроты больного, диагноз: инфильтративная форма туберкулеза легких, 07.10.99 г., посевом на среду Левенштейна-Иенсена и ФИНН-2. Скорость роста - 48 дней. Лекарственная устойчивость - резистентен к рифампицину и стрептомицину. На плотных питательных средах образует отдельные мелкие колонии желтоватого цвета, плохо снимающиеся с поверхности среды.

Изолят 569 получен из Муниципального специализированного объединения "ФТИЗИАТРИЯ" 1, выделен из мокроты больного, диагноз: инфильтративная форма туберкулеза легких, 04.10.99 г., посевом на среду Левенштейна-Иенсена и ФИНН-2. Скорость роста - 28 дней. Лекарственная устойчивость - резистентен к рифампицину и стрептомицину. На плотных питательных средах обильный рост в виде мелких колоний желтоватого цвета, плохо снимающихся с поверхности среды.

Оба изолята при пересеве их с плотной питательной среды (ФИНН-2) на жидкую питательную среду (Сотона) вели себя одинаково: через 10 дней после посева на пробирку отмечалось начало роста, интенсивность которого медленно нарастала и через один месяц островки роста на поверхности среды сливались в морщинистую пленку, при встряхивании разбивающуюся на хлопья, опускающиеся на дно пробирки.

Для экспериментальных исследований использовали одномесячную взвесь Mycobacterium tuberculosis в среде Сотона.

Производственный штамм BCG:
Ампулы, г. Ташкент, вакцина БЦЖ, С527 KN 871.

Пример 2. Культивирование Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) с использованием ростовой среды BSK-II и культуры клеток Vero
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см² с двухсуточным монослоем культуры клеток Vero проводят смену среды: ростовой на BSK-II. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток Vero на среде BSK-II (10 мл). В два других флакона с культурой клеток Vero на среде BSK-II (10 мл) вносят в среду 0,2 мл культуры Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).

Далее проводят ежедневный визуальный просмотр (инвертированный микроскоп "Olimpus", увеличение 5•12,5; 10•12,5; 20•12,5) в сравнении с контрольным флаконом культуры клеток Vero. Динамика роста Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) в этой системе будет описываться только по отличиям от контрольного флакона с культурой клеток Vеrо на среде BSK-II.

В первую неделю изменений не наблюдается.

К 7 суткам на части клеток в монослое обнаруживаются темные шероховатые пятна. При увеличении 20•12,5 они идентифицировались как темные нитчатые образования, связанные плотно с поверхностью этих клеток. Такие зоны обнаруживают по всей площади монослоя (25 см²) от 10 до 20, по размерам не более 30-50 клеток.

К 14 суткам эти темные образования увеличиваются, приобретают шаровидную форму и выступают над поверхностью монослоя клеток, оставаясь прикрепленными к монослою.

К 21 суткам наблюдается смешанная картина:
- часть темных образований шаровидной формы открепилась от монослоя клеток и находилась в питательной среде во взвешенном состоянии;
- мелкие шаровидные формы, связанные с монослоем клеток;
- множество отдельных темных образований.

К 28 суткам большое количество темных шаровидных образований взвешенно в среде. 40% монослоя клеток разрушено. При увеличении от 20•12,5 эти образования выглядят как конгломераты клеток Vero, плотно скрепленные с нитчатыми образованиями. Края этих образований выглядят неровно. Размеры этих 200-400 мкм.

На этой стадии культивирование прекращают, собирают из флаконов среду, диспергируют встряхиванием и пересевают по 0,2 мл смеси Mycobacterium tuberculosis с клеточным детритом в подготовленные флаконы с новой культурой клеток Vero на среде BSK-II. Два флакона содержат монослой клеток Vero с Mycobacterium tuberculosis и один флакон контрольный с чистым монослоем клеток Vero.

Таким образом, было проведено 5 последовательных пассажей Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) на культуре клеток Vero с использованием среды BSK-II. Визуальная картина и сроки роста (±2 суток) сохранялись в течение всех пяти пассажей. Среда во флаконах с культурой клеток Vero (контрольном и инфицированных) всегда оставалась прозрачной.

Пример 3. Культивирование Mycobacterium tuberculosis (изолят 569) с использованием ростовой среды BSK-II и культуры клеток Vero
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см² с двухсуточным монослоем культуры клеток Vero проводят смену среды: ростовой на BSK-II. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток Vero на среде BSK-II (10 мл). Два других флакона культуры клеток Vero на среде BSK-II (10 мл) инфицируют, внося в среду 0,2 мл культуры Mycobacterium tuberculosis (изолят 569) и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).

Проводят ежедневный визуальный просмотр (инвертированный микроскоп "Olimpus", увеличение 5•12,5; 10•12,5; 20•12,5), в сравнении с контрольным флаконом культуры клеток Vero.

В первую неделю изменений не наблюдается.

К 7 суткам на части клеток в монослое обнаруживаются темные шероховатые пятна. При увеличении 20•12,5 они идентифицируются как темные нитчатые образования, связанные плотно с поверхностью клеток. Такие зоны обнаруживют по всей площади монослоя (25 см²) от 15 до 30, по размерам не более 30-50 клеток.

К 14 суткам эти темные образования увеличиваются, приобретают шаровидную форму и выступают над поверхностью монослоя клеток, оставаясь прикрепленными к монослою.

К 21 суткам наблюдается смешанная картина:
- часть темных образований шаровидной, вытянутой, эллипсовидной и неправильной формы открепилась от монослоя клеток и находилась в питательной среде во взвешенном состоянии;
- мелкие и другие более крупные формы, связанные с монослоем клеток;
- множество отдельных темных образований.

К 28 суткам большое количество темных образований разных форм и размеров взвешенно в среде. 100% разрушение монослоя клеток. При увеличении от 20х12,5 эти образования выглядят как конгломераты клеток Vero, плотно скрепленные с нитчатыми образованиями. Края этих образований выглядят неровно ("мохнатые"). Размеры этих образований от 100 до 800 мкм.

На этой стадии культивирование прекращают. Собирают из флаконов среду, диспергируют встряхиванием и пересевают по 0,2 мл в подготовленные флаконы с культурой клеток Vero на среде BSK-II. Два флакона инфицируют и один флакон контрольный.

Таким образом проводят 5 последовательных пассажей Mycobacterium tuberculosis (изолят 569) на культуре клеток Vero с использованием среды BSK-II. Визуальная картина и сроки роста (±2 суток) сохраняются в течение всех пяти пассажей. Среда во флаконах с культурой клеток Vero (контрольном и инфицированных) остается прозрачной.

Пример 4. Культивирование BCG с использованием ростовой среды BSK-II и культуры клеток Vero
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см² с двухсуточным монослоем культуры клеток Vero проводят смену среды: ростовой на BSK-II. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток Vero на среде BSK-II (10 мл). Два других флакона культуры клеток Vero на среде BSK-II (10 мл) инфицируют, внося в среду 0,2 мл культуры BCG и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).

Проводится ежедневный визуальный просмотр (инвертированный микроскоп "Olimpus", увеличение 5•12,5; 10•12,5; 20•12,5) в сравнении с контрольным флаконом культуры клеток Vero.

В первую неделю изменений не наблюдается.

К 7-8 суткам на части клеток в монослое обнаруживают темные шероховатые пятна. При увеличении 20•12,5 они идентифицируются как темные нитчатые образования, связанные плотно с поверхностью клеток. Такие зоны обнаруживают по всей площади монослоя (25 см²) около 10, по размерам не более 5-10 клеток.

До 10 суток наблюдают положительную динамику увеличения этих темных образований.

К 14 суткам происходит полная элиминация этих образований, и они больше не определяются.

К 28 суткам инфицированные флаконы ничем не отличалются от контрольного.

Провели еще трижды опыт с инфицированием BCG. Картина полностью повторилась.

Таким образом, из приведенных выше примеров видно, что данная система позволяет визуально различать разные изоляты Mycobacterium tuberculosis (пример 2 и пример 3) по характеру роста и по разрушающему действию на монослой культуры клеток, начиная с первого пассажа. Данные изменения сохраняются, по крайней мере, на протяжении пяти последовательных пассажей. Клетки микобактерий сохраняли свои морфологические характеристики, что подтверждает неизменность биологических свойств Mycobacterium tuberculosis и устойчивость к противотуберкулезным препаратам.

Пример 5. Культивирование Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) с использованием ростовой среды Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes и культуры клеток Vero
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см² с двухсуточным монослоем культуры клеток Vero проводят смену среды: ростовой на Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток Vero на среде Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes (10 мл). Два других флакона культуры клеток Vero на среде Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes (10 мл) инфицируют, внося в среду 0,2 мл культуры Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).

Проводят ежедневный визуальный просмотр (инвертированный микроскоп "Olimpus", увеличение 5•12,5; 10•12,5; 20•12,5) в сравнении с контрольным флаконом культуры клеток Vero.

К 3 суткам на части клеток в монослое обнаруживаются темные шероховатые пятна. При увеличении 20•12,5 они идентифицируются как темные нитчатые образования, связанные плотно с поверхностью клеток. Такие зоны обнаруживают по всей площади монослоя (25 см²) от 15 до 30, по размерам не более 30-50 клеток.

К 5 суткам эти темные образования увеличиваются, приобретают шаровидную форму и выступают над поверхностью монослоя клеток, оставаясь прикрепленными к монослою.

К 7 суткам наблюдается смешанная картина:
- часть темных образований шаровидной и неправильной формы открепилась от монослоя клеток и находилась в питательной среде во взвешенном состоянии;
- мелкие и другие более крупные формы, связанные с монослоем клеток;
- множество отдельных темных образований.

К 10 суткам большое количество темных образований разных форм и размеров взвешенно в среде. 100% разрушение монослоя клеток. При увеличении от 20•12,5 эти образования выглядят как конгломераты клеток Vero, плотно скрепленные с нитчатыми образованиями. Края этих образований выглядят неровно ("мохнатые"). Размеры этих образований около 100 мкм.

На этой стадии культивирование прекращают. Среда во флаконах с культурой клеток Vero (контрольном и инфицированных) остается прозрачной.

Пример 6. Культивирование Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) с использованием ростовой среды BSK-II и культуры клеток ПК-91
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см² с двухсуточным монослоем культуры клеток ПК-91 проводят смену среды: ростовой на BSK-II. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток ПК-91 на среде BSK-II (10 мл). Два других флакона культуры клеток ПК-91 на среде BSK-II (10 мл) инфицируют, внося в среду 0,2 мл культуры Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).

Проводят ежедневный визуальный просмотр (инвертированный микроскоп "Olimpus", увеличение 5•12,5; 10•12,5; 20•12,5) в сравнении с контрольным флаконом культуры клеток ПК-91.

В первую неделю изменений не наблюдается.

К 7 суткам на части клеток в монослое обнаруживаются темные шероховатые пятна. При увеличении 20х12,5 они идентифицируются как темные нитчатые образования, связанные плотно с поверхностью клеток. Такие зоны обнаруживют по всей площади монослоя (25 см²) от 15 до 30, по размерам не более 30-50 клеток.

К 14 суткам эти темные образования увеличиваются, приобретают шаровидную форму и выступают над поверхностью монослоя клеток, оставаясь прикрепленными к монослою.

К 21 суткам наблюдается смешанная картина:
- часть темных образований шаровидной и неправильной формы открепилась от монослоя клеток и находилась в питательной среде во взвешенном состоянии;
- мелкие и другие более крупные формы, связанные с монослоем клеток;
- множество отдельных темных образований.

К 28 суткам большое количество темных образований разных форм и размеров взвешенно в среде. 100% разрушение монослоя клеток. При увеличении от 20•12,5 эти образования выглядят как конгломераты клеток Vero, плотно скрепленные с нитчатыми образованиями. Края этих образований выглядят неровно ("мохнатые"). Размеры этих образований от 200 до 400 мкм.

На этой стадии культивирование прекращают. Среда во флаконах с культурой клеток ПК-91 (контрольном и инфицированных) остается прозрачной.

Пример 7. Культивирование Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) с использованием ростовой среды Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes и культуры клеток ПК-91
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см² с двухсуточным монослоем культуры клеток ПК-91 проводят смену среды: ростовой на Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток ПК-91 на среде Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes (10 мл). Два других флакона культуры клеток ПК-91 на среде Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes (10 мл) инфицируют, внося в среду 0,2 мл культуры Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).

Проводят ежедневный визуальный просмотр (инвертированный микроскоп "Olimpus", увеличение 5•12,5; 10•12,5; 20•12,5) в сравнении с контрольным флаконом культуры клеток ПК-91.

К 3 суткам на части клеток в монослое обнаруживаются темные шероховатые пятна. При увеличении 20х12,5 они идентифицируются как темные нитчатые образования, связанные плотно с поверхностью клеток. Такие зоны обнаруживют по всей площади монослоя (25 см²) от 15 до 30, по размерам не более 30-50 клеток.

К 5 суткам эти темные образования увеличиваются, приобретают шаровидную форму и выступают над поверхностью монослоя клеток, оставаясь прикрепленными к монослою.

К 7 суткам наблюдается смешанная картина:
- часть темных образований шаровидной и неправильной формы открепилась от монослоя клеток и находилась в питательной среде во взвешенном состоянии;
- мелкие и другие более крупные формы, связанные с монослоем клеток;
- множество отдельных темных образований.

К 10 суткам большое количество темных образований разных форм и размеров взвешенно в среде. 100% разрушение монослоя клеток. При увеличении от 20•12,5 эти образования выглядят как конгломераты клеток Vero, плотно скрепленные с нитчатыми образованиями. Края этих образований выглядят неровно ("мохнатые"). Размеры этих образований около 100 мкм.

На этой стадии культивирование прекращают. Среда во флаконах с культурой клеток ПК-91 (контрольном и инфицированных) остается прозрачной.

Таким образом, из приведенных выше примеров видно, что при замене перевиваемой культуры клеток линии Vero на перевиваемую культуру клеток линии ПК-91 в данной системе культивирования при использовании ростовой среды BSK-II не наблюдается существенных различий в характере роста Mycobacterium tuberculosis (пример 2 и пример 6).

Из приведенных выше примеров видно, что при замене ростовой среды BSK-II на ростовую среду Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes меняются только сроки роста Mycobacterium tuberculosis, но характеристика роста Mycobacterium tuberculosis остается неизменной.

При использовании предлагаемого метода культивирования наблюдается несколько фаз в процессе роста микобактерий туберкулеза, которые являются общими и не зависят от используемой ростовой среды и перевиваемой культуры клеток.

Обязательно присутствует фаза прикрепления микобактерий туберкулеза к клеткам монослоя. Второй фазой является фаза роста микобактерий на клеточном субстрате с видимым увеличением биомассы. Третья фаза - смешанная, когда присутствуют элементы, растущие на субстрате и во взвешенном состоянии. Четвертая фаза - разрушение монослоя и продолжение роста во взвешенном состоянии.

При использовании разных ростовых сред наблюдается только изменение сроков роста и размеров конгломератов, но количество и порядок перечисленных фаз остается неизменным.

Изобретение относится к области микробиологии, медицины и биотехнологии. Способ включает введение Mycobacterium tuberculosis в жидкую питательную среду и выращивание на указанной питательной среде. В качестве питательной среды используют жидкую питательную среду для культур клеток млекопитающих с монослоем этих культур клеток на подложке в концентрации не менее 10⁵ кл/см², а выращивание Mycobacterium tuberculosis осуществляют совместно с культурой клеток млекопитающих до стадии открепления последних от подложки. Причем жидкая питательная среда для культур клеток млекопитающих содержит общий белок не менее 60 г/л. В качестве культуры клеток млекопитающих используют перевиваемую линию клеток VERO. В качестве жидкой питательной среды для культур клеток млекопитающих используют среду BSK-II. Способ культивирования приближен к естественным условиям, что обеспечивает возможность длительного культивирования без потери чувствительности к противотуберкулезным препаратам и без изменения биологических свойств. 3 з.п. ф-лы.

1. Способ культивирования микроорганизмов Mycobacterium tuberculosis, включающий введение посевной дозы Mycobacterium tuberculosis в жидкую питательную среду и выращивание их на указанной питательной среде, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют жидкую питательную среду для культур клеток млекопитающих с монослоем этих культур клеток на подложке в концентрации не менее 10⁵ кл/см², а выращивание Mycobacterium tuberculosis осуществляют совместно с культурой клеток млекопитающих до стадии открепления последних от подложки. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что жидкая питательная среда для культур клеток млекопитающих содержит общий белок не менее 60 г/л. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток млекопитающих используют перевиваемую линию клеток VERO. 4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что в качестве жидкой питательной среды для культур клеток млекопитающих используют среду BSK-II.