СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПУРИННУКЛЕОЗИД-ФОСФОРИЛАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pERPUPHO1 И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/pERPUPHO1 ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2002 года по МПК C12P21/02 C12N9/12 C12N15/54 C12N1/21 C12N1/21 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно включает сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК pERPUPHO1, обусловливающую биосинтез пуриннуклеозид-фосфорилазы штамм Е. coli, штамм Е. coli BL21(DE3)/pERPUPHO1 - суперпродуцент пуриннуклеозид-фосфорилазы и способ получения пуриннуклеозид-фосфорилазы на основе вышеуказанной рекомбинантной ДНК и штамма-продуцента для реакции трансгликозилирования при синтезе нуклеозидов.

Пуриннуклеозид-фосфорилаза Escherichia coli (КФ 2.4.2.1) представляет собой белок с мол.м. 24 КДа, функционирующий в виде гексамера с мол.м. 122 КДа [1] и катализирует катаболическую реакцию фосфоролиза пуриновых нуклеозидов в клетках Е. coli [1,2]. Ферментативная активность пуриннуклеозид-фосфорилазы позволяет использовать ее в реакции трансгликозилирования при синтезе модифицированных нуклеозидов, которые находят применение в медицине в качестве терапевтических препаратов [3].

Для практических целей до последнего времени использовали не только изолированную из Е. coli пуриннуклеозид-фосфорилазу, но главным образом ферментативную активность целых бактериальных клеток Е. coli, либо смесь нуклеозид-фосфорилаз из этих клеток без обогащения или разделения [5-12].

Наиболее близким к заявке является способ получения пуриннуклеозид-фосфорилазы из штамма-продуцента Е. coli, полученного при помощи методов микробиологической селекции [4] . Этот способ включает культивирование штамма-продуцента, разрушение клеток в буферном растворе и хроматографическую очистку фермента. Его недостатком является невысокий выход фермента (10-15%).

Настоящее изобретение решает задачу получения высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантную пуриннуклеозид-фосфорилазы с высоким выходом и по упрощенной технологии.

Поставленная задача решается за счет того, что штамм-продуцент, полученный трансформацией клеток Escherichia coli плазмидной ДНК, культивируют до накопления рекомбинантной пуриннуклеозид-фосфорилазы в количестве 60-70% от суммарного белка клеток, разрушают клетки в буферном растворе и отделяют растворимую фракцию. Содержание в этой фракции пуриннуклеозид-фосфорилазы составляет до 80% суммарного содержания белка, и фермент может быть использован без дополнительной очистки или очищен до гомогенного состояния стандартными методами.

Используют штамм-продуцент Escherichia coli BL21(DE3), содержащий плазмидную ДНК pERPUPHO1 - суперпродуцент пуриннуклеозид-фосфорилазы Е. coli.

Используют рекомбинантную плазмидную ДНК pERPUPHO1
- кодирующую аминокислотную последовательность пуриннуклеозид-фосфорилазы Е. coli
- имеющую молекулярную массу 2,90 МДа;
- состоящую из:
NcсI/EcoRI-фрагмента ДНК плазмиды pET23d(+)[14], содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген β-лактамазы, NcoI/EcoRI -фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена пуриннуклеозид-фосфорилазы Escherichia coli,
- содержащую:
в качестве генетического маркера ген β- -лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой клеток Е. coli к пенициллиновым антибиотикам;
уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NcoI: XbaI - 38 п.о., BglII - 96 п.о., PvuII - 741 п.о., BglI - 2163 п.о., PvuI - 2413 п.о., EcoRl - 4389 п.о.

Используют штамм-продуцент Escherichia coli BL21 (DE3), содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pERPUPHO1 - продуцент пуриннуклеозид-фосфорилазы.

Изобретение позволяет получать рекомбинантную пуриннуклеозид-фосфорилазу по простой технологии и с высоким выходом.

Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pERPUPHO1 обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в ней гена пуриннуклеозид-фосфорилазы.

Для конструирования плазмиды использован химический подход, позволяющий использовать для экспрессии клонированного структурного гена оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию.

Источником структурного гена пуриннуклеозид-фосфорилазы служит хромосомная ДНК Е. coli. Рекомбинантный ген выделяют с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами и затем клонируют в векторную плазмиду pET-23d(+) [14].

Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL21(DE3)/pERPUPHO1 характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" - колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или YT-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4 до 40^oC при оптимуме pH от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).

Штамм-продуцент Е. coli BL21(DE3)/pERPUPHO1 отличается от штамма-реципиента Е. coli BL21(DE3) только наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pERPUPHO1, которая и придает ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.

Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток Е. coli BL21(DE3) соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.

Клетки Е.coli BL21(DE3)/pERPUPHO1 являются суперпродуцентом пуриннуклеозид-фосфорилазы. При индукции изопропилтио -β-D-галактозидом, а также и без индукции происходит эффективный биосинтез пуриннуклеозид-фосфорилазы, которая накапливается в клетках в количестве более 60% суммарного белка бактерий.

Штамм-продуцент депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, N ВКПМ В-7888 от 11.01.2000 г.

Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pERPUPHO1, для чего ген пуриннуклеозид-фосфорилазы выделяют из хромосомной ДНК Е. coli с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (см. чертеж), содержащими сайты рестриктаз Ncol(N-конец гена, праймер A1) и SalI(С-конец гена, праймер B1), полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с расщепленной по тем же сайтам векторной плазмидой pET-23d(+) [14].

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки Е. coli BL21(DE3) и высевают на YT-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют гибридизацией ³²P-мечеными олигонуклеотидами A1 и B1 (см. чертеж), и из гибридизующихся клонов выделяют плазмидную ДНК, которую подвергают рестриктному анализу с помощью рестриктаз Ncol и SalI.

Штамм-продуцент Е. coli BL21(DE3)/pERPUPHO1 выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.) (или индуцируют изопропилтио -β- D-галактозидом, и снова выращивают) до достижения максимальной плотности культуры.

Выделение пуриннуклеозид-фосфорилазы из клеток продуцента включает следующие стадии:
- разрушение выращенных клеток при помощи ультразвука;
- отделение растворимой фракции центрифугированием; содержание в этой фракции пуриннуклеозид-фосфорилазы составляет до 80% суммарного содержания белка, и фермент может быть использован без дополнительной очистки;
- из растворимой фракции целевой белок может быть очищен до гомогенного состояния стандартными методами.

На чертеже изображена структура гена пуриннуклеозид- фосфорилазы и синтетических праймеров, использованных для выделения гена с помощью ПЦР и отбора клонов путем гибридизации.

Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pERPUPHO1
Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'- диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O- -(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 А), к которому через 3'- сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл, описанный в работе [13].

Для приготовления вектора ДНК плазмиды pET-23d(+) (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера Y (33 мМ трис-ацетат, pH 7,9, 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат 1, 0,5 мМ DTT, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой Ncol (10 ед.акт.),а затем - в 40 мкл буфура R (10 мМ трис-HCl, pH 8,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ KCl, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой EcoRI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37^oC. Векторный фрагмент величиной 3,6 т.п.о. после электрофореза в 1% агарозном геле электрофоретически перемещают в слой DEAE-бумаги, затем элюируют 1M NaCI и осаждают ДНК из раствора этанолом.

Для приготовления фрагмента гена пуриннуклеозид-фосфорилазы проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК E. coli (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды A1 и B1 (по 60 пмоль каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, содержащем каждый из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед.акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94^oC, отжиг - 30 с при 60^oC, элонгация - 40 с при 72^oC, 30 циклов ПЦР. После этого реакционную смесь депротеинизируют хлороформом, упаривают досуха, остаток растворяют в 20 мкл воды, затем расщепляют теми же рестриктазами, которые использовались при приготовлении вектора, и выделяют целевой фрагмент из агарозного геля.

Полученный синтетический фрагмент с геном пуриннуклеозид-фосфорилазы в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, pH 7,56, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ rАТР, 10 мМ дитиотреит) и лигируют с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10^oC.

Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coli BL21(DE3). Трансформанты высевают на чашки с YT-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью гибридизации колоний in situ с ³²P-меченым олигонуклеотидом A1 (см. чертеж). Из гибридизующихся клонов выделяют ДНК плазмиды pERPUPHO1 и анализируют с помощью эндонуклеаз NcoI и EcoRI.

Пример 2. Получение штамма Е.coli BL21(DE3)/ pERPUPHO1 (ВКПМ В-7888) продуцента пуриннуклеозид-фосфорилазы и определение его продуктивности.

Клетки Е. coli BL21(DE3), несущие плазмиду pERPUPHO1, структура которой подтверждена данными анализа (см. пример 1), являются суперпродуцентом пуриннуклеозид-фосфорилазы.

Штамм продуцента Е. coli BL21(DE3)/pERPUPHO1 выращивают при 37^oC в 100 мл YT-бульона (pH 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А₅₅₀ 0,7-0,8, прибавляют изопропилтио -β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают процесс еще 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А₅₅₀ и количество культуры, соответствующее 1 мл с А₅₅₀ 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим обрабатывают 20 с ультразвуком, нагревают 3 мин при 100^oC и пробы по 1 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют для определения относительного количества белка в полосе целевого белка.

Пример 3. Получение пуриннуклеозид-фосфорилазы.

Влажные клетки (10 г) суспендируют в 20 мл буфера (30 мМ Na- фосфат, pH 7,0, 5% глицерин) и разрушают ультразвуком с помощью ультразвукового дезинтегратора Sonifier 240 (Branson) (3 импульса по 20 сек при А 2,0 и 0^oC). Гомогенат центрифугируют 10 мин при 10000 g и полученный супернатант с содержанием фермента до 80% от суммарного белка используют для реакции трансгликозилирования.

ЛИТЕРАТУРА
1. Jensen K.F., Nygaard P.//Eur. J. Biochem., 1975, v.51. p. 253-265.

2. Kremlitsky T.A., Koszalska G.W., Tuttle J.V., Rideout J.L., Elion G. B. //Carbohydrate Res., 1981, v. 97, p. 139 - 146.

3. Hutchinson D.W. //Trends Biotechnol., 1990, v. 8, p.348- 353.

4. Pal S. , Nair V. // Biocatalysis, a. Biotransform., 1997, v. 15, p. 147-158.

5. Mikhailopulo I.A., Zinchenko A.I., Kozimierszuk Z., Barai V.N., Bokut S.B., Kalinichenko E.N. //Nucleosides a. Nucleotides, 1993, v.l2, p.417-422.

6. Jap. Pat. 5170767, 09.07.93.

7. Jap. Pat. 06217784, 09.08.94.

8. US Pat. 4374315, 31.08.82.

9. Zinchenko A.L, Barai V.N., Bokut S.B., Kvasyuk E.L.Mikhailopulo I.A. //Appl. Microbiol.BiotechnoL, 1990, v.32, p.658-661.

10. Ерошевская Л.А., Барай В.Н., Зинченко А.И., Квасюк Е.И., Михайлопуло И.А.//Антибиот.Мед.Биотехнол., 1986, т.31, с. 174-178.

11. WO Pat. 9421118, 29.09.94.

12. WO Pat. 9507718, 23.03.95.

13. Atkinson Т. , Smith M. //in: Oligonucleotide synthesis; apractical approach. 1984. Ed. Gait M.J. p.35-81. IRL Press, Oxford.

14. Novagen Catalog 1996-1997.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии, и решает задачу получения высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента пуриннуклеозид-фосфорилазы. Рекомбинантная плазмидная ДНК рERPUPHO1, кодирующая аминокислотную последовательность пуриннуклеозид-фосфорилазы Е. coli, состоит из: NcoI/EcoRI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ23d, содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген β-лактамазы, и NcoI/EcoRI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена пуриннуклеозид-фосфорилазы Escherichia coli. Штамм-продуцент Е. coli ВL21(DE3)/рERPUPHO1, полученный трансформацией клеток Е.coli плазмидной ДНК рERPUPHO1, культивируют до накопления рекомбинантной пуриннуклеозид-фосфорилазы в количестве 60-70% от суммарного белка, клетки разрушают ультразвуком в буферном растворе и отделяют растворимую фракцию. Штамм-продуцент Е. coli ВL21(DE3)/рERPUPHO1 выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.) (или индуцируют изопропилтио-β-D-галактозидом, и снова выращивают) до достижения максимальной плотности культуры. Изобретение позволяет получать пуриннуклеозид-фосфорилазу Е.coli с высоким выходом и по упрощенным технологиям. 3 с.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения пуриннуклеозид-фосфорилазы Е. coli, включающий культивирование в богатой среде штамма-продуцента, полученного трансформацией клеток Escherichia coli плазмидной ДНК с последующим разрушением клеток в буферном растворе с помощью ультразвука, отличающийся тем, что в качестве плазмидной ДНК используют специально сконструированную ДНК рERPUPHO1, в качестве штамма-продуцента используют штамм Escherichia coli ВL21 (DE3)/ рERPUPHO1, и отделяют растворимую фракцию, содержащую пуриннуклеозид-фосфорилазу. 2. Рекомбинантная плазмидная ДНК рERPUPHO1, кодирующая аминокислотную последовательность пуриннуклеозид-фосфорилазы Е. coli, имеющая мол. м. 2,90 МДа, состоящая из: NcoI/EcoRI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ23d(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген β-лактамазы, и NcoI/EcoRI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена пуриннуклеозид-фосфорилазы Escherichia coli; содержащая: в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой рERPUPHO1 клеток E. coli к пенициллиновым антибиотикам; уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NcoI : XbaI - 38 п. о. , BglII - 96 п. о. , PvuII - 741 п. о. , BglI - 2163 п. о. , PvuI - 2413 п. о. , EcoRI - 4389 п. о. 3. Штамм Escherichia coli BL21 (DE3), содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК рERPUPHO1, суперпродуцент пуриннуклеозид-фосфорилазы Е. coli (ВКПМ В-7888).