ШТАММ STREPTOMYCES KURSSANOVII - ПРОДУЦЕНТ ХИТИНАЗЫ И N-АЦЕТИЛ-D-ГЛЮКОЗАМИНИДАЗЫ Российский патент 1996 года по МПК C12N9/36 C12N9/36 C12R1/465 

Изобретение относится к области микробиологического синтеза ферментов и представляет собой новый штамм рода Streptomyces, используемый для получения ферментных препаратов хитиназы и N-ацетил-D-глюкозаминидазы.

Известно, что способностью синтезировать хитинолитические ферменты обладает широкий круг микроорганизмов. К ним относятся представители родов Preudomonas, Clostridium, Klebsiela, Serratia, Candida, Trichoderma и многие другие. Однако наиболее активными продуцентами этих ферментов являются представители рода Streptomyces:Str.griseus Str.plicatus,Str.lividans (1). Пириевой и др.(2) было показано, что используемый ими штамм Str.Kurssanovii обладал хитиназной активностью равной 12 ед /1 единица 22 мкг N-ацетил-D-глюкозамина, образующегося за 1 час при 40^oС под действием 1 мл супернатанта культуральной жидкости/. Имеется также авторское свидетельство Тиуновой Н.А. и др.(3), в котором указано, что хитиназная активность, получаемая в результате культивирования Str.Kurssanovii 93, составляет 18-22 единицы.

Задача изобретения селекция нового штамма Streptomyces Kurssanovii, способного синтезировать хитиназу и N-ацетил D-глюкозаминидазу с высокой активностью.

Штамм Streptomyces Kurssanovii 107 выделен из почв Звенигородской биостанции МГУ и селекционирован в условиях непрерывного культивирования на средах с коллоидным хитином в качестве единственного источника углерода.

Штамм Streptomyces Kurssanovii 107 депонирован в коллекции института биохимии и физиологии микроорганизмов /ИБФМ/ РАН и имеет коллекционный номер VКМ Ас-1504D/.

Предлагаемый штамм непатогенен и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Морфологические признаки Str. Kurssanovii 107 изучались на среде с овсяным агаром. Мицелий хорошо развит, подразделяется на субстратный и воздушный. Колонии небольшие 3-7 мм в диаметре, как правило, плотные, кожистые, врастающие в субстрат, споровые массы серого цвета. Цепочки спор спиральные, поверхность спор гладкая.

Штамм обладает естественной изменчивостью. В популяции обнаружено пять стабильных вариантов, различающихся внешним видом колоний, образованием воздушного мицелия и пигментов.

Культуральные признаки.

На овсяном агаре воздушный мицелий светло-серый, бархатистый, субстратный желто-бурый, образует растворимый пигмент бурого цвета.

На картофельном агаре воздушный мицелий серый, бархатистый, штрих серо-коричневый, морщинистый, субстратный мицелий бурый, среда не окрашена.

На глюкозо-нитратном агаре /CP-1/ воздушный мицелий кремовый, субстратный мицелий и пигмент рыжевато-коричневые -/цвет ржавчины/.

На глицерин-нитратном агаре воздушный мицелий желтый, субстратный мицелий и растворимый пигмент оранжево-бурые.

На среде Гаузе 2 воздушный мицелий не образуется. Субстратный мицелий и пигмент темно-коричневого цвета. Штрих сильно складчатый.

Физиологические признаки.

Ассимилирует глюкозу, галактозу, сахарозу, фруктозу, арабинозу /слабо/, рафинозу, ксилозу. Не усваивает инозит, маннит, рамнозу и салицин.

Гидролизует крахмал, разжижает желатину. На пептонно-дрожжевой среде с железом образует меланин. Антибактериальная активность не обнаружена.

Из пяти морфологических вариантов, обнаруженных в популяции, три обладают не одинаковой, но достаточно высокой хитиназной и N-ацетилD-глюкозаминидазной активностью и количество этих вариантов составляет 96% от состава всей популяции.

Аэроб. Оптимальная для роста температура 30-33^oC, выдерживает температуру до 37^oC. Растет в широком интервале рН от 5,0 до 8,5, оптимум рН составляет 6,0 6,4.

Примеры использования штамма.

Пример 1.

Штамм Str.Kurssanovii 107 выращивали в качалочных колбах емкостью 750 мл на качалке /200 об/мин/ в течение 48 часов при температуре 33^oC. Объем среды в колбе составлял 100 мл.

Состав среды:
хитин 2%
дрожжевой экстракт 0,1%
пептон 0,2%
K₂HPO₄ 0,3%
MgSO₄ 0,1%
вода водопроводная, рН среды перед засевом 6,4. Культуру поддерживали на агаризованной среде того же состава. В результате культивирования была получена культуральная жидкость, супернатант которой обладал следующей хитиназной и N-ацетил-D- глюкозаминидазной активностью: хитиназная активность составляла 27 единиц /микромоль N-ацетилглюкозамина на мл в час/ и N-ацетил-D- глюкозаминидазная активность 28,2 единиц /микромоль п-нитрофенола на мл в час/.

Пример 2.

Культивирование проводили аналогично примеру 1, но рН среды перед посевом было равно 6,0.

При этом хитиназная активность в культуральной жидкости составляла 25 единиц, a N-ацетил-D-глюкозаминидазная активность 25,2 единиц.

Пример 3.

Выращивание проводили на ферментере марки "Marubishi", Япония /полезный объем 50 л/ при интенсивном перемешивании и аэрации, составляющей 2 объема воздуха на 1 объем среды в 1 минуту. Состав питательной среды указан в примере 1. Продолжительность ферментации составила 36 часов при температуре 30^oС. Посевным материалом служила культура, выращенная в колбах емкостью 750 мл, как это описано в примере 1. Время культивирования посевного материала составляло 36 часов /экспоненциальная фаза роста/. Посевной материал вносили в количестве 10% После окончания культивирования и отделения биомассы активность хитиназы в надосадочной жидкости составила 30 единиц, а N-ацетил-D-глюкозаминидазы 31,2 единиц.

Надосадочная жидкость была высушена на распылительной сушилке и 1 г полученного препарата содержал 6000 единиц хитиназной и 6240 единиц N-ацетил-D-глюкозаминидазной активности.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: селекция штамма Streptomyces Kurssanovii, способного синтезировать хитиназу и N- ацетил-D-глюкозаминидазу с высокой активностью. Штамм депонирован в коллекции ИБФМ РАН и имеет коллекционный номер VКМ Ас-1504D. Морфологические признаки штамма изучались на среде с овсяным агаром. Мицелий хорошо развит и подразделяется на субстратный и воздушный. Колонии небольшие 3-7 мм в диаметре. Штамм обладает естественной изменчивостью. На овсяном агаре воздушный мицелий светло-серый, бархатистый, субстратный - желто-бурый, образует растворимый пигмент бурого цвета. На картофельном агаре воздушный мицелий серый, бархатистый, штрих серо-коричневый, морщинистый, субстратный-мицелий бурый, среда не окрашена. Штамм ассимилирует глюкозу, галактозу, сахарозу, фруктозу, арабинозу, рафинозу, ксилозу. Не усваивает инозит, маннит, рамнозу и салицин. Антибактериальная активность не обнаружена. Аэроб. Оптимальная для роста температура 30-33^oС. Растет в широком интервале рН от 5,0 до 8,5, оптимум рН составляет 6,6-6,4. Хитиназная активность в культуральной жидкости - 25-27 единиц, а N-ацетил-D-глюкозоаминидазная - 25,2-27,0 единиц.

Штамм Streptomyces Kurssanovii VКМ АС-1504Д продуцент хитиназы и N-ацетил-D-глюкозаминидазы.