ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ ERITRICHIUM INCANUM (TURCZ.) A.DC.SSP. SICHOTENSE (M.POP.) STARCHENKO, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО ХИТИНАЗНОЙ И ХИТОЗАНАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1995 года по МПК C12N5/04 C12N9/36 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве и медицине. Штамм культивируемых клеток растений Eritrichium incanum (Turcz. ) A.DC. ssp. sichotense (M.Pop.) Starchenko (ErSR) является новым доступным источником ферментов углеводного обмена хитиназы и хитозаназы, которые расщепляют β -1,4-гликозидные связи в широко распространенных в природе биополимерах хитине и хитозане. В результате реакций расщепления хитина и хитозана образуются полисахариды низкой молекулярной массы, смесь олигосахаридов, аминосахаров. Хитиназа и хитозаназа распространены в растениях и необходимы для борьбы с фитопатогенами, грибными и вирусными инфекциями с насекомыми [1] В свою очередь продукты, получаемые из хитина и хитозана с помощью ферментативной деградации, сами являются ингибиторами фитопатогенов, увеличивают устойчивость растений к грибковым заболеваниям, проявляют элиситорную активность, обладают противоопухолевой и иммуностимулирующей активностью.

До недавнего времени хитиназы и хитозаназы выделяли из микроорганизмов и только в последние годы в качестве источников этих ферментов были использованы клеточные культуры риса [2] Данные по использованию незабудочника сихотинского, как источника получения хитиназы и хитозаназы в литературе отсутствуют.

Поиск доступных источников хитиназ и хитозаназ имеет научный и практический интерес, так как позволит получать не только высокоактивные ферментные препараты, но и с их помощью модифицированные производные хитина и хитозана, широко используемые в сельском хозяйстве и медицине природные биологически активные вещества.

Целью изобретения является получение активно растущего штамма клеток незабудочника сихотинского Eritrichium sichotense (M.Pop.) Starchenko, являющегося продуцентом хитиназы и хитозаназы.

Штамм Eritrichium sichotense (ErSR) получен и находится на депонировании во Всероссийской коллекции клеточных культур, а именно в специализированной коллекции клеток высших растений Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева Российской Академии Наук под коллекционным номером 50.

Описание и сходного материала. Исходным материалом для получения штамма ErSR было дикорастущее растение незабудочника сихотинского в фазе цветения, найденное в Приморском крае, Партизанском районе на южном склоне известнякового хребта Чандалаз (Лазовый) в мае 1990 года. Эксплантом служили кусочки поперечного среза корней размером 3-4 мм.

Культуральные свойства. Растущая каллусная культура представляет собой мягкую ткань рыхлой консистенции светло-серого цвета без запаха. Ростовой индекс 10±3 для каллусов начальной массой 200 мг. Живых клеток 91-95% в середине стадии экспоненциального роста, содержание сухого вещества 2,7% Штамм ErSR выращивают при температуре 25 ± 1^оС, относительной влажности воздуха 60 ± 10% в темноте на питательной среде следующего состава, мг/л воды: NH₄NO₃ 1300-1950 KNO₃ 1500-2300 KH₂PO₄ 150-190 CaCl₂ x 6H₂O 600-730 MgSO₄ x 7H₂O 350-390 H₃BO₃ 4,2-8,0 MnSO₄ x 4H₂O 15,6-26,7 CuSO₄ x 5H₂O 0,02-0,03 CoCl₂ x 2H₂O 0,02-0,03 ZnSO₄ x 7H₂O 6,0-10,3 Na₂MoO₄ x 2H₂O 0,2-0,3 KI 0,52-0,90 FeSO₄ x 7H₂O 25,0-30,6 Na₂EDTA x 2H₂O 33,6-41,0 Мезо-инозит 80-120 Никотиновая кислота 0,4-0,6 Пиридоксина гидрохлорид 0,4-0,6 Тиамин хлорид 0,15-0,25 Глицин 1-3 6-Бензиламинопурин 0,25-0,75 α -нафтилуксусная кислота (АНУ) 1-3 Казеина гидролизат 40-60 Сахароза 25000-35000 Агар 5800-6200 Вода До 1 л
рН среды 5,2-5,6 до автоклавирования.

Ткань культивируется в пробирках емкостью 50 мл, содержащих 15 мл питательной среды или в колбах Эрленмейера емкостью 100 мл 30 мл питательной среды. Продолжительность цикла выращивания 28 сут. Номер пассажа 34.

Цитологические и кариологические характеристики штамма ErSR.

Ткань представляет собой гетерогенную популяцию, состоящую из двух групп клеток. Первая группа клетки меристематического типа овальной или удлиненной формы, имеющие средние размеры 50 х 64 мкм, содержание которых в популяции 36-91% Вторая группа клетки паренхимного типа тоже овальной или удлиненной формы, но более крупные, средние размеры 94-145 мкм, содержание их в популяции 9-64%
Максимум митотической активности наблюдается на 24 и 30 сут культивирования, митотический индекс 10,4 и 10,6% соответственно.

Распределение клеток по числу хромосом штамма ErSR дано в табл.1
Способность к морфогенезу отсутствует.

Характеристика хитиназной и хитозаназной активности препарата, полученного из биомассы штамма ErSR незубудочника сихотинского.

После окончания цикла культивирования (28 сут) сырую биомассу клеток собирают, белки экстрагируют 0,03 М трис-HCl буфером рН 7,0 и концентрируют сульфатом аммония. Полученная белковая фракция представляет собой препарат, обладающий хитиназной и хитозаназной активностью. Ферментативную активность препаратов из биомассы штамма ErSR определяют по методу Нельсона, используя в качестве субстратов 1%-ную суспензию коллоидного хитина и 5%-ный раствор хитозана. Препарат, полученный из штамма ErSR, имеет следующие характеристики из расчета на 1 г сырых клеток биомассы: концентрация белка 2,05 мг
суммарная хитиназная активность 4210 мкМ
суммарная хитозаназная активность 585 мкМ
удельная хитиназная активность 2050 мкМ/мг
удельная хитозаназная активность 285 мкМ/мг
В табл. 2 приведены характеристики препаратов, полученных из биомассы клеток в процессе долговременного культивирования штамма.

Использование штамма иллюстрируется следующим примером.

В пробирки емкостью 50 мл наливают по 15 мл питательной среды следующего состава, мг/л воды: NH₄NO₃ 1650 KNO₃ 1900 KH₂PO₄ 170 CaCl₂ x 6H₂O 665 MgSO₄ x 7H₂O 370 H₃BO₃ 6,2 MnSO₄ x 4H₂O 22,3 CuSO₄ x 5H₂O 0,025 CoCl₂ x 2H₂O 0,025
ZnSO₄ x 7H₂O 8,6 Na₂MoO₄ x 2H₂O 0,25 KI 0,83 FeSO₄ x 7H₂O 27,8 Na₂EDTA x 2H₂O 37,3 Мезо-инозит 100 Никотиновая кислота 0,5 Пиридоксина гидрохлорид 0,5 Тиамин хлорид 0,2 Глицин 2,0 6-Бензиламинопурин 0,5 α-нафтилуксусная кислота (АНУ) 2,0 Казеина гидролизат 50 Сахароза 30000 Агар 6000
рН среды 5,5 до автоклавирования
Пробирки со средой стерилизуют при 117^оС в течение 20 мин, а затем в асептических условиях в каждую пробирку помещают по 200 мг клеточной биомассы штамма ErSR. Культивирование проводят в темноте при 24^оС и относительной влажности воздуха 60% в течение 28 сут. Затем биомассу снимают с поверхности питательной среды, взвешивают. В каждой пробирке накапливается по 2,5-3,0 г сырой биомассы. Сырую биомассу собирают с поверхности питательной среды, экстрагируют 0,03 М трис-HCl буфером рН 7,0, содержащим 0,9% NaCl, гомогенизируют и выдерживают при 4^оС в течение 12 ч. Супернатант сливают, а осадок экстрагируют дважды. Из объединенного супернатанта выделяют белковую фракцию путем высаливания сульфатом аммония (60% насыщение). Сформированный осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин при 4^оС. Осадок растворяют в небольшом объеме 0,03 М трис-HCl буфера рН 7,0 и диализуют против буфера до удаления сульфата аммония.

Белковая фракция представляет собой препарат, обладающий хитиназной и хитозаназной активностью.

Оценка хитиназной и хитозаназной активности препарата.

Для определения хитаназной активности белкового препарата в пробу добавляют 2 мл буфера рН 5,0, 50 мкл 1%-ной суспензии хитина и 0,1-0,2 мл белковой фракции. Реакционную смесь инкубируют в течение 12 ч при 37^оС. Нерастворившийся хитин отделяют центрифугированием. Хитиназную активность определяют по количеству образовавшихся при ферментолизе восстанавливающих сахаров по методу Нельсона. За единицу активности хитиназы принимают такое количество фермента, которое освобождает при ферментолизе 1 мкМ восстанавливающих углеводных групп. За эквивалент в случае хитиназы принимают N-ацетилглюкозамин.

Для определения хитозаназной активности белкового препарата в пробу добавляют 2 мл трис-HCl буфера рН 7,0, 50 мкл 5%-ного раствора хитозана и 0,1-0,2 мл белковой фракции. Реакционную смесь инкубируют также, как и в случае определения хитиназной активности, в течение 12 ч при 37^оС. За эквивалент в этом случае принимают глюкозамин. Количество белка определяют спектрофотометрическим методом. Одна оптическая единица принимается равной 1 мг белка. Удельная активность фермента определяется как количество единиц активности в 1 мг белка.

Хитиназная и хитозаназная активность препарата, полученного из штамма ErSR.

Ферментативная активность всех препаратов определена из расчета на 1 г сырых клеток биомассы штамма ErSR (табл.3).

Из данных табл.3 максимальная удельная активность хитиназы приходится на 28 сут, а хитозаназы на 14 сут культивирования.

Таким образом, штамм ErSR культивируемых клеток растений Eritrichium sichotense является высокопродуктивным и возобновимым источником для биотехнологического получения препарата, обладающего хитиназной и хитозаназной активностью.

Использование: биотехнология, сельское хозяйство и медицина. Сущность изобретения: штамм ErSR получен из дикорастущего растения незабудочника сихотинского в фазе цветения. Ростовой индекс культуры 10± 3. Штамм культивируемых клеток растений ErSR является новым источником для биотехнологического получения препарата, обладающего хитиназной и хитозаназной активностью. Препарат представляет собой белковую фракцию, выделенную из биомассы клеток штамма ErSR, и имеет следующие характеристики ( из расчета на 1 г сырых клеток ): концентрация белка 2,05 мг, суммарная хитиназная активность 4210 мкМ, суммарная хитозаназная активность 585 мкМ, удельная хитиназная активность 2050 мкМ/мг, удельная хитозаназная активность 285 мк/мг. 3 табл.

Штамм культивируемых клеток растений Eritrichium incanum (Turcz) A.DC. ssp. sichotense (M. Pop.) Starchenko ErSR ВККК (ВР) N 50, используемый для получения препарата, обладающего хитиназной и хитозаназной активностью.