СПОСОБ ПРЕПАРАТИВНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИИ ЛИПОПРОТЕИНОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ ИЗ ПЛАЗМЫ ИЛИ СЫВОРОТКИ КРОВИ Российский патент 2003 года по МПК A61K35/14 

Изобретение относится к методам препаративного выделения белковых фракций, в частности липопротеинов высокой плотности, из плазмы или сыворотки крови и может быть использовано в медицине для определения фракционно-компонентного состава липопротеинов при диагностике дислипопротеинемий и для других научных и технологических целей.

Основными маркерами при диагностике нарушений липидного обмена используют суммарный холестерин, триглицериды, холестерин фракции липопротеинов (ЛП) высокой плотности (ЛПВП) и апо-белки ЛП. Однако известно, что сывороточные ЛП крови имеют очень высокую полидисперсность: частицы ЛПВП меньше по размеру липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в 3-4 раза, а липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) - меньше в 10-12 раз, а их функции существенно отличаются. Кроме того, отдельные фракции ЛП также обладают полидисперсностью и их субфракционный состав также отражает специфику липидного обмена в организме. Поэтому анализ отдельных фракций, в частности ЛПВП, а не одновременно всех фракций ЛП, может существенно повысить информативность анализа фракционно-компонентного состава (ФКС) ЛП различными аналитическими методами и, в частности, методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) [1].

В настоящее время наиболее широко распространены три основных способа выделения и очистки липопротеинов отдельных классов сыворотки крови в препаративных количествах: ультрацентрифугирование в солевых растворах, хроматография и осаждение. Электрофорез используется в основном в аналитических целях.

Известно использование ультрацентрифугирования (аналог 2) для выделения и очистки белков. ЛП данным методом можно разделить в соответствии с различиями в их гидратированной плотности. Наиболее широко используется последовательное (серийное) центрифугирование при различных плотностях водного растворителя. Метод основан на процедуре, предложенной Хавелом и соавт. [2], и детально разработан Лингреном [3]. Принцип метода состоит в том, что гидратированная плотность плазмы или сыворотки крови доводится до нижнего предела плотности фракции, которую необходимо выделить, и затем проба центрифугируется при 100000g несколько часов. ЛП, имеющие плотность, меньшую плотности растворителя, флотируют (всплывают) к верхней части пробирки, а другие седиментируют на дно. Осадки встряхивают и их гидратированную плотность доводят до верхнего предела следующей требуемой плотности ЛП фракции. Центрифугирование повторяют вплоть до выделения необходимой фракции в верхней части пробирки (в супернатанте). Фракция ЛПВП выделяется после предварительного отделения фракций ЛПОНП и ЛПНП, и для ее выделения требуется проводить центрифугирование в течение не менее 24-36 часов при скорости ротора 40000-100000g. К достоинствам центрифугирования следует отнести то, что этот способ обладает значительной гибкостью, т.к. дает возможность изолировать и выделить почти любое требуемое количество фракций, которые можно охарактеризовать в пределах двух интервалов плотности водного растворителя. В целом этот способ характеризуется высокой точностью и воспроизводимостью.

К недостаткам центрифугирования относятся необходимость использования (для обеспечения заданной плотности растворителя) таких солей, как NaCl, CsCl, KBr или NaBr и проведение специальных процедур для их последующего удаления из готовых растворов фракций ЛП с помощью диализа. Кроме того, необходимо использовать высокоскоростные, термостатированные и дорогостоящие ультрацентрифуги типа Beckman (США), а время выделения, например, фракции ЛПВП составляет более 36 часов.

Известен другой метод очистки белков - метод хроматографии (аналог 1) [4] . Его обычно применяют для разделения и очистки всех или отдельных фракций ЛП, полученных другими методами, в частности ультрацентрифугированием либо осаждением. Используется в основном адсорбционная, ионообменная, аффинная и гель-фильтрационная хроматография. Сущность этого способа заключается в пропускании исходной плазмы или сыворотки крови через колонку, наполненную специальным адсорбентом или гелем, по-разному взаимодействующим с разделяемыми белками. В результате прохождения раствора через такую колонку из-за разных скоростей движения фракции молекул выходят не одновременно, а друг за другом, и их можно отбирать в отдельные пробирки. Достоинством этого способа является относительная простота реализации и использование недорогостоящего оборудования.

К недостаткам этого метода следует отнести трудность отделения ЛП от других белков сыворотки крови, длительность процесса и большое разведение выделенных фракций ЛП.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ химического осаждения белков [5], основанный на том, что такие анионы, как сульфированные полисахариды (гепарин, декстрансульфат и др.) в комбинации с некоторыми двухвалентными катионами (Мn²⁺, Со²⁺, Mg²⁺ , Са²⁺ и др.) способны осаждать ЛП при значениях рН, близких к 7, образуя их растворимые комплексы. Сущность этого способа заключается в добавлении к плазме или сыворотке крови растворов гепарина и солей типа MnCl₂ при определенных их концентрациях. Далее эти смеси встряхивают и центрифугируют при 6000g. Фракции ЛПОНП и ЛПНП при этом выпадают в осадок, а надосадочную жидкость, содержащую фракцию ЛПВП, очищают путем диализа против нескольких порций нейтрального буфера в течение 48 часов. К достоинствам этого способа относится простота и доступность реализации и использование только низкоскоростного центрифугирования.

Однако у методов химического осаждения имеются и ряд недостатков:
1) сывороточные белки остаются как в осажденных ЛП (преципитате), так и в надосадочной жидкости;
2) трудность и длительность удаления преципитирующих агентов;
3) нарушение нативности ЛП частиц.

Таким образом, известные методы (аналоги и прототип) выделения фракции ЛП из образцов сывороток крови трудоемки, длительны, требуют использования дорогостоящего оборудования, а также использования химически активных реактивов, что загрязняет конечную препаративную форму и отрицательно сказывается на целостности структур ЛП и искажает результаты анализов ФКС ЛП.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка такого способа препаративного выделения липопротеинов высокой плотности из плазмы или сыворотки крови, который позволил бы устранить недостатки известных аналогов и прототипа.

Указанная задача решается тем, что в способе препаративного выделения фракции липопротеинов высокой плотности из плазмы или сыворотки крови, включающем подготовку образцов плазмы или сыворотки крови, воздействие на них фактором, приводящим к разделению липопротеинов на фракции с последующим низкоскоростным центрифугированием образцов плазмы или сыворотки и отбором целевой надосадочной фракции липопротеинов высокой плотности, согласно изобретению в качестве воздействующего фактора используют нагревание образцов плазмы или сыворотки крови при температуре +70-100^oС в течение времени, достаточного для приобретения образцами молочного цвета и образования белкового геля, причем перед низкоскоростным центрифугированием белковый гель плазмы или сыворотки крови измельчают.

Наиболее оптимальный результат достигается, когда образцы плазмы или сыворотки крови нагревают при температуре 80-90^oС в течение 2-10 минут.

Причем большим температурам соответствуют меньшие времена прогрева образцов плазмы или сыворотки крови.

В основе разработки нового способа выделения фракции ЛПВП из цельных сывороток крови использовался только физический фактор воздействия на сыворотки, а именно воздействие на плазму или сыворотку крови повышенной температуры. Известно, что при температурах выше 60^oС все простые белки денатурируются, а при 70^oС и выше образуют плотный гель. Термическое воздействие на сыворотку крови приводит к тому, что сывороточные белки переходят в нерастворимое состояние, в котором их можно измельчить и осадить на низкоскоростной центрифуге. Но оказалось, что после такой процедуры в надосадочной жидкости остается одна из фракций ЛП, а именно ЛПВП. Этот эффект был проверен многократно на разных образцах плазм и сывороток крови методом МУРР и подтвержден в параллельных анализах методом электрофореза в Институте биохимии СО РАМН. Термофильность ЛПВП связана, по-видимому, с защитной ролью липидных компонентов по отношению к апо-белкам ЛП - самому уязвимому к воздействию повышенной температуры компоненту ЛП. Именно эти термофильные свойства частиц ЛПВП и были использованы при разработке нового препаративного способа выделения этой фракции ЛП из плазм и сывороток крови без использования химических реактивов. При разработке нового способа оптимизированы значения температуры и времени воздействия на образцы сывороток крови с целью полного выделения частиц ЛПВП без примесей других фракций ЛП, проведены сравнительные анализы по определению ФКС ЛП в исходных сыворотках и в образцах, выделяемых предлагаемым способом и способом-прототипом с целью получения оценок определения чистоты и полноты выделения фракции ЛПВП. Кроме того, получены оценки изменений в структурах и субфракционном составе ЛПВП после процедур осаждения и термического воздействия, а также сохранения их функциональных свойств.

На фиг. 1 приведены диаграммы фракционного состава ЛП от исходного образца плазмы крови (а), от выделенной способом-прототипом (б) и предлагаемым способом (в) фракции ЛПВП из того же исходного образца. На фиг.2 приведены диаграммы фракционного состава ЛП от исходного образца сыворотки крови (а), от выделенной способом-прототипом (б) и новым способом фракции ЛПВП (в) из того же исходного образца.

Пример 1. Технология препаративного выделения фракции лидопротеинов высокой плотности из плазмы крови.

Использовали образец плазмы крови здорового человека в объеме 0,5 мл. Пациент: женщина, 36 лет, общий холестерин - 178,0 мг/дл, холестерин ЛПВП - 58,4 мг/дл, общие триглицериды - 122,2 мг/дл.

Образец помещали в стандартную пробирку диаметром 5 мм и длиной 50 мм. Пробирку с образцом плазмы крови помещали вертикально в сосуд с водой, предварительно прогретой до 90^oС, погрузив в воду до верхнего уровня жидкости образца в пробирке. Прогрев проводили в течение 5 минут, в результате чего жидкость в пробирке приобрела молочный цвет, после чего пробирку вынимали из сосуда с водой и после охлаждения в течение 1 минуты при комнатной температуре разрушали образовавшийся жесткий белковый гель с помощью узкого шпателя. Далее пробирку помещали в низкоскоростную центрифугу Т-51 (Германия) и центрифугировали в течение 3 минут при 5000g. Надосадочную жидкость (целевой продукт, содержащий фракцию частиц ЛПВП), образовавшуюся в результате центрифугирования, отбирали в отдельную пробирку и проводили ее анализ по определению ФКС ЛП с помощью метода МУРР [1]. Общее время препаративного выделения фракции липопротеинов высокой плотности из плазмы крови предлагаемым способом составило 9 минут.

Для получения оценки эффективности нового способа проводили выделение фракции ЛПВП от того же образца способом-прототипом [5], используя осаждение фракций ЛПНП и ЛПОНП гепарином и MnCl₂. Для проведения процедур осаждения использовали 0,5 мл от того же образца плазмы крови.

Из диаграммы, приведенной на фиг.1а, в, видно, что фракция ЛПВП полностью соответствует исходному спектру ЛПВП (эффективность выделения - 97,8%), а другие ЛП практически отсутствуют, т.к. их доля составляет менее 1%. Как видно из фиг. 1б, ФКС ЛП от образца, приготовленного способом-прототипом, также почти не содержит других ЛП, кроме ЛПВП, и хотя количественно ЛПВП почти соответствуют исходной плазме крови (эффективность выделения - 95,3%), но субфракционный спектр ЛПВП существенно отличается от спектра исходной плазмы.

Пример 2. Технология препаративного выделения фракции липопротеинов высокой плотности из сыворотки крови.

Использовали образец сыворотки крови здорового человека в объеме 0,5 мл. Пациент: мужчина, 49 лет, общий холестерин - 169,0 мг/дл, холестерин ЛПВП - 51,9 мг/дл, общие триглицериды - 129,5 мг/дл.

Процедура всех операций по выделению фракции ЛПВП из образца сыворотки крови предлагаемым способом и способом-прототипом, а также анализ ФКС ЛП полностью соответствовал примеру 1, только использовали образец крови другого человека и вместо плазмы - сыворотку. Общее время препаративного выделения предлагаемым способом фракции ЛПВП из образца сыворотки крови составило 8 минут.

Из диаграммы, приведенной на фиг.2а, в, как и примере 1, видно, что фракция ЛПВП хорошо соответствует исходному спектру ЛПВП (эффективность выделения - 97,2%), а другие ЛП практически отсутствуют. ФКС ЛП (фиг.26) от образца, приготовленного способом-прототипом, также почти не содержит других ЛП, кроме ЛПВП (эффективность выделения - 94,1%), но субфракционный спектр ЛПВП как и в примере 1 также существенно отличается от спектра ЛПВП исходной сыворотки.

Эффекты смещения спектров субфракций ЛПВП от образцов, выделенных методом-прототипом, можно объяснить тем, что в результате взаимодействия частиц ЛПВП с MnCl₂ происходит изменение их размеров в сторону увеличения примерно на 10-15% [5].

В предварительных опытах с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) было показано, что выделенные предлагаемым способом ЛПВП "узнаются" антителами к апо-А1 практически так же, как ЛПВП исходной плазмы, а выделенные способом-прототипом ЛПВП "узнавались" антителами только после предварительного диализа надосадочной жидкости против буфера, не содержащего МnСl₂ и гепарина. Это указывает на сохранение функциональных свойств частиц ЛПВП после процедур выделения предлагаемым способом.

Таким образом, в примерах 1-2 показана высокая чистота и эффективность предлагаемого способа выделения фракции ЛПВП из образцов плазмы и сыворотки крови. Общее время процедуры выделения ЛПВП предлагаемым способом в 4-5 раз меньше, чем у способа-прототипа (без учета процедур диализа и гель-фильтрации), при этом не используются химические реагенты типа MnCl₂ и гепарина, а выделенная фракция ЛПВП абсолютно не содержит сывороточных белков-глобулинов и почти не содержит других ЛП, кроме частиц ЛПВП. При учете же процедур диализа и гель-фильтрации (для удаления МnСl₂ и гепарина) в способе-прототипе общее временя выделения ЛПВП предлагаемым способом в 200 раз меньше, чем у прототипа.

В результате экспериментальных исследований получены оптимальные значения температур (70-95^oС) и времени термического воздействия (1-5 минут) - до появления визуальных признаков (молочный цвет) денатурации белков на образцы плазм и сывороток крови заданного объема, при которых фракция ЛПВП выделяется полностью и без примесей сывороточных глобулинов и других ЛП (см. таблицу). Отработаны все основные этапы выделения ЛПВП, включая процедуры прогрева сыворотки, измельчения геля, центрифугирования и отбора очищенной фракции ЛПВП.

Сравнительные анализы ФКС ЛП методом МУРР показали, что субфракционный состав ЛПВП после термического воздействия остается почти без изменений в отличие от химического осаждения, после которого происходят существенные изменения в размерах ЛП в сторону их повышения (на 10-15%). Это связано, по-видимому, с большим денатурирующим воздействием солей Mn на нативные структуры ЛП, чем в случае кратковременного воздействия на них повышенной температуры. Общее время выделения новым способом ЛПВП из плазм и сывороток крови не превышает 10 минут, что существенно быстрее, чем выделение методом осаждения. Выделенная предлагаемым способом фракция ЛПВП абсолютно не содержит других сывороточных белков, кроме следового количества фракции ЛПНП (менее 1%). Определение ФКС в ЛПВП и в цельных сыворотках крови проводилось методом МУРР.

Источники информации
1. Патент РФ 2099693, МПК G 01 N 21/20, опубл. 1995 г.

2. Havel R. J., Eder H., Bragdon J. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. //J. Clin. Invest. 1955. V.34. 7. P.1345-1353.

3. Lindgren F.T. Analysis of lipids and lipoproteins (Perkins E.G., ed. ). //American oil Chemists Soc., Champaign, SL., USA. 1975. P.204-223.

4. Холодова Ю. Д., Чаяло П.П. Липопротеины крови. Киев: Наукова думка. 1990. С. 26-33.

5. Холодова Ю. Д., Чаяло П.П. Липопротеины крови. Киев: Наукова думка. 1990. С. 22-26.

Изобретение относится к медицине, точнее к методам препаративного выделения белковых фракций, в частности липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), из плазмы или сыворотки крови, и может быть использовано для определения фракционно-компонентного состава (ФКС) липопротеинов (ЛП) при диагностике дислипопротеинемий. Образцы плазмы или сыворотки крови нагревают при температуре 70-100^oС в течение времени, достаточного для приобретения образцами молочного цвета, образовавшийся белковый гель измельчают, центрифугируют и отбирают надосадочную фракцию, содержащую фракцию частиц ЛПВП. Наиболее оптимальный результат достигается, если образцы плазмы или сыворотки крови нагревают при температуре 80-90^oС в течение 2-10 мин. Технический результат: способ обеспечивает снижение трудоемкости и длительности процесса, не требует использования дорогостоящего оборудования и химически активных реактивов, не загрязняет конечную препаративную форму, не нарушает нативности частиц ЛПВП и не искажает результаты анализов ФСК ЛП. 3 з.п.ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ препаративного выделения фракции липопротеинов высокой плотности из плазмы или сыворотки крови, включающий подготовку образцов плазмы или сыворотки крови, воздействие на них фактором, приводящим к разделению липопротеинов на фракции с последующим низкоскоростным центрифугированием образцов плазмы или сыворотки и отбором целевой надосадочной фракции липопротеинов высокой плотности, отличающийся тем, что в качестве воздействующего фактора используют нагревание образцов плазмы или сыворотки крови при температуре 70-100^oС в течение времени, достаточного для приобретения образцами молочного цвета и образования белкового геля, причем перед низкоскоростным центрифугированием белковый гель плазмы или сыворотки крови измельчают. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образцы плазмы или сыворотки крови нагревают при температуре 80-90^oС. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образцы плазмы или сыворотки крови нагревают в течение 2-10 мин. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что большим температурам, указанным в п. 2 диапазоне, соответствуют меньшие времена прогрева, указанным в п. 3 диапазоне, образцов плазмы или сыворотки крови.