ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИСЦЕРАЛЬНЫХ МИКОЗОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ГРИБОМ РОДА MUCOR RACEMOSUS Российский патент 2006 года по МПК A61K39/00 C12N1/14 A61P31/10 C12R1/645 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано для получения вакцин против висцеральных микозов сельскохозяйственных животных, в частности - мукороза.

Мукороз (мукоромикоз, фикомикоз) - инфекционное заболевание сельскохозяйственных животных, характеризующееся развитием гранулематозного процесса в мезентериальных и подчелюстных лимфатических узлах, а также в печени, почках, легких. У молодняка заболевание протекает с образованием язв, инфарктов и инфильтратов в слизистых оболочках желудка и кишечника. Болеет и человек.

Известна вакцина против дерматомикозов (дерматофитозов) (см. а.с. СССР №1734762, опуб. 23.05.92 г.), содержащая инактивированные микроконидии вирулентных грибов T. mentagrophytes, M. canis и М. mentagrophytes в соотношении 600 млн. - 1 млрд. в 1 см³ (1:1:1) - 25-26%, 0,5-0,6% раствор формалина - 25-26%, 0,8-0,9% раствор нуклеината натрия - 48-50%. Вакцину вводят внутримышечно двукратно с интервалом 10-14 дней в дозе 0,9-1,2 см³.

Однако данная вакцина предназначена для профилактики только дерматомикозов (трихофитии и микроспории). Кроме того, вакцина имеет в своем составе иммуномодулятор - нуклеинат натрия, воздействие которого на иммунокомпетентные клетки может быть негативным.

Известна вакцина Поливак-ТМ для профилактики и лечения дерматофитозов животных (см. патент РФ №2020959, опуб. 15.10.94 г.), содержащая 8 различных штаммов возбудителей трихофитии и микроспории, с концентрацией микроконидий 40-120 млн./см³ и инактивированная тиомерсалом.

Однако вакцина создает иммунитет только к возбудителям дерматомикозов. Кроме того, инактиватор тиосмерсал обладает токсическими свойствами для животных.

Известна также вакцина против кандидоза сельскохозяйственных животных (см. патент РФ №2217163, опуб. 27.11.2003), содержащая растворимый антиген из штамма С. albicans №253 с активностью спор 4,5×10⁸ - 5,5×10⁸ в 1 см и индексом агломерации лейкоцитов 6-10%.

Однако данная вакцина формирует только противокандидозный иммунитет и не может быть использована для специфической профилактики мукороза животных.

Наиболее близкой к заявляемой является вакцина против аспергиллеза сельскохозяйственных животных (см. патент РФ №2230567, опуб. 20.06.2004), содержащая адъювант и растворимый антиген на основе клеточных мембран в виде цитоплазмотической фракции гриба из штамма А. fumigatus №6 с активностью спор 2,5×10⁸ - 3,0×10⁸ в 1 см³, индексом агломерации лейкоцитов 6-16% при следующем соотношении компонентов (мас.%): адьювант 9-10, антиген - остальное.

Однако данная вакцина обеспечивает только противоаспергиллезный иммунитет.

Изобретение направлено на решение задачи создания эффективной, безопасной и дешевой вакцины против мукороза сельскохозяйственных животных, обладающей высокоиммуногенными и низкоаллергогенными свойствами.

Для решения поставленной задачи вакцина против висцеральных микозов, содержащая адъювант и растворимый антиген на основе клеточных мембран в виде цитоплазматической фракции гриба из штамма с индексом агломерации лейкоцитов 6-15% при соотношении адъюванта к антигену, как 1/9 - 1/10:1, согласно изобретению содержит в качестве штамма гриба штамм рода Mucor racemosus №195 с активностью спор 5·10⁵ - 6·10⁵ в 1 см³, а антиген дополнительно содержит эндотоксин клеточной стенки.

Биохимический состав антигена представлен: белки с молекулярной массой (М.м.) 75-50 КД, с незначительным количеством - 25 КД, полипептиды, в основном, с М.м. <1,5 КД - 17, мг %; углеводная часть, в основном, представлена полисахаридами - 76 мг %; общее содержание липидов - 2,05%. Липиды, в основном, представлены олеиновой кислотой - 76,2%.

Авторам неизвестны информационные источники как патентной, так и научно-технической информации, в которых было бы дано описание вакцин против мукороза, причем не только для сельскохозяйственных животных, но и для человека. Отсутствие таких источников позволяет сделать вывод о наличии новизны в заявляемом решении. Авторами заявляемого решения разработаны вакцины против таких висцеральных микозов, как аспергиллез и кандидоз сельскохозяйственных животных. Неизвестность использования в составе вакцины против мукороза растворимого антигена в виде эндотоксина и цитоплазматической фракции гриба из штамма Mucor racemosus №195 позволяет сделать вывод о наличии «изобретательского уровня».

Подобранные экспериментальным путем соотношения компонентов вакцины обеспечивают ее высокоиммуногенные и низкоаллергогенные свойства.

Штамм M. racemosus №195, предназначенный для изготовления вакцины, характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки.

Рост гриба после инкубирования при 37°С на пластинчатом агаре Сабуро появляется через 24 часа в виде беловатого пушистого налета. Через 72 часа формируется объемная пушистая колония с мощным, хорошо развитым мицелием сероватого цвета. В бульоне Сабуро к 3 суткам культивирования в пробирках отмечается поверхностный рост культуры в виде плотных «войлочных» дисков с развитым мицелием и с одновременным образованием ватоподобного осадка.

При микроскопировании (с фиксацией в 10% КОН или в 50% глицерине) гриб представлен несептированным мицелием, имеющим различную ширину (до 20 мкм) на протяжении нити, древовидно ветвящийся. Обнаруживается при увеличении микроскопа (×7). Спорангиеносцы прямолинейные, спорангии шаровидные, не имеющие апофизы.

Токсинообразование происходит на бульоне Сабуро и средах, изготовленных по патенту Саратовской НИВС №2093569 (опуб. 20.10.97 г.) и содержащих, мас.%: глюкозу 4-5, гидролизат лактальбумина 0,45-0,55, сыворотку крови крупного рогатого скота 9,0-11,0, пептон 0,95-1,05, агар 3,5-3,6, солевой раствор Хенкса - остальное.

Продукт, синтезируемый штаммом - в основном, комплекс белков, полисахаридов, пептидогликанов, обладающих антигенными свойствами.

К 9-12 суткам культивирования количество спор в питательном бульоне составляет 5·10⁵ - 6·10⁵ спор в 1 см³.

Чувствительность к антимикробным препаратам.

Зона задержки роста дисками, пропитанными амфотерицином - 9 мм; нистатином - 21 мм; клотримазолом - 27 мм; 0,01% раствором тимерсала - 20 мм; 5% раствором препарата «А-24» - 26 мм; 0,03% раствором AgNO₃ - 14 мм.

Вирулентные свойства.

Внутрибрюшинное введение 3-х суточной культуры в объеме 0,5 мл и концентрации спор 1·10⁷ в см³ гибели белых мышей не вызывает; LД₅₀ - 5·10⁷ спор/см³, LД₁₀₀ - 1·10⁸ спор/см³ (гибель на 4-5 сутки). Внутривенное заражение белых крыс в объеме 1 мл и концентрации спор от 1·10⁶ до 1·10⁷ в см³ вызывает гибель на 3 сутки, в дозе 7·10⁷ в см³ - на 2 сутки у 100% животных.

Штамм относится к III группе патогенности - условно патогенный.

Штамм Mucor racemosus №195 поддерживается методом периодических пересевов на искусственных питательных средах по признаку спорообразования и культурально-морфологическим свойствам. В работе со штаммом мутагены не использовались.

Пассажирования на животных не требуется.

Штамм Mucor racemosus №195 хранят на агаре Сабуро в течение не более 20-30 суток, с последующим пересевом вначале на бульон Сабуро, а затем на агар Сабуро. Оптимальный способ хранения штамма - в ампулах в лиофилизированном состоянии при температуре 4°С до 1 года.

Способ, условия и состав среды для размножения штамма - бульон и агар Сабуро. Культивирование осуществляется при температуре 26-37°С.

Для получения антигенов штамма Mucor racemosus №195, представляющих собой клеточные мембраны (эндотоксин и цитоплазматическую фракцию гриба), используют метод ультразвуковой дезинтеграции микроорганизмов с помощью аппаратов типа У.Ф.А. - 11 (Польша), «Solana» (Erlan industries) или малогабаритным лабораторным дезинтегратором (МЛ-1) производства НПО «Биоприбор» АН СССР.

Для этого из авирулентного штамма Mucor racemosus №195 через определенные промежутки культивирования отбирают пробы. Пробы разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5, после чего смесь подвергают воздействию ультразвукового дезинтегратора в течение 2 минут, получая таким образом антигены гриба.

Освобождение от разрушенных и не разрушенных клеток проводят методом фильтрации через мембрану «Владипор» МФА - МА №3.

Отбор иммуногенной стадии антигенов проводят с использованием реакции агломерации лейкоцитов (РАЛ) по способу, описанному в патенте РФ №2176392, в соответствии с которым антигены смешивают с комплементом морской свинки, добавляют стабилизированную кровь кролика, смесь инкубируют, готовят мазки, подсчитывают фиксированное количество лейкоцитов и отмечают число агломерированных клеток белой крови. По величине индекса агломерации оценивают пригодность полученных антигенов для создания вакцины. Экспериментальным путем была подобрана величина индекса агломерации лейкоцитов, при которой антиген считается иммуногенным. Для антигенов штамма Mucor racemosus №195 в виде цитоплазматической фракции и эндотоксина величина индекса агломерации составляет 6-15%.

К выявленным вышеописанным методом растворимым антигенам с индексом агломерации лейкоцитов 6-15% добавляют для обезвреживания и повышения иммуногенных свойств формалин 0,3-0,4%-ной концентрации. После чего в полученный комплекс добавляют для повышения синтеза антител и замедления всасывания антигенов адъювант (например, 6%-ный раствор гидроокиси алюминия, неполный масляный адъвант Фрейнда, сапонин) в соотношении 10:1.

Антигенный комплекс помещают в термостат и инкубируют при температуре 37°С в течение 21 суток.

Проверку вакцины на стерильность и безвредность проводят общепринятыми методами, а оценку иммуногенных свойств - на лабораторных животных.

Пример 1. Способ изготовления вакцины против мукороза сельскохозяйственных животных заключается в следующем.

1. Выделяют из штамма Mucor racemosus №195 культуру клеток микроорганизма с активностью спор 5·10⁵ - 6·10⁵ в 1 см³.

Для этого штамм Mucor racemosus №195 засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 37°С в течение 3 суток. Количество пробирок зависит от объема питательной среды, в которую в дальнейшем будет внесен посевной материал штамма из расчета 1 пробирка на 1 литр среды. Выросшую культуру смывают стерильным физиологическим раствором, высевают в бактериологические бутыли с питательным бульоном с использованием солевого раствора Хенкса по патенту РФ №2093569. Проводят культивирование в термостате при 37°С в течение 9-12 суток. В полученной культуре определяют концентрацию спор методом подсчета в камере Горяева с использованием фазоконтрастного устройства. Урожай спор обычно колеблется в пределах от 5·10⁵ до 6·10⁵ спор/см³.

2. Выделяют цитоплазматическую фракцию и эндотоксин полученной суспензии клеток, используя метод разрушения клеточных мембран микроорганизмов с помощью ультразвукового дезинтегратора «Solana» (Erlan industries). Воздействие дезинтегратором осуществляют в течение 10 минут. Освобождение от разрушенных и не разрушенных клеток проводят методом фильтрации через мембрану «Владипор» МФА

- МА №3 при помощи вакуум-насоса. Полученный фильтрат представляет собой комплекс липополисахаридных и токсических антигенов.

3. Производят оценку полученных растворимых антигенов на иммуногенность и выявляют антигены с индексом агломерации лейкоцитов 6-15%.

Для этого фильтрат разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5. В пробирки вносят по 0,04 мл полученной смеси и туда же добавляют по 0,02 мл комплемента морской свинки. Смесь выдерживают 30 минут при 37°С, затем вносят по 0,2 мл цитратной крови кролика-донора. При этом контролем служат пробирки с антигеном, изотоническим раствором хлорида натрия вместо комплемента и стабилизированной кровью кролика. Другим контролем служили пробирки с стабилизированной кровью кролика, комплементом морской свинки и изотоническим раствором хлорида натрия вместо антигена. Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют при 37°С в течение 45 минут.

Смесь из пробирок наносят на предметные стекла и делают мазки, которые подсушивают и затем фиксируют метиловым спиртом в течение 20 минут. Окраску мазков проводят 0,1% раствором метиленовой сини в течение 5 минут.

Окрашенные мазки просматривают под микроскопом при увеличении ×450. Для анализа выбирают 100 лейкоцитов и выявляют среди них число агломерированных (склеенных не менее 3-х). При наличии склеенных (агломерированных) лейкоцитов от 6 до 15% от общего числа лейкоцитов - 100 антигены считаются наиболее иммуногенными и соответственно пригодными для конструирования вакцины против аспергиллеза.

4. К растворимым антигенам с индексом агломерации лейкоцитов 6-15% добавляют формалин 0,3-0,4%-ной концентрации.

5. В полученный комплекс добавляют адъювант - 6%-ный раствор гидроокиси алюминия в соотношении комплекс:адъювант как 10:1.

6. Комплекс антиген - адъювант помещают в термостат и инкубируют при температуре 37°С в течение 21 суток.

Пример 2. Оценка иммуногенных свойств вакцины.

Вакцину вводят кроликам внутримышечно в дозе 1,5 мл двукратно с 8-10 дневным интервалом. Напряженный иммунитет наступает через 14 дней после ревакцинации.

Учитывая, что при мукорозе животных поражаются, в основном, органы пищеварительного тракта, так как в естественных условиях возбудитель проникает в организм алиментарным путем, оценку напряженности иммунитета проводят с использованием перорального способа заражения кроликов, вакцинированных по описанной выше схеме. Для этого с помощью интрагастрального зонда вводят в желудок кроликов культуру вирулентного штамма M. racemosus с концентрацией возбудителя 1,0·10⁶ спор/см³ и объеме вводимой суспензии клеток гриба - 10 см³.

У вакцинированных животных клинические симптомы заболевания отсутствуют. У невакцинированных животных клинические признаки заболевания (отказ от корма, расстройство пищеварения, явления угнетения нервной системы) проявляются через 3-4 суток после заражения. Гибель интактных кроликов наступает через 3-6 суток после появления первых клинических признаков болезни. Результаты испытаний представлены в таблице.

Таблица
Профилактические действие вакцины при экспериментальном мукорозе.Группы кроликовКоличество голов в группеВыжили после заражения (голов)Пало после заражения (голов)Подвергнутые иммунизации вакциной1082Интактные505

Для серологической оценки гуморального иммунитета используют реакцию преципитации (РП). Титр специфических антител в РП составляет 1:16.

Вакцина была испытана на крупном рогатом скоте и свиньях.

С целью получения противомукорозного иммунитета вакцину вводят дважды с интервалом 8-10 дней внутримышечно телятам в дозе 3 мл на одно введение с 1-2-х месячного возраста, а поросятам - в дозе 1 мл с месячного возраста.

Вакцина опробирована в условиях хозяйств, неблагополучных по мукорозу телят и поросят. У животных до применения вакцины отмечали клинические и патологоанатомические признаки заболевания. Лабораторными исследованиями диагноз на мукороз был подтвержден выделением возбудителя. После проведения двукратной иммунизации в указанных выше дозах клинические признаки заболевания у вакцинированных животных не регистрировались.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Вакцина содержит антиген и адъювант при соотношении, равном 10:1. При этом в качестве антигена вакцина содержит комплекс цитоплазматической фракции и эндотоксина клеточной стенки штамма гриба Mucor racemosus N 195 с активностью спор 5·10⁵-6·10⁵ в 1 см³ и индексом агломерации лейкоцитов 6-15%. Вакцина эффективна, безопасна, обладает высокой иммуногенностью. 1 табл.

Вакцина против висцеральных микозов, содержащая антиген из штамма гриба и адъювант, отличающаяся тем, что в качестве антигена вакцина содержит комплекс цитоплазматической фракции и эндотоксина клеточной стенки штамма гриба Mucor racemosus N 195 с активностью спор 5·10⁵÷6·10⁵ в 1 см³, индексом агломерации лейкоцитов 6-15% при соотношении антигена к адъюванту, равном 10:1.