(-) ШТАММ ГЕТЕРОТАЛЛИЧНОГО ФИКОМИЦЕТА Blakeslea trispora, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЛИКОПИН В ПАРЕ С РАЗНЫМИ (+)ШТАММАМИ Blakeslea trispora, И СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ЛИКОПИНА Российский патент 2003 года по МПК C12P23/00 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к биотехнологии и касается микробиологического синтеза ликопина. Ликопин относится к группе каротиноидов и является непосредственным предшественником в цепи биосинтеза бета-каротина. Как природный краситель каротинового ряда ликопин находит применение в пищевой и косметической промышленности, а также в различных областях медицины (1, 2).

Промышленное получение ликопина осуществляют либо из растений (чаще всего томатов) (3), либо путем микробиологического синтеза на основе каротинобразующих штаммов микроорганизмов, чаще всего (-) и (+) штаммов гетероталличного фикомицета Blakeslea trispora (4-9).

Известные способы микробиологического синтеза ликопина характеризуются двумя общими признаками:
- использованием (-) и (+) штаммов Blakeslea trispora, способных при совместном культивировании в определенных условиях синтезировать в качестве основного продукта бета-каротин и
- использованием при их культивировании дополнительных условий или добавок, инактивирующих или блокирующих фермент конечного этапа пути биосинтза бета-каротина - ликопинциклазу (4-9), катализирующую образование бета-каротина из его природного предшественника - ликопина.

Сведений о штаммах, способных продуцировать ликопин в качестве конечного продукта биосинтеза благодаря своим генетическим особенностям, в источниках информации нами не обнаружено.

В качестве ближайшего аналога заявляемого способа рассмотрим способ микробиологического синтеза ликопина путем совместного культивирования пары (-) и (+)штаммов Blakeslea trispora, являющейся продуцентом бета-каротина, на питательной среде с добавлением стимулятора ликопинобразования 2-амино-6-метилпиридина (9).

Этот способ позволяет синтезировать до 1,5 г/л ликопина. Основной недостаток ближайшего аналога - необходимость добавления в культуральную среду 2-амино-6-метилпиридина.

Наша задача: разработать способ синтеза ликопина, не требующий добавления в культуральную среду химических соединений, стимулирующих ликопинобразование.

Задача решена путем создания (-)штамма Blakeslea trispora lyс 26, который в паре с разными (+)штаммами Blakeslea trispora способен синтезировать ликопин в качестве конечного продукта. Штамм lyс 26 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов как Blakeslea trispora BKПM F-822.

Заявляемый штамм ВКПМ F-822 получен в результате нескольких этапов селекции с применением в качестве мутагенных факторов нитрозогуанидина и гамма-лучей на основе лабораторного (-)штамма Blakeslea trispora 111.

Заявляемый штамм имеет следующие морфологические характеристики.

На сусло-агаре рост колоний ограниченный; воздушный мицелий слабо пушистый, переплетенный, светло-малинового цвета;
спорообразование скудное.

На агаризованной среде СМ 17-1 (10) рост колоний ограничен. Колонии плоские; воздушный мицелий плотный, розовый, слегка приподнят в центре колонии. Спорообразование очень скудное.

На среде Роулен-Тома с добавлением кукурузного экстракта, содержащей, %: виннокислого аммония 0,2, сернокислого магния 0,02, сернокислого калия 0,02, кукурузного экстракта 1,0, а также в качестве микроэлементов MgSО₄ 8•10^-4, CuSО₄ 4•10^-3, ZnSО₄ 0,088, CoSО₄ 1•10^-3, FeSО₄ 1•10^-2, H₃BO₃ 6•10^-4, СаСl₂ 1•10^-2, вода остальное, рН 5,0, рост слабый. Воздушный мицелий серый паутинообразный, стелющийся. Спорообразование очень скудное.

На среде Роулен-Тома с сахарозой, содержащей вместо кукурузного экстракта 4,0% сахарозы, штамм образует высокий, пушистый воздушный мицелий белого цвета. Субстратный мицелий желтый. Спор практически не образует.

На среде GAT для Blakeslea с глюкозой, аспарагином и тиамином (11) рост слабый, замедленный. Воздушный мицелий белый, слегка приподнимающийся. Субстратный мицелий развит неравномерно, имеет оранжевую окраску. Спорообразование слабое.

При росте на модифицированной среде СМ 17-1, где в качестве источника углерода использован широкий спектр моно- и дисахаридов (глюкоза, арабиноза, фруктоза, лактоза, мальтоза и др.), мицелий штамма имеет ярко-малиновую окраску после наложения на колонии фильтровальных дисков, пропитанных бета-фактором (12), синтезированным (+)штаммами Blakeslea trispora ВКПМ F-820 и ВКПМ F-821, использовавшимися ранее для синтеза бета-каротина. Штамм непатогенен. Для культивирования заявляемого штамма оптимальный интервал температур 25-28^oС при рН 5,3-7. Указанные особенности заявляемого штамма стабильны.

(-)Штамм Вlakeslea trispora ВКПМ F-822 на традиционной для синтеза бета-каротина кукурузно-соевой среде в паре с (+)штаммом Blakeslea trispora способен продуцировать до 0,74 г/л ликопина, что составляет 80-86% от общего количества синтезированных каротиноидов, в то время как у исходного штамма при культивировании в аналогичных условиях доля ликопина не превышает 0,03%.

Для решения задачи разработан способ микробиологического синтеза ликопина на основе культивирования пары (-) и (+)штаммов Blakeslea trispora, где в качестве (-)штамма используют штамм Blakeslea trispora ВКПМ F-822, а совместное культивирование (-) и (+)штаммов осуществляют на специально разработанной питательной среде следующего состава, %:
Мальтозного сиропа - 8,0 - 14,0
Кукурузного экстракта - 4,0 - 8,0
Дрожжей пекарских (сухих) - 0,03 - 0,07
КН₂РO₄ - 0,04 - 0,06
NaCl - 0,1 - 0,5
MnSO₄7H₂O - 0,005 - 0,015
Тиамина - 0,0002
Растительного масла - 3,0 - 6,0
Воды водопроводной - 84,8 - 71,4 (84,8248 - 71,3548)
рН среды до стерилизации - 7,5 - 8,4
Способ в общем виде осуществляют следующим образом.

В качестве посевного материала используют мицелиально-споровую суспензию (-) и (+)штаммов Blakeslea trispora, причем в качестве (-)штамма используют штамм Blakeslea trispora ВКПМ F-822, а в качестве (+)штамма - разные (+)штаммы Blakeslea trispora.

Для получения мицелиально-споровой суспензии (-) и (+)штаммы культивируют раздельно на скошенном сусло-агаре при температуре 25-28^oС в течение 16-24 часов в темноте. В дальнейшем рост обеих культур протекает в освещаемом помещении в течение 8-12 суток при температуре 20-24^oС. Для получения вегетативного посевного материала воздушный мицелий с созревшими спорангиоспорами смывают с поверхности сусло-агара дистиллированной водой. Полученными суспензиями (-) и (+)штаммов раздельно засевают жидкую посевную среду следующего состава, %:
Кукурузной муки - 4,7
Соевой муки - 2,3
КН₂РO₄ - 0,05
Тиамина - 0,0002
Воды водопроводной - 92,9498
Раздельное выращивание (-) и (+)штаммов осуществляют в колбах в условиях аэрации в течение 24-48 часов при температуре 26-27^oС.

Полученным при раздельном выращивании (-) и (+)штаммов вегетативным посевным материалом засевают заявляемую питательную среду. Совместное культивирование (-) и (+)штаммов Blakeslea trispora осуществляют в условиях аэрации в течение 4-6 суток при температуре 26-27^oС. Количество синтезированного ликопина и других каротиноидов определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).

Заявляемый способ позволяет синтезировать до 1,7 г/л ликопина, при этом доля ликопина от общего количества синтезированных каротиноидов достигает 98%.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез ликопина заявляемым (-)штаммом Blakeslea trispora ВКПМ F-822 в паре с двумя различными (+)штаммами Blakeslea trispora на кукурузной-соевой питательной среде.

В качестве (+)штаммов используют Blakeslea trispora ВКПМ F-820 и Blakeslea trispora ВКПМ F-821.

Для получения мицелиально-споровых суспензий каждый из (-) и (+)штаммов отдельно выращивают на скошенном сусло-агаре в течение 20 часов при температуре 28^oС в темноте и далее в течение 10 суток при температуре 22^oС при освещении лампами дневного света.

Выращенный таким образом воздушный мицелий с созревшими спорангиоспорами смывают с поверхности агара дистиллированной водой и используют для раздельного засева (-) и (+)штаммами вышеуказанной (см. способ в общем виде) посевной среды.

Раздельное выращивание(-) и (+)штаммов осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 50 мл среды. Засеянные колбы инкубируют в течение 48 часов на круговой качалке (250 об/мин) при температуре 26-27^oС.

Полученным при раздельном выращивании (-) и (+) штаммов вегетативным посевным материалом в соотношении 10:1 соответственно засевают традиционно используемую для синтеза бета-каротина кукурузно-соевую питательную среду, следующего состава, %:
Кукурузной муки - 1,73
Соевой муки - 4,0
КН₂РO₄ - 0,05
Тиамина - 0,0002
Растительного масла - 8,0
Воды водопроводной - 86,2198
Засеянные колбы инкубируют на круговой качалке (250 об/мин) в течение 5 суток при температуре 26-27^oС.

Результаты приведены в табл.1.

Из результатов, приведенных в таблице 1, следует, что (-)штамм Blakeslea trispora ВКПМ F-822 при культивировании на кукурузно-соевой среде совместно с (+)штаммом Blakeslea trispora ВКПМ F-820 синтезирует 0,31 г/л, а совместно с (+)штаммом Blakeslea trispora ВКПМ F-821 0,74 г/л ликопина, что соответствует 86% и 80% ликопина от общего количества синтезированных каротиноидов.

Пример 2. Синтез ликопина заявляемым (-)штаммом Blakeslea trispora ВКПМ F-822 в паре с двумя различными (+)штаммами Blakeslea trispora на заявляемой питательной среде.

В качестве (+)штаммов используют Blakeslea trispora ВКПМ F-820 и Blakeslea trispora ВКПМ F-821.

Процесс приготовления вегетативного посевного материала осуществляют так же, как в примере 1, с тем отличием, что культивировапние (+)штаммов Blakeslea trispora ВКПМ F-820 и Blakeslea trispora ВКПМ F-821 осуществляют в течение 24 часов. В качестве среды для совместного культивирования используют заявляемую питательную среду, следующего состава, %:
Мальтозного сиропа - 12,0
Кукурузного экстракта - 6,0
Дрожжей пекарских (сухих) - 0,05
КН₂РO₄ - 0,05
NaCl - 0,3
МnSO₄ 7Н₂О - 0,01
Тиамина - 0,0002
Растительного масла - 4,0
Воды водопроводной - 77,5898
рН среды до стерилизации - 8,0
Среду стерилизуют при 110^oС в течение 30 мин.

Совместное культивирование (-) и (+) штаммов осуществляют, как в примере 1.

Результаты приведены в таблице 2.

Из таблицы 2 следует, что культивирование на заявляемой питательной среде (-)штамма Blakeslea trispora ВКПМ F-822 совместно с (+) штаммом Blakeslea trispora ВКПМ F-820 обеспечивает уровень синтеза ликопина 1,74 г/л, а совместно с (+) штаммом ВКПМ F-821 -1,41 г/л, что соответствует 93% и 98% ликопина от общего количества синтезированных каротиноидов.

Пример 3. Синтез ликопина заявляемым (-)штаммом Blakeslea trispora ВКПМ F-822 в паре с (+)штаммом Blakeslea trispora ВКПМ F-820 на заявляемой питательной среде в ферментере.

Масштабирование процесса осуществляют с использованием штаммов Blakeslea trispora ВКПМ F-822 и Blakeslea trispora ВКПМ F-820. Процесс приготовления вегетативного посевного материала осуществляют, как в примере 1.

Процесс совместного культивирования осуществляют в двухлитровом ферментере Bioflow III (New Brunswick Co, USA) при коэффициенте заполнения 0,6, температуре 26^oС, скорости перемешивания 600-700 rpm, аэрации 1:1 Состав заявляемой среды для совместного культивирования в ферментере, как в примере 2, а соотношение (-) и (+)штаммов при ее засеве, как в примере 1.

Через 5 суток культивирования количество синтезированного ликопина составляет 1,5 г/л, а бета-каротина 0,23 г/л, что соответствует 87% ликопина от общего количества синтезированных каротиноидов.

Таким образом, заявляемый способ обеспечивает высокий уровень синтеза ликопина по отношению к общему количеству синтезированных каротиноидов и позволяет осуществлять процесс без добавления в культуральную среду специальных химических соединений, стимулирующих ликопинобразование. Преимущества заявляемого способа сохраняются в условиях масштабирования процесса.

Источники информации
1. Chem. Educ, v.70, 6, A158.

2. Arch. Biochem. Biophys., 1989, v.264, 2, 532.

3. Прикладная биохимия и микробиология, 1980, т. 30, вып. 2, 181.

4. Goodwin T.W. The Biochemistry of the Carotenoides, 1980, USA (Chapman and Haff, Eds).

5. Патент US 3097146.

6. Патент FR 1403839.

7. Патент US 3369974.

8. Патент РФ 2102416.

9. Патент РФ 2115678.

10. Заявка WO 93/20183.

11. Phytochemistry, 1967, v.6, 3, р.355.

12. J.Bacteriol., 1968, v.95, 2, 426.

Изобретение относится к биотехнологии и касается микробиологического синтеза ликопина. Штамм Blakeslea trispora ВКПМ F-822 в паре с разными (+) штаммами Blakeslea trispora способен синтезировать ликопин. Способ синтеза ликопина на основе культивирования пары (-) и (+) штаммов Blakeslea trispora, где в качестве (-) штамма используют штамм Blakeslea trispora ВКПМ F-822, осуществляют на специально разработанной питательной среде следующего состава, %: мальтозного сиропа 8,0-14,0, кукурузного экстракта 4,0-8,0, дрожжей пекарских (сухих) 0,03-0,07, КН₂РО₄ 0,04-0,06, NaCl 0,1-0,5, MnSO₄7H₂O 0,005-0,015, тиамина 0,0002, растительного масла 3,0-6,0 воды водопроводной 84,8-71,4, рН среды до стерилизации 7,5-8,4. Предложенный (-) штамм в совокупности с предложенным способом обеспечивает высокий уровень синтеза ликопина до 1,7 г/л, позволяет осуществлять процесс без добавления в культуральную среду специальных химических соединений, стимулирующих ликопинобразование. 2 с. п.ф-лы, 2 табл.

1. (-) Штамм гетероталличного фикомицета Blakeslea trispora ВКПМ F-822, продуцирующий ликопин в паре с разными (+) штаммами Blakeslea trispora. 2. Способ микробиологического синтеза ликопина на основе культивирования пары (-) и (+) штаммов Blakeslea trispora, отличающийся тем, что в качестве (-) штамма используют штамм Blakeslea trispora ВКПМ F-822, а совместное культивирование (-) и (+) штаммов осуществляют на питательной среде следующего состава, %:
Мальтозный сироп - 8,0 - 14,0
Кукурузный экстракт - 4,0 - 8,0
Дрожжи пекарские (сухие) - 0,03 - 0,07
КН₂РО₄ - 0,04 - 0,06
NaC1 - 0,1 - 0,5
MnSO₄7H₂O - 0,005 - 0,015
Тиамин - 0,0002
Растительное масло - 3,0 - 6,0
Вода водопроводная - 84,8 - 71,4
рН среды до стерилизации - 7,5 - 8,4