ПРЕПАРАТ СПОРОБАКТЕРИН ЖИДКИЙ Российский патент 2003 года по МПК A61K35/66 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, к средствам для профилактики и лечения патологических процессов в медицине и ветеринарии, а именно гнойно-воспалительных заболеваний, гастроэнтеритов и колитов различной этиологии, дисбактериозов, пищевой аллергии.

Исследования современной биологической и медицинской науки в области взаимоотношений макро- и микроорганизмов позволили внедрить в практику биопрепараты - пробиотики. Основу этих препаратов составляют микробные культуры. Пробиотики широко стали использоваться в медицине и ветеринарии для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта, нарушений обмена, после антибактериальной, лучевой, гормональной и химиотерапии в пред- и послеоперационном периодах и т.д. (А.А.Воробьев, С.Г.Пак, 1998). Широко известны препараты колибактерин, бифидумбактерин, бификол, лактобактерин и др. Они используются для лечения дисбактериозов, но обладают относительно небольшим антагонизмом к патогенным бактериям, в связи с чем быстро формируются резистентные штаммы микроорганизмов. Препараты данной группы по этим причинам практически не используются для профилактики и, особенно, для лечения гнойно-воспалительных процессов.

В последние годы в различных странах разрабатываются и используются в медицинской практике пробиотики на основе рода Bacillus (H.M. Грачева с соавт., 1999). Так, в странах Западной Европы широкое распространение получили несколько: препарат "бактисубтил" (фирма "Marion Merrell", Франция) и его аналог "флонивин" (фирма "Галеника", Югославия). В основе препарата - штамм B. cereus IP 5832 из коллекции Института Пастера (Париж). Известен также пробиотик "цереобиоген" ("Xing Jian", Китай), действующее начало которого - штамм B.cereus DM-423. Основой препарата "энтерогермин" (фирма "Sanofi Withrop", Италия) является культура B.subtilis. В составе препарата биоспорина (Украина), выпускаемого в России, два штамма рода Bacillus. Бактерии, входящие в состав препаратов, выделяют антибактериальные вещества широкого спектра действия, протеолитические ферменты. Препараты, содержащие B.cereus (бактисубтил, флонивин, цереобиоген) довольно токсичны и применяются только в гастроэнтерологии. Биоспорин также используется в гинекологии для профилактики хирургичекой инфекции, но к нему устойчив целый ряд микроорганизмов: протей, золотистый стафилококк, дрожжевые грибки и др.

В. И. Никитенко и И. К.Никитенко был разработан препарат споробактерин (Патент СССР 1723116, 1988 г.). Это лиофилизированная культура штамма Bacillus subtilis 534. Споробактерин сухой с 1992 года рекомендован МЗ РФ для использования в клинической практике как для терапии дисбактериозов, так и для профилактики и лечения хирургической инфекции, кишечных инфекций. Споробактерин - это сухая пористая масса, он выпускается в ампулах. Данная форма препарата неудобна для больных. При вскрытии ампулы часто в препарат попадает стекло, тяжело разводить препарат перед употреблением водой, трудно его дозировать. Разведенный препарат должен быть сразу использован и не может храниться, и при назначении его маленьким детям значительная часть просто выбрасывается. Высушивание снижает и лечебно-профилактическую активность препарата. По вышеизложенным причинам более оптимальна жидкая форма препарата. Но бактерии, входящие в состав лекарственных препаратов, в жидких средах быстро погибают даже при использовании питательных бульонов, вырастает вероятность загрязнения посторонними микроорганизмами. Для создания жидкой формы споробактерина необходимо было подобрать раствор состава, позволяющего сохранять жизнеспособность бактерий штамма Bacillus subtilis 534 в течение года и более. В то же время очень желательно, чтобы раствор препятствовал контаминации, убивая посторонние микроорганизмы. При этом он должен быть возможно более простого состава и дешев.

Существенным отличием предложенного препарата является то, что наряду с живыми бактериями и спорами штамма Bacillus subtilis 534, депонированного во Всесоюзной коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР под 1666 D, он содержит 0,5-25% водный раствор натрия хлорида.

Экспериментальными исследованиями установлено, что в растворе натрия хлорида бактерии сенной палочки сохраняют жизнеспособность и даже тенденцию к умеренному росту при комнатной температуре в течение года и более. При хранении при температуре от 0 до 10^oС бактерии сенной палочки остаются жизнеспособными в течение двух лет и более. Препарат без потери активности переносит замораживание. При внесении в препарат посторонних микроорганизмов (дизентерийной палочки, сальмонелл, кишечной палочки, золотистого стафилококка, протея, дрожжевых грибков) посторонние микроорганизмы погибают в препарате в течение 20 минут - 4 часов. По сравнению с лиофилизированным препаратом в жидком возрасла антагонистическая активность к бактериям золотистого стафилококка, протея мирабильного, грибкам рода Candida.

Новый препарат более удобен в применении, хорошо дозируется и сохраняется в открытом флаконе.

При изготовлении споробактерина жидкого бактерии штамма Bacillus subtilis 534 выращивают в термостате при температуре около 37^oС. Их смывают стерильным раствором натрия хлорида, путем добавления раствора устанавливают концентрацию в пределах 10⁷-10¹⁵ живых клеток и спор в 1 литре препарата. Диапазон концентраций натрия хлорида может варьировать от 0,5 до 25%. Препарат разливают во флаконы. Последние закрывают пробками и завальцовывают металлическими колпачками. После контроля качества препарат используют в медицинской и ветеринарной практике.

Впервые подобран состав консерванта, позволяющий создать жидкую форму препарата из бактерий рода Bacillus. Раствор натрия хлорида концентрации 0,5-25% дает возможность сохранять жизнеспособность бактериям сенной палочки при хранении при комнатной температуре в течение года и более, при температуре от 0 до 10^oС - в течение двух лет и более.

Изучение стабильности 10 серий споробактерина жидкого во флаконах проводили при хранении препарата при температуре 0+10^oС (в холодильнике), +18 +35^oС (комнатная температура) сразу после изготовления, через 6 месяцев, через 1 и 2 года. Кроме того, на материалах трех серий определена стабильность споробактерина жидкого во флаконах при замораживании и хранении при температуре (-20±2)^oС в течение месяца. Исследование включало контроль по всем показателям, заложенным в проект ВФС на споробактерин жидкий во флаконах. Препаратом сравнения служил споробактерин сухой в ампулах, изготовленный на НПО "Иммунопрепарат" в г. Уфе. По каждому параметру исследовались по три флакона каждой серии. В течение всего срока наблюдения при хранении в холодильнике при температуре 0+10^oС физические свойства (внешний вид, цвет, запах, вкус) споробактерина жидкого менялись мало. Во всех 120 флаконах содержалась мутная жидкость белесоватого цвета соленого вкуса со специфическим запахом мясо-пептонного агара. При отстаивании образовывался осадок белого цвета, который к двенадцати месяцам хранения слегка темнел и приобретал светло-бежевый оттенок. В последующие сроки хранения цвет осадка менялся незначительно. В двух из десяти серий (8 жидкий и 9 жидкий) легкое потемнение цвета осадка отмечено через шесть месяцев хранения. Осадок разбивался при встряхивании полностью, инородных включений в жидкости не обнаружено. Контаминации посторонними бактериями во всех образцах на всех сроках контроля не наблюдалось. Споробактерин жидкий каждой серии на всех контрольных сроках исследовался на безвредность путем введения через рот 5 белым мышам по одной дозе, все животные остались живыми. Свойства штамма сенной палочки (внешний вид колоний, окраска по Граму, спорообразование, способность к продукции каталазы, ферментации глюкозы без газа, чувствительность к бензилпенициллину, тетрациклину, устойчивость к полимиксину) также не менялись. Нарушений целостности упаковки на всех сроках контроля не выявлено. Количество жизнеспособных бактерий сенной палочки после двух лет хранения в холодильнике оставалось относительно стабильным.

Другие показатели качества (объем, количество доз, концентрация водородных ионов, антагонизм к золотистому стафилококку "Никифоров", золотистому стафилококку "Филиппов", протею мирабилис, кишечной палочке 157) препарата споробактерина жидкого во флаконах всех десяти серий после двух лет хранения при температуре 0+10^oС соответствуют требованиям, заложенным в проекте фармакопейной статьи. Все изученные параметры близки к показателям качества споробактерина сухого в ампулах.

Показатели качества препарата споробактерина жидкого во флаконах всех десяти серий после двух лет хранения при комнатной температуре (+18+35^oС) оставались стабильными в течение года и более. Споробактерин жидкий без потери активности переносит неоднократное замораживание.

Споробактерин жидкий устойчив к загрязнению посторонней микрофлофой. При внесении в препарат посторонних микроорганизмов в количестве 10 млн. клеток на мл препарата (дизентерийной палочки, сальмонелл, кишечной палочки, золотистого стафилококка, протея, дрожжевых грибков) посторонние микроорганизмы перестают высеваться из препарата через 20 минут - 4 часа. По сравнению с прототипом увеличивается и антагонистическая активность препарата. Эти данные приведены в таблице. В опытах in vitro антагонистическая активность по отношению к тест-штаммам споробактерина жидкого в 1,2-1,7 раза выше чем у споробактерина сухого.

Споробактерин жидкий более удобен при использовании больными. Он готов к употреблению, его не надо разводить, как сухой. Споробактерин жидкий легче дозируется, в него не попадает стекло. Последнее часто случается при использовании споробактерина сухого в ампулах.

Для иллюстрации приводим следующие примеры.

Пример 1.

Приготовлен препарат споробактерин жидкий следующего состава:
штамм Bacillus subtilis 534 - 10¹² живых клеток и спор
натрия хлорида - 70 г
воды дистиллированной - до одного литра
Является одной из наиболее оптимальных форм, промышленным способом будет выпускаться споробактерин жидкий с содержанием сенной палочки числом от 1•10¹² до 5•10¹² живых клеток и спор в одном литре 7% раствора натрия хлорида.

Пример 2.

Приготовлен препарат споробактерин жидкий следующего состава:
- штамм Bacillus subtilis 534 - 10⁷ живых клеток и спор
- натрия хлорида - 70 г
- воды дистиллированной - до одного литра
Уменьшение количества сенной палочки умерено снижает лечебную эффективность споробактерина жидкого.

Пример 3.

Приготовлен препарат споробактерин жидкий следующего состава:
- штамм Bacillus subtilis 534 - 10⁶ живых клеток и спор
- натрия хлорида - 70 г
- воды дистиллированной - до одного литра
Препарат данного состава обладает низкой клинической эффективностью и не может быть использован в лечебной практике.

Пример 4.

Приготовлен препарат споробактерин жидкий следующего состава:
- штамм Bacillus subtilis 534 - 10¹² живых клеток и спор
- натрия хлорида - 5 г
- воды дистиллированной - до одного литра
Умеренно снижается устойчивость споробактерина жидкого к загрязнению посторонней микрофлорой.

Пример 5.

Приготовлен препарат споробактерин жидкий следующего состава:
- штамм Bacillus subtilis 534 - 10¹² живых клеток и спор
- натрия хлорида - 4,5 г
- воды дистиллированной - до одного литра
При таком составе отмечается быстрая гибель бактерий сенной палочки при хранении, кроме того, препарат легко загрязняется посторонней микрофлорой.

Пример 6.

Приготовлен препарат споробактерин жидкий следующего состава:
- штамм Bacillus subtilis 534 - 10¹² живых клеток и спор
- натрия хлорида - 250 г
- воды дистиллированной - до одного литра
Возрастает устойчивость препарата к загрязнению посторонней микрофлорой, но увеличивается солевая нагрузка для больных. Получение раствора поваренной соли более 25% практически невозможно.

Пример 7.

Приготовлен препарат споробактерин жидкий следующего состава:
- штамм Bacillus subtilis 534 - 10¹² живых клеток и спор
- натрия хлорида - 9 г
- воды дистиллированной - до одного литра
При контроле на среде Сабуро обнаружен грибок, что привело к выбраковке всей серии препарата.

Пример 8.

Приготовлен препарат споробактерин жидкий следующего состава:
- штамм Bacillus subtilis 534 - 10¹⁵ живых клеток и спор
- натрия хлорида - 20 г
- воды дистиллированной - до одного литра
В препарат внесено 10 млн живых клеток кишечной палочки. Через 3,5 часа произведен контроль. Жизнеспособные кишечные палочки обнаружены на среде Эндо. У препарата появился неприятный запах.

Пример 9.

Приготовлен препарат споробактерин жидкий следующего состава:
- штамм Bacillus subtilis 534 - 10¹⁵ живых клеток и спор
- натрия хлорида - 30 г
- воды дистиллированной - до одного литра
В препарат внесено 10 млн живых клеток кишечной палочки. Через 20 минут произведен контроль. Жизнеспособные кишечные палочки на среде Эндо не обнаружены. Эффект предупреждения загрязнения споробактерина жидкого посторонней микрофлорой начинает отмечаться при концентрации натрия хлорида 3% и более.

С целью профилактики хирургической инфекции споробактерин жидкий назначался 20 больным через рот по 1 дозе (15-20 капель) 2 раза в день в течение 5-10 суток. 20 больным контрольной группы с этой целью были назначены на те же сроки вводимые внутримышечно и внутривенно современные антибиотики (цефалоспоринового ряда, полусинтетические пенициллины и др.).

При профилактическом приеме споробактерина после операций остеосинтеза конечностей у 20 больных нагноений ран не отмечено. В то же время у пострадавших, получавших в послеоперационном периоде антибиотики, нагноения зарегистрированы у 2 из 20. Непереносимости споробактерина жидкого и других лекарственных препаратов у больных опытной и контрольной групп не наблюдалось.

Для лечения хирургической инфекции споробактерин жидкий по 1 дозе 2 раза в сутки в течение 7-20 дней вместо антибиотиков через рот назначался 10 больным с гнойными ранами мягких тканей и 10 больным с острым или обострением хронического остеомиелита. 20 пациентов контрольной группы (10 - с гнойными ранами мягких тканей и 10 - с остеомиелитом) получали вводимые внутримышечно и внутривенно современные антибиотики (цефалоспоринового ряда, линкомицин, тиенам, полусинтетические пенициллины и др. ). Хирургическое лечение (вторичная хирургическая обработка, секвестрнекрэктомия, дренирование и пр. ), перевязки, дезинтоксикация, стимулирующая терапия проводились по показаниям и в обеих группах не отличались от методов, принятых в клинике.

Заживление гнойных ран или значительное улучшение (стихание воспалительного процесса, очищение от некротизированных тканей, активная эпителизация, нормализация температуры тела и др.) за время наблюдения отмечено у 16 из 20 больных (80%). 4 больным из-за отсутствия положительной динамики были назначены антибиотики. В те же сроки заживление ран или значительное улучшение течения нагноительного процесса зарегистрированы у 9 из 20 больных, получавших антибиотики (45%, р<0,05). Из-за неэффективности лечения или обострения неоднократно менять антибиотики пришлось у 11 пациентов.

Анализы кала у больных с гнойно-воспалительными процессами до лечения показали наличие дисбактериоза у всех 22 обследованных пострадавших. Дисбактериоз I-II степени был у 15 (68,2%), III-IV степени - у 7 больных (31,8%). Выраженные изменения в лучшую сторону состава микрофлоры толстого кишечника (исчезновение, уменьшение количества патогенных и условно-патогенных бактерий, нормализация или увеличение числа бифидобактерий, кишечной палочки) отмечены у 8 из 11 больных, получавших споробактерин. Подобная динамика состава микрофлоры кишечника зарегистрирована только у 2 из 11 обследованных, которым назначались антибиотики. Напротив, у 6 больных явления дисбактериоза усилились.

Для лечения дисбактериозов споробактерин жидкий назначался через рот по одной дозе 2 раза в сутки в течение 15-20 дней 21 взрослому (старше 16 лет) пациенту. 11 детям в возрасте от 0,5 до 5 лет споробактерин жидкий назначался по 0,5 дозы 2 раза в сутки в течение 15-20 дней, а еще 9 более старшим детям - по 1 дозе 2 раза в сутки в течение 15-20 дней. Из анамнеза было известно, что у 4 взрослых больных имелись явления пищевой и лекарственной аллергии, одна пациентка страдала бронхиальной астмой. У 6 детей имелись проявления экссудативного диатеза или детской экземы. У 27 больных имелись умеренные нарушения функции желудочно-кишечного тракта: периодические боли в животе, жидкий стул, запоры, метеоризм и др. 29 человек ранее лечились различными живыми бактериальными препаратами: бифидумбактерином, колибактерином, бификолом, лактобактерином, бактисубтилом или фловинилом.

После проведения курса лечения споробактерином жидким из 27 больных диспептические явления исчезли у 16, значительно уменьшились у 11. В процессе терапии у одного ребенка было легкое обострение детской экземы, которое купировано десенсибилизирующими средствами без отмены споробактерина. В то же время у 2 детей явления экссудативного диатеза исчезли, а еще у 3 с детской экземой значительно уменьшились зуд и количество высыпаний. Других проявлений непереносимости и отрицательного влияния на организм больного в процессе и после лечения споробактерином жидким не отмечено.

Полное излечение дисбактериоза достигнуто у 13 пациентов. Выраженные изменения в лучшую сторону состава микрофлоры толстого кишечника (исчезновение, уменьшение количества патогенных и условно-патогенных бактерий, нормализация или увеличение числа бифидобактерий, кишечной палочки, лактобацилл) отмечены у 28 больных.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Воробьев А. А., Пак С.Г. Дисбактериозы у детей. Учебное пособие для врачей и студентов. Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова, М., 1998, 60 с.

2. Грачева Н.М., Чупрынина Р.П., Мацулевич Т.В. и др. Дифференцированное применение биологических бактерийных препаратов (пробиотиков) при острых кишечных инфекциях вирусно-бактериальной природы в современных условиях. (Пособие для врачей). М., 1999, 24 с.

3. Никитенко В.И., Никитенко И.К. Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для получения препарата для профилактики и лечения воспалительных процессов и аллергических заболеваний. Описание изобретения к патенту SU 1723116 А1. СССР, 1988.

Изобретение относится к биотехнологии, к средствам для профилактики и лечения патологических процессов в медицине и ветеринарии, а именно гнойно-воспалительных заболеваний, гастроэнтеритов и колитов различной этиологии, дисбактериозов, пищевой аллергии. Один литр споробактерина жидкого содержит жизнеспособные клетки штамма Bacillus subtilis 534, депонированного во Всесоюзной коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР под 1666 D, 10⁷-10¹⁵ КОЕ/мл, натрия хлорида 30-250 г, воды дистиллированной - до одного литра. В растворе натрия хлорида бактерии сенной палочки сохраняют жизнеспособность и даже тенденцию к умеренному росту. Кроме того, такой состав препарата препятствует загрязнению посторонней микрофлорой, повышает лечебную эффективность. Жидкая форма споробактерина более удобна в применении. 1 табл.

Препарат споробактерин, отличающийся тем, что он содержит жизнеспособные клетки штамма Bacillus subtilis ВКМ 1666 D в концентрации 10⁷-10¹⁵ КОЕ/мл, натрия хлорид 30-250 г, воду дистиллированную - до 1 л.