СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ УРИДИН-ФОСФОРИЛАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pERURPHO1 И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL 21(ДЕ3)/pERURPHO1 ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2002 года по МПК C12N15/54 C12N1/21 C12N15/70 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно включает сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК pERURPHO1, обусловливающую биосинтез уридин-фосфорилазы Е. соli, штамм Е. соli BL21(DE3)/pERURPHO1 - суперпродуцент уридин-фосфорилазы и способ получения уридин-фосфорилазы на основе вышеуказанной рекомбинантной ДНК и штамма-продуцента для реакции трансгликозилирования при синтезе нуклеозидов.

Уридин-фосфорилаза Escherichia соli (КФ 2.4.2.3) представляет собой белок с мол. массой 27 Кда, функционирующий в виде гексамера с мол. массой 162 Кда [3] , и катализирует катаболическую реакцию фосфоролиза уридина в клетках Е. соli [1,2] , что позволяет использовать ее в реакции трансгликозилирования при синтезе модифицированных нуклеозидов, которые находят применение в медицине в качестве терапевтических препаратов [4] .

Для практических целей до последнего времени использовали не только изолированную из Е. соli уридин-фосфорилазу, но главным образом ферментативную активность целых бактериальных клеток Е. соli, либо смесь нуклеозид-фосфорилаз из этих клеток без обогащения или разделения [5-8] .

Наиболее близким к заявке является способ получения уридин-фосфорилазы из штамма-продуцента Е. соli, полученного при помощи методов микробиологической селекции [11] . Описано также клонирование гена уридин-фосфорилазы Е. соli в плазмиде pVMK27 [3] и плазмиде pUUDP [10] , однако не приведены данные о продуктивности штамма-продуцента рекомбинантного фермента.

Настоящее изобретение решает задачу получения высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента фермента, рекомбинантной уридин-фосфорилазы с высоким выходом и по упрощенной технологии.

Поставленная задача решается за счет того, что штамм-продуцент, полученный трансформацией клеток Escherichia соli плазмидной ДНК, культивируют до накопления рекомбинантной уридин-фосфорилазы в количестве 60-70% от суммарного белка клеток, разрушают клетки в буферном растворе и отделяют растворимую фракцию. Содержание в этой фракции уридин-фосфорилазы составляет до 80% суммарного содержания белка, и фермент может быть использован без дополнительной очистки или очищен до гомогенного состояния стандартными методами.

Используют штамм-продуцент Escherichia соli BL21(DE3), содержащий плазмидную ДНК pERURPHO1 - суперпродуцент уридин-фосфорилазы.

Используют рекомбинантную плазмидную ДНК pERURPHO1:
- кодирующую аминокислотную последовательность уридин-фосфорилазы Е. соli;
- имеющую молекулярную массу 2,94 МДа;
- состоящую из:
NdeI/SalI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+) [12] , содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген β-лактамазы, и NdeI/SalI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена уридин-фосфорилазы Escherichia coli;
- содержащую:
в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой pERURPHOl клеток Е. соli к пенициллиновым антибиотикам;
уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: XbaI - 38 п. о. , ВglII - 96 п. о. , РvuII - 741 п. о. , РstI - 2288 п. о. , РvuI - 2413 п. о. , SalI - 4389 п. о.

Изобретение позволяет получать рекомбинантную уридин-фосфорилазу с высоким выходом по простой технологии и с высоким выходом.

Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pERURPHOl обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в ней гена уридин-фосфорилазы.

Для конструирования плазмиды использован химический подход, позволяющий использовать для экспрессии клонированного структурного гена оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию.

Источником структурного гена уридин-фосфорилазы служит хромосомная ДНК Е. соli. Рекомбинантный ген выделяют с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами и затем клонируют в векторную плазмиду рЕТ-20b(+).

Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia сoli BL21(DE3)/pERURPHО1 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" - колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или YТ-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4 до 40^oС при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т. д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).

Штамм-продуцент Е. соli BL21(DE3)/pERURPHO1 отличается от штамма-реципиента Е. соli BL21(DE3) только наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pERUPHO1, которая и придает ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам. Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток Е. соli BL21(DE3) соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.

Клетки Е. соli BL21(DE3)/pERURPHO1 являются суперпродуцентом уридин-фосфорилазы. При индукции изопропилтио-β-D-галактозидом, а также и без индукции происходит эффективный биосинтез уридин-фосфорилазы, которая накапливается в клетках в количестве более 60% суммарного белка бактерий.

Штамм-продуцент депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, ВКПМ В-7889 от 11.01.2000 г.

Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pERURPHO1, для чего ген уридин-фосфорилазы выделяют из хромосомной ДНК Е. соli с помощью ПЦР с синтетическими олитонуклеотидными праймерами (см. чертеж), содержащими сайты рестриктаз NdeI (N-конец гена, праймер А2) и SalI (С-конец гена, праймер В2), полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с расщепленной по тем же сайтам векторной плазмидой рЕТ-20b(+) [12] .

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки Е. соli BL21(DE3) и высевают на YТ-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют гибридизацией ³²Р-мечеными олигонуклеотидами А2 и В2 (см. чертеж), и из гибридизующихся клонов выделяют плазмидную ДНК, которую подвергают рестриктному анализу с помощью рестриктаз и BglII. Штамм-продуцент Е. соli BL21(DE3)/pERURPHOl выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др. ) (или индуцируют изопропилтио-β-D-галактозидом, и снова выращивают) до достижения максимальной плотности культуры.

Выделение уридин-фосфорилазы из клеток продуцента включает следующие стадии:
- разрушение выращенных клеток при помощи ультразвука;
- отделение растворимой фракции центрифугированием; содержание в этой фракции уридин-фосфорилазы составляет до 80% суммарного содержания белка, и фермент может быть использован без дополнительной очистки,
- из растворимой фракции целевой белок может быть очищен до гомогенного состояния стандартными методами.

На чертеже изображена структура гена уридин-фосфорилазы и синтетических праймеров, использованных для выделения гена с помощью ПЦР и отбора клонов путем гибридизации.

Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pERURPHО1.

Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'-диметокситритил- N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-О- (β-цианэтилдиизопропиламино)- фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл, описанный в работе [9] .

Для приготовления вектора ДНК плазмиды рЕТ-20b(+) [12] (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера R (10 мМ трис-НСl, рН 8,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ КСl, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой NdeI, а затем - в 40 мкл буфура О (50 мМ трис-НСl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой SalI (10 ед. акт. ) в течение 1 ч при 37^oС. Векторный фрагмент величиной 3,7 т. п. о. после электрофореза в 1% агарозном геле электрофоретически перемещают в слой DEAE-бумаги, затем элюируют 1М NaCl и осаждают ДНК из раствора этанолом.

Для приготовления фрагмента гена уридин-фосфорилазы проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК Е. соli (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А2 и В2 (по 60 пмоль каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, содержащем каждый из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94^oС, отжиг - 30 с при 60^oС, элонгация - 40 с при 72^oС, 30 циклов ПЦР. После этого реакционную смесь депротеинизируют хлороформом, упаривают досуха, остаток растворяют в 20 мкл воды, затем расщепляют теми же рестриктазами, которые использовались при приготовлении вектора, и выделяют целевой фрагмент из агарозного геля.

Полученный синтетический фрагмент с геном уридин-фосфорилазы в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-НСl, рН 7,56, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ rАТР, 10 мМ дитиотреит) и лигируют с помощью 10 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10^oС.

Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. соli BL21(DE3). Трансформанты высевают на чашки с YT-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью гибридизации колоний in situ с ³²Р-меченым олигонуклеотидом А2 (см. чертеж). Из гибридизующихся клонов выделяют ДНК плазмиды pERURPHOl и анализируют с помощью эндонуклеаз NdeI и SalI.

Пример 2. Получение штамма Е. соli BL21(DE3)/pERURPHO1 ( ВКПМ В-7889) - продуцента уридин-фосфорилазы и определение его продуктивности.

Клетки Е. соli BL21(DE3), несущие плазмиду pERURPHOl, структура которой подтверждена данными анализа (см. пример 1), являются суперпродуцентом уридин-фосфорилазы.

Штамм продуцента Е. соli BL21(DE3)/ pERURPHOl выращивают при 37^oС в 100 мл YT-бульона (рН 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А₅₅₀ 0,7-0,8, прибавляют изопропилтио-β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают процесс еще 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А₅₅₀ и количество культуры, соответствующее 1 мл с А₅₅₀ 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим обрабатывают 20 с ультразвуком, нагревают 3 мин при 100^oС и пробы по 1 мкл используют для электрофореза в 15% SPS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют для определения относительного количества белка в полосе целевого белка.

Пример 3. Получение уридин-фосфорилазы.

Влажные клетки (10 г) суспендируют в 20 мл буфера (30 мМ Na-фосфат, рН 7,0, 5% глицерин) и разрушают ультразвуком с помощью ультразвукового дезинтегратора Sonifier 240 (Branson) (3 импульса по 20 с при А 2,0 и 0^oС ). Гомогенат центрифугируют 10 мин при 10000 g и полученный супернатант с содержанием фермента до 80% от суммарного белка используют для реакции трансгликозилирования.

Источники информации
1. O'Donovan G. A. , Neuhard Y. //Bacteriol. Revs. , 1970, v. 34, p. 278.

2. Kremlitsky T. A. , Koszatska G. W. , Tuttle J. V. , Rideout J. L. , Eliot G. B. //Carbohydrate Res. , 1981, v. 97, p. 139-146.

3. Walton L. , Richards C. A. , Elwell L. P. //Nucl. Acids. Res. , 1989, v. l7, p. 6741.

4. Hutchinson D. W. //Trends Biotechnol. , 1990, v. 8, p. 348-353.

5. Mikhailopulo I. A. , Zinchenko A. I. , Kozimierszuk Z. , Barai V. N. , Bokut S. B. , Kalinichenko E. N. //Nucleosides a. Nucleotides, 1993, v. 12, p. 417-422.

6. Jap. Pat. 5170767, 09.07.93.

7. Jap. Pat. 06217784, 09.08.94.

8. US Pat. 4374315, 31.08.82.

9. Atkinson Т. , Smith M. //in: Oligonucleotide synthesis; apractical approach. 1984. Ed Gait M. J. p. 35-81. IRL Press, Oxford.

10. Вейко В. П. , Чеботаев Д. В. , Овчарова Н. В. , Гулько Л. Б. //Биоорган. химия, 1998, т. 24, с. 381-387.

11. Vita A. , Amici A. , Cacciammani Т. , Lanciomtti M. , Magni G. // Int J. Biochem. 1986, v. 18, p. 431-435.

12. Novagen Catalog 1996-1997.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии, и позволяет получать уридин-фосфорилазу Е. coli с высоким выходом (80% суммарного содержания белка) и по упрощенным технологиям. Рекомбинантная плазмидная ДНК рЕRURPHО1, кодирующая аминокислотную последовательность уридин-фосфорилазы Е. coli, состоит из NdeI/SalI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фаза Т7, ген β-лактамазы, и NdeI/SalI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена уридин-фосфорилазы Escherichia coli. Штамм - продуцент Е. coli BL 21(ДЕЗ)/рЕRURPHО1, полученный трансформацией клеток Е. coli плазмидной ДНК рЕRURPHО1, культивируют до накопления рекомбинантной уридин-фосфорилазы в количестве 60-70% от суммарного белка. Клетки разрушают ультразвуком в буферном растворе и отделяют растворимую фракцию. Штамм-продуцент Е. coli BL 21(ДЕЗ)/рЕRURPHО1 выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др. ) (или индуцируют изопропилтио-β-D-галактозидом и снова выращивают) до достижения максимальной плотности культуры. 3 с. п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения уридин-фосфорилазы Е. coli, включающий культивирование в богатой среде штамма-продуцента, полученного трансформацией клеток Escherichia coli плазмидной ДНК с последующим разрушением клеток в буферном растворе с помощью ультразвука, отличающийся тем, что в качестве плазмидной ДНК используют специально сконструированную ДНК рЕRURPHО1, в качестве штамма-продуцента используют штамм Escherichia coli BL 21(DЕ3), а растворимую фракцию отделяют. 2. Рекомбинантная плазмидная ДНК рЕRURPHО1, кодирующая аминокислотную последовательность уридин-фосфорилазы Е. coli, имеющая молекулярную массу 2,94 МДа, состоящая из NdeI/SalI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген β-лактамазы, и NdeI/SalI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена уридин-фосфорилазы Escherichia coli; в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой рЕRURPHО1 клеток Е. coli к пенициллиновым антибиотикам; уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: Xbal - 38 п. о. , BglII - 96 п. о. , PνuII - 741 п. о. , PstI - 2288 п. о. . , PνuI - 2413 п. о. , SalI - 4389 п. о. 3. Штамм Escherichia coli BL21(DE3), содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК рЕRURPHО1, суперпродуцент уридин-фосфорилазы (ВКПМ В-7889).