ШТАММ ДРОЖЖЕЙ RHODOSPORIDIUM DIOBOVATUM - ПРОДУЦЕНТ КАРОТИНОИДОВ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/16 C12P23/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам производства каротиноидов, и касается нового штамма дрожжей, используемого для получения кормовой биомассы, обогащенной каротиноидами и применяемой в животноводстве, а также для получения чистых каротиноидов, применяемых в пищевой промышленности и медицине.

Среди дрожжей известны различные продуценты каротиноидов, отличающиеся как по уровню накопления и составу пигментного комплекса, так и по условиям культивирования и по видам используемого сырья.

Штамм дрожжей Rhodotorula glutinis 214 (SU 531844) выращивают на минеральной среде с использованием в качестве источника углерода углеводородов нефти (1,0-1,5 об.%) или углеводов (2-4 об.%). При этом удельная продуктивность дрожжей по каратиноидам составляет около 800 мкг/г сухой биомассы на среде с углеводородами нефти и около 980 мкг/г сухой биомассы на углеводной среде. Недостатком данного штамма является невысокий уровень накопления каротиноидов.

Штамм дрожжей Sporobolomyces pararosens Т (SU 391174), растущий на среде гидролизат верхового торфа, на 5-ые сутки культивирования штамм накапливает до 3200 мкг каротиноидов с 1 литра культуральной среды. Недостатками данного штамма являются невысокий уровень накопления каротиноидов и большая продолжительность процесса культивирования.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является штамм дрожжей Rhodosporidium diobovatum (RU 2103351), который за 72 часа культивирования на минеральной среде синтезирует каротиноиды в количестве до 2000 мкг/г сухой биомассы, 50% из которых составляет β-каротин - провитамин А, являющийся наиболее ценным для использования в животноводстве в качестве фактора роста. Недостатком данного штамма являются его невысокая удельная продуктивность по каротиноидам.

Технической задачей заявляемого изобретения является получение штамма дрожжей Rhodosporidium diabovatum, имеющего высокую удельную продуктивность по каротиноидам.

Поставленная задача решена путем создания штамма дрожжей Rhodosporidium diabovatum ВКПМ Y-3159, имеющего удельную продуктивность по каротиноидам 5000-6500 мкг/г сухой биомассы.

Заявляемый штамм получен из коллекционного штамма Rhodosporidium diobovatum ВКПМ Y-305 путем обработки его нитрозогуанидином (НГ) и последующей многоступенчатой селекции (шесть циклов), при которой отбор мутантов осуществлялся визуально по интенсивности окраски.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Y - 3159.

Культурально-морфологические признаки.

На жидкой среде мальтэкстракт (Difco) 3-дневная культура при 22°С имеет клетки от овальных до сильно вытянутых размером (1,0-6,0)×(2,0-9,0) мкм. Часто встречается псевдомицелий. Культура способна образовывать небольшой осадок.

На агаризованной среде мальтэкстракт (Difco) после семи дней выращивания при 25°С клетки морфологически сходны с клетками на жидком мальтэкстракте. Колонии ярко-оранжевого цвета с шероховатой поверхностью и неровным краем.

На среде кукурузный агар (Difco) культура через 7 суток выращивания при 25°С способна образовывать истинный мицелий.

Физиолого-биохимические признаки.

На среде YNB (Difco) культура ассимилирует галактозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, трегалозу, рафинозу, D-ксилозу, L-арабинозу, D-рибозу, рибитол, янтарную кислоту, лимонную кислоту, мелицитозу, α-метил-d-глюкозид, арбутин, крахмал (медленно). Не ассимилирует лактозу, L-рамнозу, эритритол, D-манитол, инозитол, мелибиозу. Утилизирует аммонийный нитратный азот. Для роста не требует витаминов. На среде с 50%-ной глюкозой рост отсутствует. Крахмал не накапливает. Мочевину разлагает. Брожение отсутствует. При температуре 35°С не растет. Оптимальная температура роста 29-30°С. Диапазон рН для роста 2,5-7,0. Оптимум рН 5,0-5,5. Аэроб.

Штамм непатогенен.

Биотехнологическая характеристика.

Штамм способен продуцировать каротиноидов до 6,5 мг/г сухой биомассы, в том числе β-каротина до 4,5 мг/г.

В ферментере на глюкозе в качестве единственного источника углерода штамм способен накапливать более 100 г сухой биомассы с 1 л питательной среды.

Штамм хранится в 10% глицерине при - 70°С в кельвинаторе или парах жидкого азота без потери жизнеспособности в течение 10 лет.

Пример 1. Культивирование штамма Rhodosporidium diobovatum ВКПМ Y - 3159 в колбах.

Штамм дрожжей культивируют в колбах на 750 мл при температуре 28°С при 250 об/мин на питательной среде следующего состава (мас.%): глюкоза - 10,0; дрожжевой экстракт - 0,6; пептон - 0,5; KH₂PO₄ - 0,1; MgSO₄ - 0,05, NaCl - 0,01; CaCl₂ - 0,01; вода - остальное. Время выращивания 72 ч.

Удельное суммарное содержание каротиноидов определяют спектрофотометрическим методом (J. Gen. Microbiol. 1979. V.115. P.173-183), для определения процентного соотношения каротиноидов в смеси используют жидкостную хроматографическую систему HPLC (колонка С-18), применяя в качестве стандарта чистый кристаллический препарат β-каротина фирмы "Sigma".

Удельная продуктивность каротиноидов составила 6000 мкг/г сухой биомассы, в том числе β-каротина 4440 мкг/г сухой биомассы.

Пример 2. Культивирование штамма Rhodosporidium diobovatum ВКПМ Y - 3159 в ферментере.

Штамм дрожжей выращивали в 3-х литровом ферментере КФ 103/4 (Россия) на питательной среде по примеру 1. Условия культивирования: температура культивирования - 28°С, растворимый кислород рО₂ 40-60%, рН=5,0, подпитка 50% глюкозой в течение всего процесса. Время выращивания 72 ч.

Содержание каротиноидов в биомассе составило 5850 мкг/г сухой биомассы, в том числе β-каротина 4270 мкг/г сухой биомассы. Уровень сухой биомассы составил 110 г/л питательной среды. Следовательно, съем с литра культуральной жидкости составил 0,65 г суммарных каротиноидов, в том числе 0,47 г β-каротина.

Таким образом, заявляемый штамм имеет высокую удельную продуктивность по каротиноидам, среди которых β-каротин составляет более 70%. Важной характеристикой штамма является также его способность хорошо утилизировать спирты, органические кислоты и некоторые пентозы, что позволяет выращивать его на таких дешевых субстратах, как послеспиртовая барда и ферментолизат растительных отходов.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии. Штамм Rhodosporidium diobovatum ВКПМ Y - 3159 культивируют на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли в течение 72 ч. Получают биомассу, содержащую каротиноиды в количестве 5,0-6,5 мг/г сухой биомассы, в том числе β-каротина 3,0-4,5 мг/г сухой биомассы. Это обеспечивает расширение арсенала штаммов дрожжей, продуцирующих каротиноиды с более высокой удельной продуктивностью, и возможность выращивания штамма на таких дешевых субстратах, как послеспиртовая барда и ферментолизат растительных отходов.

Штамм дрожжей Rhodosporidium diobovatum ВКПМ Y - 3159 - продуцент каротиноидов.