ШТАММ ДРОЖЖЕЙ RHODOSPORIDIUM DIOBOVATUM - ПРОДУЦЕНТ КАРОТИНОИДОВ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/16 C12P23/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам производства каротиноидов, и касается нового штамма дрожжей, используемого для получения кормовой биомассы, обогащенной каротиноидами и применяемой в животноводстве, а также для получения чистых каротиноидов, применяемых в пищевой промышленности и медицине.

Среди дрожжей известны различные продуценты каротиноидов, отличающиеся как по уровню накопления и составу пигментного комплекса, так и по условиям культивирования и по видам используемого сырья.

Штамм дрожжей Rhodotorula glutinis 214 (SU 531844) выращивают на минеральной среде с использованием в качестве источника углерода углеводородов нефти (1,0-1,5 об.%) или углеводов (2-4 об.%). При этом удельная продуктивность дрожжей по каратиноидам составляет около 800 мкг/г сухой биомассы на среде с углеводородами нефти и около 980 мкг/г сухой биомассы на углеводной среде. Недостатком данного штамма является невысокий уровень накопления каротиноидов.

Штамм дрожжей Sporobolomyces pararosens Т (SU 391174), растущий на среде гидролизат верхового торфа, на 5-е сутки культивирования накапливает до 3200 мкг каротиноидов с 1 литра культуральной среды. Недостатками данного штамма являются невысокий уровень накопления каротиноидов и большая продолжительность процесса культивирования.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является штамм дрожжей Rhodosporidium diobovatum (RU 2103351), который за 72 часа культивирования на минеральной среде синтезирует каротиноиды в количестве до 2000 мкг/г сухой биомассы, 50% из которых составляет β-каротин - провитамин А, являющийся наиболее ценным для использования в животноводстве в качестве фактора роста. Недостатками данного штамма являются его невысокая удельная продуктивность по каротиноидам и недостаточное содержание β-каротина в биомассе.

Технической задачей заявляемого изобретения является получение штамма дрожжей Rhodosporidium diabovatum, продуцирующего каротиноиды с высоким содержанием β-каротина.

Поставленная задача решена путем создания штамма дрожжей Rhodosporidium diabovatum ВКПМ У - 3158, способного продуцировать каротиноиды в количестве 3000-4000 мкг/г сухой биомассы, в том числе β-каротина 2500-3600 мкг/г, т.е. до 90%.

Заявляемый штамм получен из коллекционного штамма Rhodosporidium diobovatum ВКПМ Y-305 путем обработки его нитрозогуанидином (НГ) и последующей многоступенчатой селекции (пять циклов), при которой отбор мутантов осуществлялся визуально по интенсивности окраски.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Y - 3158.

Культурально-морфологические признаки.

На жидкой среде мальтэкстракт (Difco) 3-дневная культура при 22°С имеет клетки от овальных до сильно вытянутых размером (1,0-6,0)×(2,0-9,0) мкм. Часто встречается псевдомицелий. Культура способна образовывать небольшой осадок.

На агаризованной среде мальтэкстракт (Difco) после семи дней выращивания при 25°С клетки морфологически сходны с клетками на жидком мальтэкстракте. Колонии ярко-желтого цвета с шероховатой поверхностью и неровным краем.

На среде кукурузный агар (Difco) культура через 7 суток выращивания при 25°С способна образовывать истинный мицелий.

Физиолого-биохимические признаки.

На среде YNB (Difco) культура ассимилирует галактозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, трегалозу, рафинозу, D-ксилозу, L-арабинозу, D-рибозу, рибитол, янтарную кислоту, лимонную кислоту, мелицитозу, α-метил-d-глюкозид, арбутин, крахмал (медленно). Не ассимилирует лактозу, L-рамнозу, эритритол, D-манитол, инозитол, мелибиозу. Утилизирует аммонийный нитратный азот. Для роста не требует витаминов. На среде с 50%-ной глюкозой рост отсутствует. Крахмал не накапливает. Мочевину разлагает. Брожение отсутствует. При температуре 35°С не растет. Оптимальная температура роста 29-30°С. Диапазон рН для роста 2,5-7,0. Оптимум рН 5,0-5,5. Аэроб.

Штамм непатогенен.

Биотехнологическая характеристика.

Штамм способен продуцировать каротиноидов до 4,0 мг/г сухой биомассы, в том числе β-каротина до 3,6 м/г.

В ферментере на глюкозе в качестве единственного источника углерода штамм способен накапливать более 100 г сухой биомассы с 1 л питательной среды.

Штамм хранят в 10% глицерине при - 70°С в кельвинаторе или парах жидкого азота без потери жизнеспособности в течение 10 лет.

Пример 1. Культивирование штамма Rhodosporidium diobovatum ВКПМ Y - 3158 в колбах.

Штамм дрожжей культивируют в колбах на 750 мл при температуре 28°С при 250 об/мин на питательной среде следующего состава (мас.%): глюкоза - 10,0; дрожжевой экстракт - 0,6; пептон - 0,5; KH₂PO₄ - 0,1; MgSO₄ - 0,05, NaCl - 0,01; CaCl₂ - 0,01; вода - остальное. Время выращивания 72 ч.

Удельное суммарное содержание каротиноидов определяют спектрофотометрическим методом (J. Gen. Microbiol. 1979. V.115. P.173-183), для определения процентного соотношения каротиноидов в смеси используют жидкостную хроматографическую систему HPLC (колонка С-18), применяя в качестве стандарта чистый кристаллический препарат β-каротина фирмы "Sigma".

Удельная продуктивность каротиноидов составила 4000 мкг/г сухой биомассы, в том числе 87,5% β-каротина (3500 мкг/г сухой биомассы).

Пример 2. Культивирование штамма Rhodosporidium diobovatum ВКПМ Y - 3158 в ферментере.

Штамм дрожжей выращивали в 3-литровом ферментере КФ 103/4 (Россия) на питательной среде вышеописанного состава. Условия культивирования: температура культивирования - 28°С, растворимый кислород pO₂ 40-60%, рН 5,0, подпитка 50% глюкозой весь процесс. Время выращивания 72 ч.

Содержание каротиноидов в биомассе составило 3850 мкг/г сухой биомассы, в том числе β-каротина 3250 мкг/г сухой биомассы (84,4%). Уровень сухой биомассы составил 110 г/л питательной среды. Следовательно, съем с литра культуральной жидкости составил 0,42 г суммарных каротиноидов, в том числе 0,36 г β-каротина.

Таким образом, заявляемый штамм имеет высокую удельную продуктивность по каротиноидам, среди которых β-каротин составляет около 90%. Важной характеристикой штамма является также его способность хорошо утилизировать спирты, органические кислоты и некоторые пентозы, что позволяет выращивать его на таких дешевых субстратах как послеспиртовая барда и ферментолизат растительных отходов.

Изобретение относится к биотехнологии. Получают штамм Rhodosporidium diobovatum ВКПМ Y-3158 - продуцент каротиноидов с высоким содержанием β-каротина путем многоступенчатой селекции с использованием мутагена нитрозогуанидина. Культивируют на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли. Получают биомассу, содержащую каротиноиды в количестве 3000-4000 мкг/г сухой биомассы, в том числе β-каротина 2500-3500 мкг/г, т.е. до 90%. Изобретение обеспечивает получение каротиноидов с высоким содержанием β-каротина.

Штамм дрожжей Rhodosporidium diobovatum ВКПМ Y-3158 - продуцент каротиноидов.