СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО СИНТЕЗА ДНК Российский патент 2003 года по МПК C12P19/34 C12N9/12 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для синтеза и детекции ДНК.

Известен способ получения ДНК путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР). Он заключается в последовательном повторении стадий: 1) плавления двуцепочечной ДНК-матрицы, 2) комплементарного взаимодействия (гибридизации или отжига) с ДНК олигонуклеотидных праймеров и 3) удлинения праймеров с помощью ДНК-полимеразы. При проведении ПЦР праймеры гибридизуются с концевыми участками целевого фрагмента ДНК и направлены таким образом, что синтез цепей осуществляется полимеразой вдоль участка, ограниченного праймерами. В результате каждого цикла происходит удвоение целевого фрагмента ДНК. Накопление целевого фрагмента ДНК в процессе ПЦР происходит экспоненциально, так как отжиг праймеров осуществляется и на вновь синтезированых цепях.

(Патент США 4683202, МКИ С 12 Р 19/34, опубл. 1987).

Недостатком этого способа получения ДНК является недостаточно высокая специфичность синтеза целевой последовательности ДНК. Под специфичностью понимается отношение количества целевой последовательности ДНК, синтезированной в процессе реакции, к общему количеству синтезированной ДНК.

Высокая специфичность синтеза целевой последовательности ДНК в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) обеспечивается проведением реакции при температурах свыше 50^oС. Инициация (начало) синтеза неспецифических последовательностей ДНК, как правило, происходит при более низкой температуре. Известно, что способы повышения специфичности ПЦР заключаются в инициации синтеза ДНК при температуре свыше 50^oС. Обычно для этого используют введение отдельных компонентов реакционной смеси, необходимых для осуществления реакции (обычно это ДНК-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты или соль магния), в уже нагретую смесь или используют препараты обратимо инактивированных ДНК-полимераз, для активации которых требуется высокая (свыше 50^oС) температура.

Известен способ получения ДНК путем проведения ПЦР с использованием парафиновых шариков, внутрь которых помещают ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты или соль магния. Введение в реакционную смесь реагентов, находящихся в парафиновом шарике, и инициация реакции происходит только после плавления парафина при температуре свыше 50^oС, что повышает специфичность реакции (Патент США 5411876, МКИ С 12 Р 19/34, опубл. 1995).

Недостатками этого способа проведения ПЦР являются:
1) сложность производства подобных парафиновых шариков, что почти вдвое увеличивает стоимость проведения ПЦР с их использованием;
2) использование данного способа ограничивает возможность произвольного изменения объема реакционной смеси, так как количество реагентов в парафиновом шарике соответствует определенному объему реакционной смеси.

Известен способ получения ДНК путем проведения ПЦР с использованием препарата термостабильной ДНК-полимеразы, чья ферментативная активность обратимо инактивирована с помощью моноклональных антител к используемой ДНК-полимеразе. В этом случае активация ферментативной активности ДНК-полимеразы и инициация реакции ферментативного синтеза ДНК происходит только после прогревания реакционной смеси при температуре свыше 70^oС в течение нескольких (от 2 до 20) минут, что значительно увеличивает специфичность реакции.

(Патент США 5338671, МКИ С 12 Р 19/34, опубл. 1994).

Недостатками этого способа проведения ПЦР являются:
1) при использовании моноклональных антител для обратимой инактивации ДНК-полимеразы существует опасность загрязнения препарата эукариотической ДНК,
2) высокая стоимость производства моноклональных антител.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения ДНК путем проведения ПЦР в присутствии хлорида магния с использованием препарата термостабильной ДНК-полимеразы, чья ферментативная активность обратимо инактивирована с помощью химической модификации (изменения) белка. В этом случае инициация реакции ферментативного синтеза ДНК происходит только после прогревания реакционной смеси при температуре свыше 70^oС в течение нескольких (от 2 до 20) минут, что значительно увеличивает специфичность реакции.

(Патент США 5677152, МКИ С 12 Р 19/34, опубл. 1997).

Недостатками этого способа проведения ПЦР являются:
1) высокая стоимость производства обратимо инактивированной ДНК-полимеразы, что примерно в полтора раза увеличивает стоимость проведения реакции,
2) при проведении химической модификации белка не менее 20% ДНК-полимеразы инактивируется необратимо.

Изобретение решает задачу упрощения и удешевления процесса.

Поставленная задача достигается за счет того, что в известном способе ферментативного синтеза ДНК путем проведения полимеразной цепной реакции с использованием термостабильной ДНК-полимеразы в присутствии соли магния, реакцию проводят в насыщенном растворе малорастворимой соли магния - оксалата магния.

Оксалат магния является малорастворимой солью, чья растворимость в воде возрастает с увеличением температуры от 5,7•10^-4 моль/л при 18^oС до 5,4•10^-3 моль/л при 100^oС. Оксалат магния добавляют в реакционную смесь в количестве, достаточном для образования насыщенного раствора. В этом случае концентрация ионов магния, необходимых для ферментативного синтеза ДНК, определяется растворимостью оксалата магния и возрастает с увеличением температуры реакционной среды. Использование оксалата магния позволяет создать оптимальную для синтеза ДНК концентрацию ионов магния только при температурах свыше 50-55^oС, что снижает уровень синтеза ДНК при более низких температурах и подавляет инициацию синтеза неспецифических последовательностей ДНК.

Для изменения растворимости оксалата магния и оптимизации концентрации ионов магния в реакционную среду вводят хорошо растворимую соль щавелевой кислоты - оксалат аммония. При проведении ПЦР с Taq ДНК-полимеразой и с оксалатом магния оптимальная концентрация оксалата аммония в реакционной среде (определенная по результатам ПЦР) составляет от 10 до 12 мМ.

Предлагаемый способ позволяет сохранить высокую специфичность полимеразной цепной реакции (ПЦР), прост в реализации за счет использования более доступных и недорогих реагентов (не требуется использование химически модифицированной ДНК-полимеразы). Он может быть использован для увеличения специфичности не только ПЦР, но и других реакций праймер-зависимого ферментативного синтеза ДНК, например реакций удлинения олигонуклеотидного праймера или секвенирования ДНК по методу Сенгера.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

ПЦР осуществляют следующим образом:
Готовят реакционную смесь объемом 50 мкл, содержащую: 10 мМ Трис-НСl (рН 9,0 at 25^oC); 50 мМ КСl; 0,1% Triton X-100; дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ) в концентрации 0,2 мМ каждого; 2,5 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы; олигонуклеотидные праймеры Р1 и Р2 в количестве 20 пикомоль каждого; 1 наног геномной ДНК человека; 10 мМ оксалата аммония. Оксалат магния получают смешением 5 микрол 100 мМ раствора хлорида магния и 5 микрол 100 мМ раствора оксалата аммония и добавляют в реакционную смесь.

Синтез фрагмента геномной ДНК человека (ген МНС I HLA-C allele HLA-4) размером 1230 п.о. осуществляют с использованием олигонуклеотидных праймеров Р1 (5'-GCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAG) и Р2 (5'-CATCATAGCGGTGACCACAGCTCCAA). Реакцию проводят в следующем температурном режиме: 94^oС - 30 сек; 58^oС - 30 сек; 72^oС - 100 сек, в течение 35 циклов.

После проведения ПЦР продукты реакции подвергают электрофоретическому анализу в геле 1,2% агарозы. Количество синтезированных продуктов реакции определяют денситометрически. Специфичность реакции расчитывают как отношение количества специфического продукта реакции к общему количеству синтезированной ДНК. Данные о специфичности ПЦР представлены в таблице.

Пример 2.

ПЦР осуществляют следующим образом:
Готовят реакционную смесь объемом 50 мкл, содержащую: 10 мМ Трис-НСl (рН 9,0 at 25^oС); 50 мМ КСl; 0,1% Triton Х-100; дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ) в концентрации 0,2 мМ каждого; 2,5 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы; олигонуклеотидные праймеры Р3 и Р4 в количестве 20 пикомоль каждого; 0,1 наног кДНК человека; 10 мМ оксалата аммония. Оксалат магния получают смешением 5 микрол 100 мМ раствора хлорида магния и 5 микрол 100 мМ раствора оксалата аммония и добавляют в реакционную смесь.

Синтез фрагмента кДНК гена рибосомального белка L2 митохондрии человека (RPML2) размером 139 п.о. осуществляют с использованием олигонуклеотидных праймеров Р3 (5'-CCAAATTCTTGACGCCCTCGCTAG) и Р4 (5'-CTGAATGTCTCT GGCTTGAAACC). Реакцию проводят в следующем температурном режиме: 94^oС - 30 сек; 58^oС - 30 сек; 72^oС -100 сек, в течение 35 циклов.

После проведения ПЦР продукты реакции подвергают электрофоретическому анализу в геле 1,2% агарозы. Количество синтезированных продуктов реакции определяют денситометрически. Специфичность реакции рассчитывают как отношение количества специфического продукта реакции к общему количеству синтезированной ДНК. Даные о специфичности ПЦР представлены в таблице.

Пример 3 (контрольный по пат. США 5677152)
ПЦР осуществляют, как указано в примере 1, но вместо оксалата аммония и оксалата магния реакционная смесь содержит хлорид магния в концентрации 1,75 мМ и вместо обычной Taq-полимеразы используют обратимо инактивированную Taq-полимеразу.

После проведения ПЦР продукты реакции подвергают электрофоретическому анализу в геле 1,2% агарозы. Количество синтезированных продуктов реакции определяют денситометрически. Специфичность реакции рассчитывают как отношение количества специфического продукта реакции к общему количеству синтезированной ДНК. Даные о специфичности ПЦР представлены в таблице.

Пример 4 (контрольный по пат. США 5677152)
ПЦР осуществляют, как указано в примере 2, но вместо оксалата аммония и оксалата магния реакционная смесь содержит хлорид магния в концентрации 1,75 мМ и вместо обычной Taq-полимеразы используют обратимо инактивированную Taq-полимеразу.

После проведения ПЦР продукты реакции подвергают электрофоретическому анализу в геле 1,2% агарозы. Количество синтезированных продуктов реакции определяют денситометрически. Специфичность реакции расчитывают как отношение количества специфического продукта реакции к общему количеству синтезированной ДНК. Данные о специфичности ПЦР представлены в таблице.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для синтеза, выявления и идентификации ДНК в биологических образцах. Предложен способ ферментативного синтеза ДНК путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием термостабильной ДНК-полимеразы, который осуществляется в присутствии насыщенного раствора малорастворимой соли магния - оксалата магния. Использование оксалата магния позволяет создать оптимальную для синтеза ДНК концентрацию ионов магния только при температурах выше 50-55^oС, что подавляет инициацию синтеза неспецифических последовательностей ДНК. Данный способ обеспечивает высокую специфичность, доступен и прост в реализации. 1 табл.

Способ ферментативного синтеза ДНК путем проведения полимеразной цепной реакции с использованием термостабильной ДНК-полимеразы в присутствии соли магния, отличающийся тем, что реакцию проводят в насыщенном растворе малорастворимой соли магния - оксалата магния.