СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2003 года по МПК A61K9/127 

Изобретение относится к области прикладной биотехнологии, а именно к способам получения липосомальных лекарственных препаратов, которые могут быть использованы в косметологии, фармацевтической промышленности, сельском хозяйстве и других областях народного хозяйства.

Известно несколько способов получения липосомальных препаратов - это методы ультразвуковой обработки дисперсии фосфолипидов, обращения фаз, микроэмульгирования, замораживания-оттаивания, инжекции, экструзии и другие (Ефременко В.И. Липосомы. Ставрополь, 1999 с. 20-59).

Указанные методы предусматривают получение жидких лекарственных форм липосомальных препаратов, основным недостатком которых является их нестабильность в процессе хранения, а также сложность в изготовлении и невозможность получения препаратов в промышленных объемах.

В связи с этим в последнее время разрабатываются методы получения сухих порошкообразных препаратов на основе так называемой пролипосомальной технологии, под которой понимают специальным способом высушенные липидные порошки, которые при добавлении воды образуют суспензии липосом (New RR С. Preparation of liposomes. In: Liposomes, a practical approach, ed.by RR.C. New. Oxford etc. IRZ Press, 1990, p.33-104. Payne N.J., Browning J.A., Hynes C.A. Characterization of proliposomes. J.Pharm. Sci, 1986, v.75, N4, p.330-333).

Прототипом изобретения является способ получения липосомальных препаратов путем смешивания в емкости биологически активного вещества, фосфолипидов, растворителя и порошкообразного наполнителя и последующей отгонки растворителя в условиях вакуума при постоянном перемешивании до получения сухого мелкодисперсного порошка (патент РФ 2130771, кл.А 61 К 9/127, 1998).

Несмотря на несомненные достоинства способа, которые состоят в малостадийности процесса получения липосомальных препаратов и возможности его масштабирования, способ имеет ряд существенных ограничений.

Прежде всего, одновременное растворение липидов и лекарственных веществ в неполярных растворителях, как это предусмотрено в прототипе, возможно только для органических веществ, инертных к воздействию хлороформа, как, например, нуклеиновые кислоты, бета-каротин, рифампицин, амфотерицин, жирорастворимые витамины.

В то же время большинство белковых соединений (ферменты, цитокины и пр.) под воздействием органических растворителей вследствие денатурации белковой молекулы утрачивают свою биологическую активность. Так, при получении липосомальной формы интерферона было показано, что активность препарата, полученного методом обращения фаз, в котором интерферон на определенной стадии процесса контактирует с хлороформом, снижается в 30 раз по сравнению с контролем (Золин В.В. и др.//.Вестн. Акад. мед. Наук, 1993, N2, c. 29-31).

Задачей настоящего изобретения являлось создание способа получения липосомальных белковых препаратов, обеспечивающего сохранность их биологической активности в процессе приготовления.

Сущность изобретения заключается в смешении фосфолипидов, органического растворителя и порошкообразного наполнителя, удалении органического растворителя в условиях вакуума с последующим растворением полученных пролипосом в водном растворе биологически активного вещества (БАВ), подлежащего включению в липосомы, и лиофильной сушке полученной суспензии.

Отличием заявляемого способа от прототипа является введение биологически активного вещества в виде водного раствора после получения сухих пролипосом с последующим их обезвоживанием.

Как правило, концентрация биологически активных веществ в водных растворах составляет от 0,01 до 5,0 мг/мл. Меньшие концентрации экономически неэффективны, при использовании больших концентраций возможно неполное включение БАВ в липосомы.

В качестве фосфолипидов могут быть использованы как индивидуальные фосфолипиды, так и их смеси, полученные из растительного, животного или биотехнологического сырья.

В качестве органических растворителей могут быть использованы хлороформ, метанол, этанол, гексан, эфир, бензол и другие растворители, в которых могут растворяться используемые фосфолипиды. При этом фосфолипиды и растворитель могут вводиться в смесь в виде раствора фосфолипидов в данном растворителе.

В качестве сухих порошкообразных наполнителей могут быть использованы сахара и/или полисахариды (глюкоза, лактоза, декстраны и т.п.), полиолы (сорбит, ксилит и другие), соли (поваренная соль и другие) и другие порошкообразные вещества.

Конкретный состав композиции определяется исходя из требуемых характеристик конечного продукта.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1 (по прототипу). В емкость поместили 3 мг интерферона -2α, 800 мг сорбита и раствор 200 мг яичного лецитина в 200 мл этанола, перемешали и отогнали этанол под вакуумом (0,2 атм) при 37^oС при перемешивании со скоростью 50 об/мин в течение 1 ч.

К 0,1 г высушенного препарата добавили 0,9 мл физиологического раствора и определяли активность интерферона с использованием иммуноферментного анализа (ИФА). Полученные результаты приведены в таблице.

Пример 2. 1,0 г соевого фосфатидилхолина и 9,0 г глюкозы смешивали с 10 мл метанола. Метанол отгоняли в условиях пониженного давления. К высушенному препарату пролипосом (0,1 г) добавили 0,9 мл раствора интерферона - 2α с концентрацией белка 0,1 мг/мл и перемешивали при комнатной температуре; полученную суспензию лиофильно высушивали. К высушенному препарату добавили 1,0 мл физиологического раствора и определяли активность интерферона с использованием ИФА, полученные результаты приведены в таблице.

Пример 3. 1,0 г смеси фосфолипидов и 9,0 г полиглюкина смешивали с 10 мл хлороформа. Хлороформ отгоняли в условиях пониженного давления. К высушенному препарату пролипосом (0,1 г) добавили 0,9 мл интерлейкина-1β с концентрацией белка 0,01 мг/мл и перемешивали при комнатной температуре; полученную суспензию лиофильно высушивали. Затем к высушенному препарату добавили 1,0 мл физиологического раствора и определяли активность интерлейкина-1β с использованием ИФА, полученные результаты приведены в таблице.

Пример 4. 1,0 г смеси фосфолипидов и 9,0 г сорбита смешивали с 10 мл гексана. Гексан отгоняли в условиях пониженного давления. К высушенному препарату пролипосом (0,1 г) добавили 0,9 мл раствора эритропоэтина с концентрацией белка 0,01 мг/мл и перемешивали при комнатной температуре; полученную суспензию лиофильно высушивали, а затем добавляли 1,0 мл физиологического раствора и определяли активность эритропоэтина с использованием ИФА, полученные результаты приведены в таблице.

Пример 5. 1,0 г смеси фосфолипидов и 9,0 г хлористого натрия смешивали с 10 мл хлороформа. Хлороформ отгоняли в условиях пониженного давления. К высушенному препарату добавили 0,9 мл раствора антагониста рецептора интерлейкина-1 (АРИЛ) с концентрацией белка 5 мг/мл и перемешивали при комнатной температуре; полученную суспензию лиофильно высушивали. Затем к препарату добавили 0,2-2,0 мл физиологического раствора и определяли активность АРИЛ с использованием ИФА, полученные результаты приведены в таблице.

Пример 6. К 0,1 г сухих пролипосом, полученных по технологии примера 2, добавили 0,9 мл раствора фермента каталазы с концентрацией белка 5 мг/мл и перемешивали при комнатной температуре; полученную суспензию лиофильно высушили, а затем добавили 1,0 мл физиологического раствора и определяли активность каталазы с помощью молибдата аммония спектрофотометрически, полученные результаты приведены в таблице.

Данные, представленные в примерах, показывают, что предлагаемый способ сохраняет биологическую активность белков, а также ферментов.

Изобретение относится к области прикладной биотехнологии. Проводят получение пролипосом смешиванием фосфолипидов, органического растворителя и наполнителя, осуществляют сушку пролипосом, смешение сухих пролипосом с раствором биологически активного вещества (БАВ) в полярном растворителе и повторную лиофильную сушку. Изобретение позволяет получить липосомальные препараты на основе БАВ, теряющих активность при контакте с органическими растворителями. 4 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения липосомальных препаратов путем получения пролипосом смешиванием фосфолипидов, органического растворителя и наполнителя, введения в пролипосомы биологически активного начала и сушки пролипосом, отличающийся тем, что биологически активное начало вводят в пролипосомы путем смешения сухих пролипосом с раствором биологически активного вещества в полярном растворителе, а сушку пролипосом проводят в два этапа - до и после введения в пролипосомы биологически активного вещества.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве биологически активного вещества используют белковые препараты или ферменты.3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что концентрация биологически активных веществ в водных растворах составляет от 0,01 до 5,0 мг/мл.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве фосфолипидов используют индивидуальные фосфолипиды или их смеси.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве наполнителя используют сахара, и/или полисахариды, и/или полиолы, и/или соли.